Name: 高スループット アッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 学ぶ 高スループットアッセイによる好中球細胞外トラップ（NET）形成の三次元免疫蛍光共焦点顕微鏡を用いた定量化法。自己免疫疾患患者のNET動態評価と治療標的創薬スクリーニングに応用可能です。

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Eline j. 場合は Arends と社長交代 Onno 登の作品は、オランダの腎臓財団 (17OKG04)、科学研究 (90713460) のオランダの組織から臨床の交わりによってサポートされます。ローラ s. ヴァン ・ ダムの仕事は、リウマチ学 (FOREUM) の研究のための基礎によってサポートされます。

すべての患者と健常者は、LUMC バイオバンクに参加に同意しました。両方の biobanking の研究は、LUMC 倫理委員会で承認されました。
1. 健康的な好中球の隔離
<ol><li>2 つの 10 mL EDTA 被覆管の健康なドナーから末梢血 20 mL を取得します。</li>
	<li>滅菌 50 mL のチューブに血液の 10 mL を入れ、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を追加 32.5 mL。</li>
	<li>
セルの下で密度勾配 (例えば.、Ficoll amidotrizoaat) を追加します。
	<ol>
<li>10 mL のピペット ピペット コント ローラーとグラデーション密度 14 mL をとる。</li>
		<li>50 mL チューブの底に、ピペットを配置します。</li>
		<li>ピペットから重力によって流れる、毛細管現象によって最大値に到達するまでに密度勾配を許可するオフ、ピペット ピペット コント ローラー (1-2 の mL がままあります)、モーターを使用せず。</li>
		<li>ピペット、ピペットの削除時に漏れてから防ぐ密度勾配の上に親指を置くことによってピペットを削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>912 × g室温 (RT) 加速やブレーキなしで 20 分の管をスピンします。 注:赤い血球 (RBC)、好中球、高密度を持ち、50 mL のチューブの下部に。末梢血単核球 (PBMCs)、分離密度勾配の上に白色のリングとして。上記、PBMCs PBS 希薄プラズマになります。必要に応じて、PBMCs がホワイト リングを PBS で追加の洗浄のステップと新しい 50 mL チューブに移すことによって分離できます。</li>
	<li>PBS 希薄プラズマと最後に可能な限り、密度勾配層の除去が続く最初、PBMCs を含むホワイト リングを慎重に取り外します。</li>
	<li>
好中球好中球/赤血球ミックスからを分離するには、冷滅菌水で赤血球を溶解させます。
	<ol>
<li>冷滅菌蒸留水の水のボトルを取るし、10 倍濃縮冷蔵庫から PBS フラスコ。</li>
		<li>すぐにこのステップの作業。36 mL のペレットの上に直接冷滅菌蒸留水を追加し、一度慎重に混ぜます。20 後 10 x PBS の 4 つの mL を追加する等張液 s。一度慎重に混ぜます。</li>
		<li>(赤血球の除去) のための 4 ° C 739 x gで 5 分の管をスピンします。好中球は、白のペレットになります。</li>
		<li>上澄みを慎重に廃棄します。1.6.2 の手順をもう一度実行し、ペレットが正常に中断されているかどうかを確認します。</li>
		<li>328 × gで 5 分間、4 ° C のチューブをスピンします。</li>
		<li>慎重に上澄みを除去し、5 mL の PBS でペレットを再懸濁します。好中球をカウントし、氷の上にそれらを保ちます。 注:血液 10 mL 1 管から利回りは約 1500 万好中球です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 赤い蛍光細胞が好中球のラベリング
<ol><li>15 mL チューブに 2 mL の PBS で 1000 万好中球好中球の懸濁液を作る。</li>
	<li>2 μ M 赤色の蛍光細胞リンカーの 4 μ L で 2 mL の PBS 溶液を作ります (材料表参照) 別 15 mL チューブに。好中球の懸濁液にそっとこれを追加し、慎重に混ぜます。</li>
	<li>暗闇のなかで赤色蛍光細胞リンカーと好中球のラベルに 37 ° C で正確 25 分間インキュベートします。</li>
	<li>一度慎重に不活性、ラベリング RPMI 1640 培 10% 熱不活化牛胎児血清 (FCS) を追加することによって RT で最大 15 mL とミックス。ペレットは、ペレットが形成されている場合慎重に再停止されることを確認します。</li>
	<li>328 x gおよび RT で 5 分間チューブをスピンします。</li>
	<li>上澄みを除去し、フェノールレッド フリー RPMI 1640 5 mL にペレットを再懸濁します 10% と 2% の FCS を含む中室温 P/S カウント好中球。 注:50% の細胞の損失は、赤い蛍光細胞ラベリング後発生します。</li>
</ol>3. 好中球細胞外トラップ形成の誘導
<ol><li>無料 RPMI 1640 媒体含む 2% の FCS、10 %0.42 x 106セル/mL にフェノールレッドのセル中断を行う P/S.</li>
	<li>90 μ L/黒 96 ウェル、フラット底板のウェルに 37,500 好中球を追加します。</li>
	<li>井戸の 10% の濃度に到達する 3 通で選ばれた刺激 (例えば、患者の血清) の 10 μ L を追加します。ネガティブ コントロール (中) は、3 通常に。</li>
	<li>希望の時間は、30 分から 2、4 または 6 h. 孵化 4 h が示唆されたために至るまで、37 ° C で暗闇の中で孵化させなさい。</li>
	<li>必要な 25 を追加する 5 μ M 不浸透性 DNA の μ L を染める (材料の表を参照)、井戸の 1 μ M の最終濃度に到達する量を計算します。RPMI 1640 媒体含む 2% の FCS で 10%、predilution は必要に応じて行う P/S、濃度が 5 μ M。</li>
	<li>インキュベーション時間の終わりの前に 5 μ M の不浸透性 DNA 染色 15 分の 25 μ L を追加します。暗闇の中で 37 ° C で別の 15 分間インキュベーションを続行します。</li>
	<li>非常に慎重に上清 (~ 125 μ L) を削除し、必要な場合を格納します。4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 100 μ L を追加します。暗闇の中とすぐに手順 4 に進みます。</li>
</ol>4 3 D の高いコンテンツは、高解像度蛍光共焦点顕微鏡を用いたネット可視化
<ol><li>
蛍光共焦点顕微鏡を集録のセットアップをクリックして設定を構成します。
	<ol>
<li>[構成] タブをクリックします。</li>
		<li>目的は、カメラを選択します。共焦点 60 μ m のピンホールのアクイジション ・ モードと 10 倍 Apo ラムダ目的を選択します。</li>
		<li>皿の上をクリックし、96 ウェル プラスチック プレートを選択します。サイトを訪問し、サイトの固定数を選択するを選択します。井戸の 45% の合計をカバーする (0 μ m) の重複なし 3 行と 3 列を入力します。</li>
		<li>取得をクリックします。レーザー ベースの焦点を有効にするを選択します。必要な場合は、 Z シリーズ/時系列データの取得を選択します。</li>
		<li>サイトのオート フォーカスをクリックします。<ol>
<li>プレート下部にフォーカスをクリックして |底の厚みによってオフに設定します。サンプル プログラムを探し、最初の井戸を選択初期も取得しました。サイト オート フォーカスのためには、すべてのサイトを選択します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>波長をクリックします。<ol>
<li>波長の数、2 を選択します。TL シェーディング補正洗練されたレベル 2 を選択します。</li>
			<li>波長 1 テキサス赤を選択します。<ol>
<li>オート フォーカス オプションは、Z オフセット、選択的レーザー ポスト レーザー オフセット 1.1 μ m。 使用 z カスタム範囲 200 - 10。</li>
			</ol>
</li>
			<li>波長 2 FITC を選択します。<ol>
<li>オート フォーカス オプションは、選択レーザー w1 から Z オフセット 0 μ m. 使用 z 200 10 のカスタム範囲で。</li>
				<li>取得オプションの Z シリーズと最大 2 D 投影イメージを選択します。取得オプションを選択シェーディング補正 |オフ。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Z シリーズを選択します。ステップ数を選択: 10。選択ステップ サイズ: 3 mm (全範囲は 27 μ m になります)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
蛍光共焦点顕微鏡に皿を置きます。
	<ol>
<li>[実行] タブをクリックします。<ol>
<li>板名と説明を記入し、ストレージの場所を選択します。</li>
			<li>井戸を取得する必要がありますを選択します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>テキサスの赤と FITC の露光時間を選択します。</li>
	<li>プレートの取得買収は、プレートごと約 1 時間を取るを開始するをクリックします。</li>
</ol>5. ネット形成過程の解析
<ol><li>画像処理プログラム (材料表参照) 科学的な多次元画像解析ネット形成を分析するために設計を使用します。</li>
	<li>取得した画像データを別のハード ドライブに転送します。</li>
	<li>
ツールを追加する色を選択します。
	<ol>
<li>W1 を選択し、データが格納されているハード ドライブのフォルダーを選択します。</li>
		<li>W2 を選択し、データが格納されているハード ドライブのフォルダーを選択します。 注:テキサス赤画像に赤い色を追加するファイル名で w1 を使用し FITC 画像に緑の色を追加する w2 を使用して標準的なマクロを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
解析マクロを選択します。
	<ol>
<li>W1を選択は通常 10 しきい値 (輝度しきい値) を選択します。目的のピクセル値 (例えば、100 サイズのしきい値) を選択します。</li>
		<li>W2を選択は通常 10 しきい値 (輝度しきい値) を選択します。目的のピクセル値 (サイズのしきい値、500 など) を選択します。</li>
		<li>スプレッドシート ファイルの保存先を選択して分析を実行し、その後ログ ファイルを保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スプレッドシートでデータを分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).</li>
<li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases%3F%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases?</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li>
<li>Garcia-Romo, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+are+major+inducers+of+type+I+IFN+production+in+pediatric+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus.</a> Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20(2011).</li>
<li>Lande, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+activate+plasmacytoid+dendritic+cells+by+releasing+self-DNA-peptide+complexes+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils activate plasmacytoid dendritic cells by releasing self-DNA-peptide complexes in systemic lupus erythematosus.</a> Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra19(2011).</li>
<li>Meng, H., Yalavarthi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Role+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Antiphospholipid+Antibody-Mediated+Venous+Thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">In Vivo Role of Neutrophil Extracellular Traps in Antiphospholipid Antibody-Mediated Venous Thrombosis.</a> Arthritis & Rheumatology. 69 (3), 655-667 (2017).</li>
<li>Desai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+of+different+sizes+and+shapes+induce+neutrophil+necroptosis+followed+by+the+release+of+neutrophil+extracellular+trap-like+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports+-+Nature%22%5BJournal%5D)">Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin.</a> Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003(2017).</li>
<li>Desai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PMA+and+crystal-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+involves+RIPK1-RIPK3-MLKL+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling.</a> European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).</li>
<li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. , (2018).</li>
<li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+high-throughput+detection+and+quantification+of+neutrophil+extracellular+traps+reveals+ROS-independent+NET+release+with+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity+Reviews%22%5BJournal%5D)">A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes.</a> Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).</li>
<li>Masuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NETosis+markers%3A+Quest+for+specific%2C+objective%2C+and+quantitative+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers.</a> Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).</li>
<li>Brinkmann, V., Goosmann, C., Kuhn, L. I., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+quantification+of+in+vitro+NET+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Automatic quantification of in vitro NET formation.</a> Frontiers in Immunology. 3, 413(2012).</li>
<li>Nakazawa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+formation+and+disordered+regulation+of+NETs+in+myeloperoxidase-ANCA-associated+microscopic+polyangiitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis.</a> Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).</li>
<li>Konig, M. F., Andrade, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Reappraisal+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+and+NETosis+Mimics+Based+on+Differential+Requirements+for+Protein+Citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination.</a> Frontiers in Immunology. 7, 461(2016).</li>
<li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+neutrophil+extracellular+traps+in+various+organs+of+a+murine+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model.</a> PLoS One. 9 (11), e111888(2014).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+calf+serum+contains+heat-stable+nucleases+that+degrade+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps.</a> Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).</li>
<li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+ANCA-associated+vasculitis+is+independent+of+ANCA%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA.</a> Kidney International. , (2018).</li>
<li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NET-effect+of+combining+rituximab+with+belimumab+in+severe+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The NET-effect of combining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythematosus.</a> Journal of Autoimmunity. , (2018).</li>
<li>Hahn, J., Schauer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregated+neutrophil+extracellular+traps+resolve+inflammation+by+proteolysis+of+cytokines+and+chemokines+and+protection+from+antiproteases%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases.</a> The FASEB Journal. (Aug 21), (2018).</li>
</ol>

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この試金の最も重要な部分は、好中球は短命であり、冷凍が死ぬために、各実験のため新鮮単離好中球を使用する必要です。これはドナーの特性のためのいくつかのバリエーションを巻き込むことができるたびには、健康なドナーを必要があります。これらのバリエーションのいずれかは、好中球の活性化状態です。好中球は既に分離前に生体内で活性化でした。さらに、赤血球の溶解中に特に好中球分離手順を通じてアクティブ化できる、したがって好中球の経験豊富なハンドラーが好中球の活性化を最小限に抑えるために必要です。一般に、好中球の隔離は、採血後、できるだけ早く行わなければならないし、実験は、過剰な自然活性化を避けるために一時停止できませんする必要があります。第二に、好中球の乱暴な取り扱いは避けてください。など、説明プロトコルの顕著な利点は、好中球は 96 ウェル プレートで播かれる一度最小限のピペッティング介入です。重要なは、好中球の活性化状態は、この試金することができますネット形成の低レベルを検出して敏感に刺激されない状態で評価は最高。試金に影響を与えることができるもう一つの要因は、培地で FCS の使用です。FCS の割合減少している 10% から 2% ネット形成の可能な抑制を避けるためにする抗酸化活動19,20または熱不活化にもかかわらず好中球のアクティブ化。FCS なしまたは使用の異なるタイプのメディアと文化は試みられていません。些細またはメディア コントロールは常に撮影に沿って分析を実行するときバック グラウンド信号 (例えば好中球の活性化状態を、するなど) の表示を持っています。同じ刺激を利用したさまざまな実験に一貫した結果を達成するためには、各刺激物質の例と比べると倍の増加が表示されます。
可能な高いバック グラウンドのための重要な要因は、ネットの形成過程と関係がない細胞外 DNA の染色です。現在のアッセイは、15 分の短い潜伏期間の直後に細胞外 DNA 染色を削除することによって、固定後直接プレートを分析することによってこれを軽減しようとします。したがって、それは十分な速度と 96 ウェル プレートをキャプチャするための分析力を持つ高度な共焦点顕微鏡を使用する重要な 1 に 2 h. 自動内露出時間とフォーカスの設定を推奨します。など、顕微鏡設定は各サンプルによって異なり、全体的に最適な画像品質のために必要な色輝度しきい値に関して実験できます。後者の影響は、好中球とネットと最適な設定を正しく定量化する最終的な機能は、複数コントロールのサンプル (例えば、健常者の血清) を使用して、したがって確認すべき。撮影した画像の分析中にピクセル単位のしきい値としきい値解析プログラムで使用できますネット形成のより良い選択。
ネット形成由来細胞の DNA は、NETosis、ネクロトーシス、pyroptosis、ferroptosis または重要なネット形成1も溶菌処理を含む、異なる死経路の結果をすることができます。など、現在の試金の制限、染色法による細胞外 DNA のだけで無いです分化ネット形成とその他の関連する細胞死経路間で可能。ネットの形成を支えるさまざまな形態の間で区別する別の immunostainings で citH3 とネなど、特定の NET マーカーの存在を確認異なる死経路のいずれかの選択的阻害剤を使用してこれを達成するために不可能です。DNA と共局在。CitH3 細胞外 DNA と NE の共局在は、この試金10最近確認されています。この分析では、ネットの特定のマーカーを避ける利点は完全かつ高スループット スクリーニングの潜在的な可能な限り客観的として好中球によって DNA の押出ネット形成のすべての形態を評価することができます。この議定書の適用性の定性的および定量的な違いを検出する能力は、プロセスの種類よりも重要かもしれない自己免疫疾患における免疫複合体を介した低レベル純誘導の研究に示されています。関与する10,21,22。ネット形成のさまざまな側面を調査する研究者にとって付加価値のこの新規ネット定量分析ができることを示します。アッセイを微調整は簡単に実装: 刺激周期、ネット形成につながる 1 つの特定の死経路に焦点を当てるの好きな純マーカーの使用、倍率の異なる使用や異なる純条件での使用の調整定量化と分析。
結論としては、提供されるプロトコルはネット形成前のヴィヴォ誘導網のさまざまな刺激に応じての評価のための半自動定量化のため高感度広範に適用される試金であります。

好中球細胞外トラップ (網) の形成である好中球が粒状抗菌、危険分子の広い範囲との複合体の構造のような細胞の三次元 (3 D) web で DNA を解放するプロセスと細胞質酵素、ペプチドおよびタンパク質。これらの免疫原性と毒性の構造トラップおよび殺害感染病原体1に健康な個人の生得の免疫の防衛の重要な生理的役割があります。しかし、彼らも実証されている血栓症2抗好中球細胞質抗体 (ANCA) を含む、さまざまな全身性自己免疫疾患に関与する-血管炎 (AAV)3, 全身性エリテマトーデス (SLE を関連付けられています。) 痛風7,8,9. 、乾癬、関節リウマチ (RA) 抗リン脂質抗体症候群 (APS)2,64,5
ネットの形成は、化学化合物ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA)、大規模なネットの形成を誘導すると広く研究されています。しかし最も生理的刺激は多くネット形成10の低レベルを誘発します。設定では、たとえば、自己免疫疾患、研究 NET トリガー検出し、ネットの形成を定量化する標準化された、敏感なハイスループット定量法が必要です。ネットの定量化、挑戦して、それぞれ独自の利点と制限の11の異なるメソッドが現在実行します。一般的に使用されるメソッドは、培養上清に12はであり目的が (アポトーシス、壊死、網)、DNA の起源を区別しません。 したがってネットの非常に特定ではない DNA の検出です。第二に、NET 固有の蛋白質、ミエロペルオキシダーゼ (MPO) や好中球エラスターゼ (NE) などの DNA 複合体の酵素抗体法 (Elisa) ネットを検出するためのより具体的なアプローチし、良く相関を示したシトルリン化ヒストン-3 (CitH3) 肯定的なネット13。ただし、この方法は十分に敏感なすべての網 (例えば、MPO、NE と CitH3 負ネット) をピックアップするかどうかは知られていません。3 番目のアプローチは、ネット関連分子 (MPO、NE CitH3) ネットを定量化する細胞外 DNA の共局在を検出に使用する蛍光顕微鏡です。この方法はネッツでは、一般ですがそれは高スループット方法としては適用できないし、観察者バイアスのための目的ではないです。さらに、このメソッドがないことを考慮 MPO-、NE、中古ネット トリガー14,15によって頻繁に存在している CitH3 負ネット。流れの cytometry のアプローチは、NET 頂好中球16で核の膨潤を示す変更されたフォワード/脇散布図 (FSC/SSC) を通じてネットを検出します。このメソッドでは、ない重要なネット形成17など、核腫大を伴う可能性がある識別されているネットの形成の異なった形態は考慮しません。最後に、蛍光共焦点顕微鏡を視覚化し、直接汚れを細胞外 DNA12,18細胞不透過性色素と細胞外 DNA を染色によってネット形成の定量化に適用されています。一般的には、5 に 10 電力のフィールドが手動で選ばれ評価、各ウェルの 96 ウェル プレート11,17の 1-5% をカバーします。イメージを手動で選択がない常に客観的、バイアスが生じやすく、高スループット分析のため魅力的ではないです。自動、高スループットのネット定量アッセイが最近開発されました、ネットを評価するために機密性の高い技術により、Z 積み重ね蛍光共焦点顕微鏡を 13 μ m をカバー 3 D 方法で井戸の 11% をイメージします。10従来の方法と比較します。現在のレポートでは、各ウェルの 45% の合計イメージ エリアを実現し、Z スタックを介して 27 μ m をカバー 3 D 共焦点顕微鏡を用いた自動、高感度アッセイによるネットの形成を定量化する最も最近のプロトコルについて説明します。このプロトコルは、高い感度で、客観的かつ公平な方法でネット形成の低レベルの定量化に適しています。

<table><tbody><tr><td>Aqua Sterile H2O</td><td>B. Braun, Melsungen, Germany</td><td>12604052</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FCS)</td><td>Bodinco, Alkmaar, The Netherlands</td><td></td> 高<td>濃度で使用すると、NET形成が不透明</td></tr>になる可能性があります <tr><td>Ficoll 5.7% - amidotrizoaat 9% density 1.077 g/mL</td><td>LUMC, Leiden, The Netherlands</td><td>97902861</td><td></td></tr><tr><td>免疫蛍光共焦点顕微鏡</td><td>Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中和PBS (10x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (p/s)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドフリー RPMI 1640 (1x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>11835-063</td><td>フェノールレッドは免疫蛍光シグナルに干渉する可能性があります</td></tr> リン酸<tr><td>緩衝液生理食塩水(PBS)</td><td>B.ブラウン、メルズンゲン、ドイツ</td><td>174628062 PKH26</td><td></td></tr><tr><td>2 &mu;M Red 蛍光細胞リンカー</td><td>Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA</td><td>PKH26GL-1KT</td><td>PKH は、特許取得済みの蛍光色素であり、発見者 Paul Karl Horan プログラムにちなんで名付けられた細胞標識技術</td></tr>です 科学的な<tr><td>多次元画像解析のためのプログラム</td><td>ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (1x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>52400-025</td><td></td></tr><tr><td>Sytox green 5 mM Impermeable DNA dye</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>57020</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain 0.4%</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>17942E</td><td></td></tr><tr><td>96 well, black, flat bottom, tissue culture treated plate</td><td>Falcon, NY, USA</td><td>353219</td><td></td></tr></tbody></table>

高スループット アッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

好中球細胞外トラップ (網) は、さまざまなトリガーによって好中球によってリリースすることができます免疫原性の細胞外 DNA 構造です。ネットは、トラップし、微生物を殺す重要なホストの防衛メカニズムとして機能する実証されています。その一方で、彼らは多様な全身性自己免疫疾患に関与しています。ネット、抗好中球細胞質抗体 (ANCA) を含む関連自己抗原のプールを含む免疫原性と毒性の構造-血管炎 (AAV) と全身性エリテマトーデス (SLE) を関連付けられています。網の異なった形態は、刺激によって誘起することができます。DNA-複合ミエロペルオキシダーゼ (MPO) や好中球エラスターゼ (NE) のようなネット分子とシトルリンの存在を測定測定上清中に DNA 放出を測定を含むさまざまなテクニックを使用して網の量を定量化することができます。蛍光顕微鏡、または NET コンポーネントすべての特異性、感度、客観性、数量などさまざまな機能を持っているの流れフローサイトメトリー検出によるヒストン。ここで、三次元蛍光共焦点顕微鏡を用いた高感度、高スループット方法で ex vivo ネット形成を定量化するためのプロトコルです。ネット形成と健康と病気の劣化について様々 な研究の質問に対処するため、このプロトコルを適用できます。

好中球細胞外トラップ (NET) の形成は、各ウェルにフォーカル プレーンで発進 3 μ m の距離で 10 Z スタック以上染色の細胞外 DNA を定量化することで 3 D の方法で定量化されます。累積的な領域 (図 1 a) 試金増加の感度を測定。分離された好中球の 1.10% で異なる分離から 14 種類のサンプルで測定される標準偏差 (SD) と 98.7% の平均純度があります。赤血球の平均割合は 1.04% ± 1.1 %sd と単球の平均割合は 0.085% ± 0.17 %sd (データは示されていない)。ピアソンの相関係数は 0.99 (95% 信頼区間 [CI] 0.985 0.997 の各ウェルに合計好中球数と有意の関連性、それぞれの井戸で焦点面でのみイメージ ステンド グラスの好中球の総面積を定量化します。p &lt; 0.0001) (図 1 b)。NET における好中球の定量化の代表の結果刺激 AAV 患者または媒体 (MED) の 10% 血清累積的な染色細胞外 DNA の領域として表される、ネガティブ コントロールとしてイメージ化された好中球 (図あたり以上 10 Z スタック1 C). AAV 刺激による好中球 (図 2 b) で代表的な画像処理好中球 (図 2 a) と網のスナップショットが表示されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59150/59150fig1.jpg"> 図 1: 細胞外 DNA と好中球数の測定によるネット形成の定量化します。各処理好中球 (MED) で、好中球の刺激 10% 血清 ANCA 関連血管炎 (AAV) 患者の累積 10 Z スタック上定量化されます (A) 地域 (n = 4) 画像処理プログラムで量を示されます。各刺激が 3 通でテストされた、各ポイントは中央値を表します。(B) 赤の蛍光ラベル付きセル領域とセル数が画像処理プログラムによって各ウェルの焦点面で定量化された (R2 = 0.99、 p &lt; 0.0001)。(C) ネット形成は、イメージ化された好中球 (セル領域) 累積面積で表されます。各 3 通の平均 (SEM) の平均 ± 標準誤差は、刺激ごとにプロットされます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59150/59150fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59150/59150fig2.jpg"> 図 2: ネット定量アッセイのスナップショット。蛍光標識好中球が赤で表示され、染色細胞外 DNA が緑色で表示されます。Apo ラムダの計画目的 × 10。(A) 安静時の好中球。(B) 好中球 AAV 血清で刺激。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59150/59150fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルは、蛍光抗体法により三次元共焦点顕微鏡による ex vivo ネット形成の半自動定量化のための高感度・高スループット好中球細胞外トラップ (ネット) 試金を記述します。このプロトコルは、ネット形成とさまざまな刺激後の劣化を評価する使用することができ、潜在的なネット標的療法を研究するため。

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

好中球細胞外トラップ(NET)を測定するためのハイスループットアッセイを開発しました。NETは、好中球によって暴露される免疫原性DNA構造である。NETは微生物を捕捉して殺すことができるため、重要な抗感染メカニズムですが、自己免疫疾患においても病原性の役割を果たしています。この技術により、NETsは3次元免疫蛍光共焦点顕微鏡で定量化され、高感度で高スループットの方法でNETの形成と分解を研究します。この技術により、自己免疫疾患患者のNET形成を定量化することができます。ANCA関連血管炎または全身性エリフェマトーシスを有する患者のex vivo NET形成は、このアッセイで監視することができた。さらに、NET形成を標的とする潜在的な治療薬は、このアッセイin vitroで試験することができる。好中球の孤立は、これまでにこの技術を行ったことがない人々のための闘争である可能性があります。この手順を開始するには、2つの10ミリリットルEDTAコードチューブで健康なドナーから末梢血20ミリリットルを得る。無菌50ミリリットルチューブとPBS中の血液10ミリリットルを最終的な総容量32.5ミリリットルに移す。10ミリリットルのピペットとピペットコントローラを使用して、14ミリリットルの密度勾配を取ります。ピペットを50ミリリットルチューブの底に置きます。次に、ピペットコントローラをピペットから取り出し、キャピラリー効果によって最大に達するまで重力によって密度勾配が流出することを可能にする。ピペットの上に親指を置いて、残りの密度勾配が漏れないようにし、チューブからピペットを取り除きます。加速度やブレーキなしで20分間室温で912回gのチューブを遠心分離します。末梢血単核細胞を含む白い環を最初に慎重に取り出し、PBS希釈血漿に続いた。最後に、密度勾配レイヤーをできるだけ削除します。次に、冷たい滅菌蒸留水のボトルと10倍の濃縮PBSのフラスコを冷蔵庫から取り出します。迅速に作業, ペレットの上に直接水の36ミリリットルを追加し、慎重に一度混合.最初から20秒数えた後、10倍PBSの4ミリリットルを加えて等張溶液を作ります。そして再び、慎重に一度混ぜる。チューブを739倍g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨てて、ペレットが固まっていないため、極めて注意を払い、前述のように冷たい滅菌蒸留水と濃縮PBSを添加する処理を速やかに繰り返す。328倍gで遠心分離機、5分間摂氏4度。上清を慎重に取り除き、PBSの5ミリリットルでペレットを再懸濁します。好中球を数え、氷の上に保管してください。まず、15ミリリットルのチューブにPBSの2ミリリットルに約10〜2000万個の好中球を含む好中球懸濁液を作ります。別の15ミリリットルのチューブで、2マイクロモル赤蛍光細胞リンカーの4マイクロリットルと2ミリリットルのPBSを混合します。赤蛍光セルリンカー溶液を好中球懸濁液にそっと加え、慎重に混ぜます。チューブをアルミニウム箔で包んで混合物を光から保護し、摂氏37度で正確に25分間インキュベートし、赤蛍光細胞リンカーで好中球にラベルを付けます。室温で10%熱不活化FCSを含むRPMI 1640培地を最終体積15ミリリットルに添加してラベルを不活性化し、1回慎重に混合します。この後ペレットが形成された場合は、慎重に混合物を再中断します。室温で5分間328回gのチューブを遠心分離する。上清を取り除く前に、ペレットが形成されていることを確認してください。この後、ペレットを室温で2%FCSを含む赤色フリーRPMI 1640培地の5ミリリットルで再懸濁した。次に、好中球を数えます。2%FCSを含むフェノールレッドフリーRPMI 1640培地中で、1ミリリットル当たり420,000細胞の密度で細胞懸濁液を作る。黒い96ウェル、フラットボトムプレートの各ウェルに90マイクロリットルで37,500好中球を追加します。次に、選択した刺激の10マイクロリットルを3重に加えて、各ウェルに10%の濃度に達する。常に三重に負のコントロールを含めます。30分から2、4、または6時間の範囲で、所望の時間のために摂氏37度で暗闇の中でインキュベート。次に、5マイクロモル不透過性DNA色素の25マイクロリットルを添加するために必要な不透過性DNA色素の体積を調製し、各ウェルに1マイクロモルの最終濃度に達する。インキュベーション時間の終了の15分前に、各ウェルに5マイクロモル不透過性DNA染料25マイクロリットルを加える。暗闇の中で摂氏37度で最後の15分間インキュベーションを続けます。この後、上清を非常に慎重に取り出し、必要に応じて保管してください。4%パラホルムアルデヒドの100マイクロリットルを加えます。プレートを暗闇の中に保管し、すぐに次のセクションに進みます。設定を構成したら、[Z シリーズ]を選択します。ステップ数として 10 を選択します。ステップサイズとして3マイクロメートルを選択します。プレートを免疫蛍光共焦点顕微鏡に積み込みます。[実行] タブをクリックします。プレートの名前と説明を入力し、保管場所を選択します。取得する必要がある井戸を選択します。テキサスレッドとFITCの露出時間を選択します。その後、プレートを取得をクリックし、プレートあたり約1時間かかる取得を開始します。この後で、マクロの分析を選択します。次に、w1 を選択し、しきい値を選択します。次に、目的のピクセル値を選択します。最後に、2 番目の Image J ウィンドウで、w2 を選択し、希望のピクセル値を持つしきい値を選択します。スプレッドシート ファイルの保存先を選択し、分析を実行し、ログ ファイルを保存します。ここで提示される高感度の広く適用可能なアッセイは、異なる刺激で好中球外細胞トラップのex vivo誘導の評価のための好中球外細胞トラップ形成の半自動化定量のための分析です。NET形成は、各ウェルの焦点面から始まる3マイクロメートルの距離で、10個のZスタック上の染色された細胞外DNAを定量化することによって三次元的に定量化される。累積面積を測定することにより、アッセイの感度が高くなる。画像化された染色好中球の全面積は、各ウェルの焦点面でのみ定量化され、ピアソン相関係数0.99の各ウェルの全好中球数と有意に相関する。好中球におけるNET形成の定量の代表的な結果は、画像中性好中球あたり10個のZスタックにわたる累積染色された細胞外DNA領域として表される。その後、正味定量アッセイのスナップショットが撮影されます。AAV刺激好中球中球中の非刺激性好中球およびNETの代表的な画像は、緑色の蛍光標識好中球と染色された細胞外DNAでここに示されている。好中球は注意して処理されるべきであり、PKHの標識はプロトコルに従って正確に行われるべきである。このアッセイは、NETの形態、運動学、および組成を研究するために使用することができます。この技術は、健康と病気におけるNETを研究する可能性を提供するもう一つの方法です。トリパンブルー、PKH、PFAは手袋で取り扱い、直接呼吸しないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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高スループットアッセイを行い好中球細胞外トラップ形成の定量化

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