高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

このサンプル調製技術は、最適な超構造保存と、集焦点イオンビーム走査型電子顕微鏡におけるイメージングモダリティに最適なコントラストを組み合わせるように設計されています。このプロトコルは、信頼性の高い超構造保存のために高圧凍結による調製を必要とするが、体積イメージングのための凍結置換時に十分なコントラストを得られないサンプルに特に有用である。最小限の樹脂埋め込みのためには、焦点を合わせたイオンビーム走査型電子顕微鏡で後で適切なターゲットを設定できるように、できるだけ多くの樹脂を除去することが不可欠です。

まず、ピペットを使用して、カッティングマットに20%PVP PBSの1滴を滴下します。解剖されたネルバウス・チビアリスを液滴に浸します。メスを使ってサンプルの長さを2ミリメートルカットします。

微小鉗子を使用して、深さ0.2ミリメートルのA型金属サンプルキャリアにサンプルを配置します。キャリアをカートリッジの中央プレートに移します。ヘキサデカンコーティングされたB型キャリアを蓋として上部に置きます。

カートリッジの上半分を下げてアセンブリを閉じます。高圧冷凍庫のローディングステーションで3ピースカートリッジを閉じます。プロセスボタンを押して、製造元の操作手順に従って続行します。

液体窒素の浴中で、凍結した0.1%タンニン酸とアセトンの2ミリリットルを含むクライオバイアルにサンプルキャリアを入れ、キャップを閉じます。クライオバイアルをマイナス90°Cに設定したフリーズ置換ユニットに入れ替えます。プログラムを起動し、100 時間そこにサンプルを保持します。

凍結置換部では、2ミリリットルのアセトンを30分間3回洗浄します。0.1%の酢酸に2%オスミウム四酸化膜を冷却するための凍結置換ユニットに入れ、マイナス90°Cで染色を続けて7時間サンプルに加えます。凍結置換ユニットのプログラム温度がマイナス20°Cに達したら、サンプルをさらに16時間そこに保管してください。

温度が摂氏4度に上がったら、バイアルの液体を捨てて純粋なアセトンを充填します。凍結置換ユニットからクライオバイアルを取り外します。凍結前およびオスモフィシング後のサンプル処理は、サンプルが深刻な損傷を受ける可能性があるため、非常に重要です。

煙のフードでは、細かい鉗子を使用してクライオバイアルから金属キャリアを取り出し、サンプルをキャリアから移してアセトンで満たされた150ミリメートルの深い時計ガラス皿に沈めます。サンプルをアセトンで満たされた2ミリリットルの反応管に移す場合は、ファイン鉗子を使用してください。250ワットのマイクロ波を40秒間セットし、サンプルを洗浄して4回繰り返すように電子レンジを開始します。

ピペット1%チオカルボヒドラジド溶液を反応管に1ミリリットル入れ、マイクロ波に入れる。2分と2分オフで真空機能をオンにし、合計14分間繰り返し、150ワットに設定します。電子レンジを起動します。

前にしたようにアセトンでサンプルを4回洗浄します。ピペット2%オスミウム四酸化溶液を反応管に1ミリリットル入した。サンプルを電子レンジに入れ、チオカルボヒドラジドと同じ電子レンジ設定を使用します。

前にしたようにアセトンでサンプルを4回洗浄します。25%の樹脂を反応管に1ミリリットル入れ、マイクロ波に入れる。真空機能を3分間オンにし、250ワットに設定します。

電子レンジを起動します。爪楊枝を使用して反応管からネウバビアリスを取り出し、プラスチックフィルムの上に置きます。サンプルの近くにハロゲンランプを置き、樹脂を加熱します。

爪楊枝を使用して、残りの樹脂が検出されないまで、プラスチックフィルムの上にサンプルを軽く押し回します。サンプルをオーブンの上に置き、温度を摂氏60度に設定して、サンプルを少なくとも48時間重合します。カミソリの刃を使用して、重合したサンプルをプラスチックフィルムと一緒にSEMスタブに合ったサイズで切り取ります。

SEMスタブに導電性の銀樹脂を追加し、カットサンプルを取り付けるために爪楊枝を使用します。そしてサンプルのまわりに樹脂を加えます。オーブンにSEMスタブを入れて、少なくとも4時間または一晩摂氏60度で重合します。

重合後、スパッタコーターにSEMスタブを配置します。スパッタコーターを35ミリアンペアに設定し、厚さ10ナノメートルの金のコーティングまたはコーティングを1分間塗布します。コーティング後、SEMスタブを集着したイオンビーム走査型電子顕微鏡の内部に置きます。

本研究では、マウスのネルバシアリスとC.elegansの拡張プロトコルを実施し、焦点を合わせたイオンビーム走査電子顕微鏡で3D体積イメージングを行うための最適な保存とコントラストを示した。標準的なプロトコルは、多くの場合、強化されたプロトコルが強い膜コントラストを提供する膜コントラストの欠如に苦しんでいます。プロトコルと標準プロトコルが強化された C.elegans の断面画像は、独特の違いを示しています。

ネルバシティシアリスの断面画像だけでなく、強化されたプロトコルは、標準的なプロトコルと比較してより強い膜コントラストを示すのに役立ちます。後処理後、画像処理・モデリングプログラムであるIMODを用いて電子顕微鏡データを可視化する。青でハイライトされた領域は、セグメント化された軸索を示します。

赤くハイライトされた領域は、Remak バンドルを示しています。黄色とオレンジ色のハイライトされた領域は、ミエリン鞘を示しています。そして、ターコイズ色のハイライトエリアはミトコンドリアを示しています。

仮想的な遺物と三次元モデルは、微細組織アーキテクチャを示し、その機能を理解するのに役立ちます。他の体積走査電子顕微鏡法は、シリアルブロック顔走査電子顕微鏡法やアレイ断層撮影法なども用いることができる。このプロトコルは、透過型電子顕微鏡や中枢神経系からのサンプルなどの他のサンプルタイプにも使用できます。

四酸化オスミウム、チオカルボヒドロジド、酢酸ウラニルは有毒な化学物質であり、慎重に使用する必要があります。樹脂も有害であり、注意して使用する必要があります。手袋やラボコートなどの個人用保護具は、完全なプロトコルのために着用する必要があります。