Name: 高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶ高圧急速凍結とマイクロ波処理を組み合わせた試料作製法。マウスの脛骨神経とCaenorhabditis elegansを用いて、膜コントラストと3Dボリュームイメージングの品質を向上させる手法を解説する。

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クラスターの卓越性とドイツ研究振興協会 (DFG) 研究センター ナノ顕微鏡と分子生理学脳 (CNMPB) は FIB SEM と a. s. (FIB SEM オペレーターの位置) を賄われています。ラボのトーマス ・ ミュラー-ライヘルトにc. の elegansサンプル.を提供ありがとうウルリッヒ ・ ワイケルトにありがとう映画に参加しています。

ここで説明した動物からサンプルを含むすべての実験は、顧客保護および食品安全性 (ラーベス) 機関動物ケアおよび低いザクセンの州のオフィスによって承認されています。
1. 高圧凍結と凍結置換
<ol><li>マウス (例えば、C57Bl6N、12 週間、女性)9から顔面神経脛骨を解剖します。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 20% ポリビニルピロリドン (PVP の 5 mL に 1 g) の液滴における顔面神経の脛骨の長さ 2 mm の部分をカットします。金属サンプル キャリア (タイプ A、深さ 0.2 mm) に配置し、微細鉗子を使用します。蓋としてヘキサデカンの薄膜層で被覆別フラット キャリア (タイプ B) を追加し、試料カートリッジにこのアセンブリを挿入します。</li>
	<li>いくつかc. の elegans 20% ウシ血清アルブミン (BSA) M9 の液滴の中断を転送 (材料の表を参照) (A タイプ) の金属製のキャリアに使い捨てのプラスチックのピペットで。(タイプ B) の上に蓋として第 2 キャリアを追加し、カートリッジを組み立てます。</li>
	<li>両方のサンプルは、次のように進んでください: 高圧高圧冷凍庫のローディング ステーションにスリーピースのカートリッジにそれらを読み込むサンプル キャリア アセンブリ 1 つを凍結します。製造元の取扱説明書に従ってプロセス ボタンを押します。 注: サンプルの両方のタイプは、その後の凍結置換で一緒に処理できます。</li>
	<li>2 mL のアセトンで冷凍の 0.1% タンニン酸を含むクリオバイアルにサンプルを配置します。バイアルに液体窒素をこぼさず液体窒素のバスで転送を実行します。転送自動凍結置換装置10にクリオバイアル-90 ° C で設定し、プログラムを起動します。 注: osmification は、四酸化オスミウム11の普及拡大を媒染剤として使用される前に、サンプルは 100 h タンニン酸の-90 ° C で保持されます。</li>
	<li>手動でサンプル 3 を洗って-90 ° c の凍結置換ユニットでアセトン 2 mL で 30 分の x。</li>
	<li>四酸化オスミウム 2 %2 mL にサンプルのまま、自動で継続的な汚損のためアセトン酢酸ウラン 0.1% 凍結置換ユニット-90 ° C で 7 h 注意: 四酸化オスミウムは毒性がありヒューム フードの下で処理する必要があります、保護具を着用する必要があります。 注: 凍結置換ユニットは自動的に 5 ° C/時間-20 ° C に温度を上げます。サンプルは凍結置換ユニットで 16 時間-20 ° C で保存されます。温度が 10 ° C/h 4 ° C に自動的に発生します。</li>
	<li>温度 4 ° C に達したときに純粋なアセトンと四酸化オスミウム ソリューションを交換します。凍結置換ユニットから、クリオバイアルを削除します。</li>
</ol>2. マイクロ波処理
注: はすべて室温12温度を安定に保つために温度コントロール ユニットを使用して次の手順の実行 (材料の表を参照してください)。
<ol><li>電子レンジで処理中に反応管のキャップが開いたまま。</li>
	<li>クリオバイアルから金属サンプル キャリアを取るし、時計ガラス皿 (150 mm) にアセトンに水没してサンプルを維持しながら微細鉗子や、針を使用して金属製のキャリアからサンプルを削除します。</li>
	<li>微細鉗子またはピペットを使用して 2 mL 反応チューブにサンプルを転送し、1 mL の 4 倍の 40 アセトンで洗う・ w ・ 250 s 注意: Thiocarbohydrazide は毒性がありヒューム フードの下で処理する必要があります、保護具を着用する必要があります。</li>
	<li>1 ml 1%、コントラストを高める 150 W で 14 分のアセトンで thiocarbohydrazide のサンプルを染色します。染色を行うには、反応管にピペットの thiocarbohydrazide ソリューション、電子レンジにチューブを配置し、/2 で計 14 分の反復処理を 2 分の (真空機能をオン) と 150 W の電力レベルにプログラムを設定します。電子レンジを起動します。 注: Thiocarbohydrazide は、凍結置換中に適用された四酸化オスミウムと反応します。オリジナルの四酸化オスミウム サイト13に供託すべきより多くの四酸化オスミウムをできるように、橋を形成します。</li>
	<li>洗浄サンプル 4 x 40 アセトン溶液の 1 mL をピペット反応管にアセトン ・ w ・ 250 s 電子レンジに管を配置し、40 s. 開始電子レンジの 250 W を選択。</li>
	<li>ステイン 1 ml ピペット ・ w ・ 150 で 14 分間アセトンで 2% オスミウム四酸化の反応管に四酸化オスミウム ソリューション、電子レンジにチューブを置き、2 分間 (真空機能をオン) と 150 W の電力レベルにプログラムを設定オフに/2 分、合計 14 分間反復します。電子レンジを起動します。</li>
	<li>サンプル 4 を洗うアセトン 40 ml の 1 x 250 W (2.5 のステップで実行) との s。</li>
	<li>1 ml のアセトンで樹脂濃度の増加に潜入 (材料の表を参照してください) の 25%、50%、75%、90%、100%、100% ピペット反応管に樹脂・ w ・ 250 で 3 分、電子レンジに管を配置し、電力レベルのプログラムを設定l (真空機能をオン) と 250 W の電子レンジを開始 3 分。</li>
</ol>3. 最小限の樹脂8を埋め込み
<ol><li>(材料の表を参照してください) フィルムのプラスチックの部分につまようじと場所で反応管の脛骨神経、 c. の elegansを取り出してください。</li>
	<li>つまようじを使用して、残りの樹脂が検出されないまでプラスチック フィルムのサンプルを軽く押します。樹脂粘性が低くなりより簡単に削除することですので (材料の表を参照) を加熱用ハロゲン ランプを使用します。ハロゲン ランプの場所は (手をやけどしないように注意しながら) 樹脂を熱に十分に近い。</li>
	<li>オーブンでプラスチック フィルムの上に 60 ° C で少なくとも 48 時間サンプルを重合します。</li>
</ol>4. FIB SEM のための準備
<ol><li>SEM スタブをフィッティング サイズでかみそりの刃を使用してプラスチック フィルムと共に重合サンプルを切り取って銀導電性樹脂を使用した SEM 関連のスタブ項目にそれらを添付 (材料の表を参照してください)。少なくとも 4 時間または一晩 60 ° C で再度重合します。</li>
	<li>SEM の試料は 35 で 1 分の金でスタブ スパッタ コート スパッタ塗布装置による mA (プラチナ/パラジウムも使えます; 10 nm 厚塗りで十分です) し FIB SEM 内に配置</li>
</ol>5 FIB SEM 内データ集録
<ol><li>顕微鏡を運転する基本的なソフトウェアを使用して二次電子検出器とサンプルのイメージ (材料の表を参照してください)。サンプルは、興味 (顔面神経脛骨またはc. の elegansの中部など) の領域は、ビューのフィールド、指向する必要があります。 注: データ集録を実行するには、チルト、ステージ位置にサンプルは、適切な作動距離 (5 mm) で 90 ° の角度でイオンビームを向くように、イオン ・電子ビームのいわゆる偶然ポイントに。当社の楽器を使用して、これは 54 ° と 5 mm の作動距離のステージの傾きで達成されます。</li>
	<li>サンプルの正しい位置を設定、二次電子検出器を用いたイメージングしながら 0 ° の傾きで一般的な機能をセンターします。ゆっくりと 54 ° (5 °、20 ° 54 °)、チルトは、M 軸を移動することによって同じオブジェクトを飛行します。</li>
	<li>54 ° FIB モードで中央位置に機能を移動することによって続いて二次電子検出器を用いたイメージングしながら機能を中心として偶然の一致点を見つけます。SEM のソフトウェア中心の徴候を持っていることの十字線を表示することによってこれを実行します。その後、最初機能へ移動選択したサンプル イメージ領域の中央 SEM ソフトウェアのセンター ポイント関数を使用しています。Z のステージを移動することによって、センターの y 軸に沿った機能。SEM のビーム シフトと FIB と SEM との間の任意の最終的なオフセットを修正します。</li>
	<li>高度なソフトウェアを開く (材料表参照) 記録 3 D データセットおよびソフトウェア ウィザードのステップバイ ステップに従ってください。</li>
	<li>興味、付着カーボンやプラチナの領域 (400 nm) 投資収益率の上に充電することによって誘発現在 3 nA を使用しても加工を許可し、成果物を減らします。 注: 撮像 (幅、高さ、奥行き) は FIB 試料表面に粉砕する関心領域を描画することによってソフトウェアを計算し、別のサンプル準備機能、粉砕するトレンチなどの領域のサイズを重ねプラチナ/炭素析出。これはサンプル表面を損傷することができます、また、FIB 電流が高すぎるで試料表面のイメージングの慎重なあります。50 pA の電流は、イメージングのために十分です。</li>
	<li>現在 15/30 nA を使用しての利益 (率 ROI) の領域を公開するのに海溝をミル加工するのに集束イオンビームを使用します。</li>
	<li>集束イオンビームを使用して、現在 7 nA と断面を仕上げます。</li>
	<li>サンプル準備を終えて、次の撮像パラメーターを設定: ミリングパラ メーター FIB 設定タブ (FIB 加工現在) の FIBSEM セットアップ] タブおよび SEM オートチューン] タブでパラメーターを調整する画像のパラメーターをイメージング (オート フォーカス、autostigmation 60 分ごと 50 nm のピクセル サイズ、滞留時間 3 を実行、平均 3 行)。すべてのサンプルにこれを最適化します。</li>
	<li>実行中にドリフトするブロック顔を引き起こして任意の温度ドリフトを防ぐためには、取得を開始する前に少なくとも 2 時間のための部屋を残します。</li>
	<li>連続ミルのデータセットを取得し、700 pA FIB の現在のモードを取得します。使用 1.5 kV (分析モード、900 V) ESB 検出器グリッド電圧 400 V を取得する画像をそれぞれの高度なソフトウェアを使用して 5 nm ピクセル サイズ (材料の表を参照してください), 50 nm スライス厚。1 つの画像の取得は、6 μ s のドウェル時間約 1.5 分かかります。</li>
	<li>データ集録を開始します。サンプルが移動しなかった興味の右の領域が選択されていることを確認する現在のフライスで FIB イメージを取得します。必要に応じて調整します。</li>
</ol>6. データの可視化
<ol><li>フィジーでフィジーにすべての画像を含むフォルダーをドラッグすると、画像を開くし、仮想スタックを選択します。</li>
	<li>四角形ツールを使用して関心の領域をトリミング (画像 > 作物)。</li>
	<li>暗闇の中示す膜を利用した伝統的な透過電子顕微鏡によるコントラストを示すデータを反転 (編集 > 反転)。</li>
	<li>位置合わせに TrackEM214 (フィジー15) を使用します。TrackEM2 にデータを読み込む (ファイル > 新しい > TrackEM2)レイヤーをクリックしています。すべての画像が読み込まれた後は、それらを整列多層モザイク関数を使用して (を右クリックして画像 > 整列 > 多層モザイクを揃える)。個々 の tiff ファイルとしてイメージをエクスポート後、(右画像 > エクスポート > 作るフラット イメージ)。すべての画像をエクスポートするか、ファイルに保存を選択を選択します。</li>
	<li>後処理、ガウス分布のぼかしを使用 (プロセス > フィルター > ぼかし (ガウス); シグマ 2) とローカル コントラスト強調 (プロセス > ローカル コントラストを強調;CLAHE: ブロック サイズ 127, ヒストグラムのビン 256, 最大勾配 1.5)、イメージを滑らかにしより良い信号対雑音比を取得するフィジーで適用されています。</li>
	<li>IMOD16は、手動分割を行い、3 D に興味の構造を視覚化するために使用されます。IMOD でデータセットを開き、描画ツールを選択 (特別な > 描画ツール) マニュアルのセグメント化を行う。ボリューム (たとえば結合、スカルプト) 全体の関心の構造に従ってくださいさまざまな手動ツールを使用できます。半自動抽出法の顕微鏡画像ブラウザー (MIB17) を使用します。</li>
</ol>

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</ol>

利害の対立が宣言されていません。

最適な保全と FIB SEM を使用シリアル ブロック顔イメージングを実行するコントラストを説明するために開発されたプロトコルため、凍結置換とマイクロ波処理を用いた染色後に続いて低温固定化を適用しました。したがって、このプロトコルは、高圧の凍結には十分に小さいサンプルに制限されます。この手法で正しく固定できるサンプル サイズに一致するサンプルのキャリアのサイズによって幅 3 〜 6 mm のサイズ制限と 〜 200 μ m の厚さを設立します。坐骨神経は適切な凍結を確保するために必要な 0.2 mm のキャリアに合わせて直径が大きすぎるので、これはマウスの神経のサンプルに関連します。したがって、脛骨神経や大腿神経など他の細い神経などの小さな神経の慎重な郭清をお勧めします。髄鞘はストレッチに敏感なため、成果物を処理を避けるために新鮮な実行可能な神経の解剖時に細心の注意する必要があります。一般に、実行可能なサンプルだけを使用して、電子顕微鏡研究ください。
マイクロ波を用いた処理と最小限の樹脂埋め込み準備を高速化およびプロセスをターゲットに設計されています。常温化学固定のため変更された OTO プロトコル4を適用するマイクロ波処理が使用されます。電子レンジの均一な分布はありませんので、その温度が制御されていない適用ことができる真空はない、家庭用の電子レンジは同じ結果を得られません。小さいサンプル、; 化学物質のより良い浸透したがって、小さいサンプルで最良の結果を実現します。サンプルへの損傷を避けるためには、過熱、温度制御と最小限必要なマイクロ波電力のアプリケーションは、重要です。ベンチの処理時間が長くなることにつながる、電子レンジがない場合、マイクロ波処理手順を実行できます。SEM で対象の直接構造物サンプルの上部からできるだけ多くの樹脂を除去することが重要です。データセットを記録した後 raw データの後処理はファイルのサイズを削減し、信号対雑音比を向上させるために必要です。モダンなボリューム イメージング技術は、大量のデータを生成します。したがって、迅速かつ十分な方法でデータの処理を実行するワークステーションに十分な RAM が必要です。配置操作データセットのサイズとして、少なくとも 2 倍の RAM が必要です。
このプロトコルはc. の elegansのようにマウスと同様の神経脛骨でテストされています。Hall ら.12同じようなエンハンスメント ステップ ベンチにその凍結置換後の調製に使用線虫。ゼブラフィッシュなど他のモデル生物のプロトコルの調整が必要があるでしょうです。可能な変更の 1 つはコントラスト強化18に使用される水の添加によって凍結置換カクテルなどの構成を変更します。また、凍結置換の期間はサンプルに適応するが、急速凍結置換プロトコル19によると大幅に短縮することができます。1 つの可能性は、攪拌凍結置換プロセス20を加速するためのアプリケーションです。凍結置換後さらに変更が可能、化学物質と四酸化オスミウム21強化の繰り返されるアプリケーションなどです。電子レンジ処理中にそれぞれのサンプルの結果を最適化するためには温度、培養時間、および電源設定を変えることができます。
このプロトコルは、他の凍結置換プロトコルとシリアル ブロック面走査型電子顕微鏡、FIB SEM のイメージはサンプル ホール12のとおり各種併用そのような拡張することができますを示しています。これらのイメージングでは、拡張コントラスト、透過型電子顕微鏡には重要である必要があります。

高圧凍結は、高品質微細構造の保存、化学固定法1を用いた従来製法よりサンプルの本来の状態を表すを取得する選択のサンプル調製法です。この低温調製法、サンプル有髄マウス組織2や線虫3モデル有機体の使用のための厳格な要件などに役立ちます。凍結置換と樹脂を埋め込み後、これらのサンプルは通常透過型電子顕微鏡 (TEM) または電子線トモグラフィー (ET) によって分析されます。場合は、大きなボリュームは、SEM による適切なイメージングがコントラストの欠如によって妨げられて多くの場合経験の大規模な高解像度 3 D 再構成の FIB SEM またはシリアル ブロック顔画像を使ってイメージ化される必要があります。FIB SEM のイメージは通常一次電子ビームからの後方散乱電子の検出によって記録されます。後方散乱電子の量は試料中の重金属の内容に比例します。したがって、プロトコルによって設計された画像のコントラストを高めるためにボリュームの追加重金属含浸。このようなメソッド化学的固定サンプルに基づいてナッツら5、シリアル ブロック顔で説明されているように四酸化オスミウム-四酸化オスミウム-thiocarbohydrazide4の組み合わせを適用および集束イオンビーム走査電子顕微鏡。フォルムアミドおよびピロガロール6または鉛アスパラギン酸7の使用を含む変更は、正常に別のイメージング技術を適用されています。
ここで提供されるプロトコルは、HPF による試料の低温作製を結合し、凍結置換後マイクロ波室温アセトンに四酸化オスミウム/thiocarbohydrazide を使用して拡張されたコントラストの処理します。我々 は有髄神経の脛骨と線虫マウスの高品質微細構造保全のため凍結高圧が必要なサンプルを表すにこれを示します。さらに、方法については、脱水、浸透後サンプルとして埋め込まれていると可能な限り小さなガレージを示した。8を埋め込むこの最小限の樹脂は興味の構造の高速ターゲット、およびイオンビームで関心領域を公開するために必要な以下の時間を含むサンプル処理に費やす時間を削減できます。さらに顕微鏡の中のサンプル準備の手順を実行した後画像とサンプルの加工は継続的に実施画像のスタックを取得します。3 D 可視化のため画像処理ソフト (技術) を使用して、データセットの部分を再構築します。
当社のワークフローでは、HPF と凍結置換による、最高の微細構造保全とサンプル ボリューム イメージングのための最も適切な対照的なを組み合わせてできる方法について説明します。これは厳密にクライオ準備を必要とする試料に対して効果的です。アプリケーションは、HPF で準備することができます小さなサンプルに制限されます。植物や微生物などの異なる性質のサンプルこのプロトコルには、適応が必要です。

<table><tbody><tr><td>Instrumentation</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Leica HPM100</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automatic Freeze Substitution</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory microwave with temperature control unit</td><td>テッド・ペラ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM ACE600 with gold target</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crossbeam 540</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハロゲンランプ 12 V / 20 W</td><td>オスラム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezing</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>M9</td><td>自家製</td><td></td><td>C. Elegans-A 実用的なアプローチ I.A.Hope</td></tr><tr><td>Hexadecene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52276</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2307</td><td></td></tr><tr><td>A タイプ キャリア</td><td>Wohlwend GmbH</td><td>#241</td><td></td></tr><tr><td>B タイプ キャリア</td><td>Wohlwend GmbH</td><td>#242</td><td></td></tr><tr><td>スリット キャリア</td><td>Wohlwend GmbH</td><td>#446</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック パスツール ピペット</td><td>VWR</td><td>612-1684</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>FST</td><td>11200-10</td><td></td></tr><tr><td>Freeze substitution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>科学サービス</td><td>10015</td><td></td></tr><tr><td>タンニン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>EMS</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ウラニル</td><td>SPI-Chem</td><td>02624-AB</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>EMS</td><td>10015</td><td></td></tr><tr><td>チオカルボヒドラジド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223220</td><td></td></tr><tr><td>Nunc CryoTubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7884-450EA</td><td></td></tr><tr><td>時計ガラス皿、150 mm</td><td>VWR</td><td>216-2189H</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>Durcupan 樹脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44610</td><td></td></tr><tr><td>Mounting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SEMスタブ</td><td>サイエンスサービス</td><td>E75200</td><td></td></tr><tr><td>Aclar</td><td>Science Services</td><td>50425-10</td><td></td></tr><tr><td>つまようじ濾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>紙</td><td>VWR</td><td>512-3618</td><td></td></tr><tr><td>導電性銀樹脂</td><td>EMS</td><td>12670-EE</td><td>EPO-TEK EE 129-4</td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image acquisition</td><td>Zeiss</td><td>SmartSEM</td><td></td></tr><tr><td>画像取得</td><td>Zeiss</td><td>Atlas5 A3D</td><td></td></tr><tr><td>画像処理</td><td>オープンソース</td><td>フィジー</td><td>http://fiji.sc/#download</td></tr><tr><td>画像可視化</td><td>オープンソース</td><td>IMOD</td><td>http://bio3d.colorado.edu/imod/</td></tr></tbody></table>

高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリューム イメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

説明サンプル調製法、集束イオンビーム ビーム走査電子顕微鏡 (FIB SEM) を取得するために使用のイメージ投射様相の最も適切なコントラストで微細構造の保存の最高の品質を結合する設計されています3次元形状復元とモデリングのための連続画像のスタック。凍結 (HPF) ネイティブの構造保持に近いがその後の凍結置換頻繁に高圧に対して行わないこと十分なコントラストは、特に 3 D に必要な SEM で高品質なイメージングに必要なより大きい標本復興。したがって、このプロトコルで凍結置換後追加の対照的な手順で実施されて部屋の温度。電子レンジでは、これらの手順を実行がまた長い培養時間を必要とする従来のベンチ処理に従うことです。樹脂の最小限の量でその後埋め込みより速くより正確なターゲットと FIB SEM 内準備このプロトコルは、信頼性の高い微細構造の保全のための高圧の凍結による準備を必要とするが SEM. FIB を用いたボリューム イメージングにおける凍結置換の間に十分なコントラストを得るかサンプルの場合に特に便利最小限の樹脂埋め込みと組み合わせて、このプロトコルは高品質ボリューム データの集録に効率的なワークフローを提供します。

(ここでは、新たに切り裂かれたマウス神経脛骨) サンプルのワークフローが開始される高圧凍結 (図 1 a) のための金属のキャリアに置かれています。キャリアは、液体窒素 (図 1 b) から回復し、冷凍最初化学カクテル (図 1 c) の上に凍結置換装置に配置されます。長い凍結置換プロトコル 2% の四酸化オスミウムと 0.1% の酢酸ウランを含む、室温 (図 1 d) でキャリアからサンプルが削除されます。コントラストをさらに高めるためには、サンプルは、(図 1e) 電子レンジで処理されるプラスチック チューブに転送されます。真空チャンバーと温度コントロール ユニットは、プロセス (図 1 f) を最適化するために使用されます。
つまようじとプラスチック フィルムのシートを必要最小限の樹脂埋め込みを実行することができるには、(図 2 a)。電子レンジを用いたレジンによるサンプルを浸潤後プラスチック フィルムの部分に配置、試料表面に樹脂が残っていないまで移動します。ハロゲン ランプは、残りの樹脂を排出し、プラスチックのフィルムに (図 2 b) 最小埋め込みサンプルを残すために使用されます。サンプルの上部から削除より多くの樹脂が良好であることに注意してください。少量の基板に接続するサンプルの下に残ってする必要がまだあります。重合プラスチック フィルムのサンプルをカットして銀導電性樹脂 (図 2 c) SEM スタブの上にマウントされています。60 ° c (図 2 d) 少なくとも 4 h のスタブを重合します。コンポーネントを徹底的に混合する必要があります。 または混合物可能性があります正しく重合していないので。走査型電子顕微鏡中充電を避けるため、スタブではスパッタ コーティング ゴールドまたはプラチナ/パラジウム (図 2 e)。
サンプルを FIB SEM に配置し、(図 3 a, e) の関心領域を対象とする二次電子検出器をイメージします。イオン ビームを使用して、断面 (図 3b-d 3f h) を公開する関心領域の前に直接材料を除去します。強化されたプロトコルを提供強力な膜コントラスト (図 3 c-d 3 g h) に対し標準プロトコルはしばしば膜コントラスト (図 3 b, f) の欠如から苦しみます。
(後処理) 後 EM データは、IMOD、イメージ処理およびプログラムのモデル化を使用して可視化します。、3次元情報の理解を達成するためにデータの仮想作成が使用されます (図 4 a)。データセットの異なる構造が手動で分割されます (図 4 bd)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig1.jpg"> 図 1: 高圧凍結・凍結置換・ マイクロ波処理します。(a) マウス神経脛骨を含むキャリアのサンプル、スケール 3 mm (b) サンプル キャリア高圧凍結、バー mm 3。 (c) 自動凍結置換 (AFS) 単位のサンプル後マウス神経脛骨を含むバー。Inset: 最大 23 サンプル瓶や AFS の化学物質を含む 2 つの大規模なバイアルの特注金属コンテナーです。(d) サンプルのアセトン、ガラス皿でキャリアから削除されるスケール バーの 3 mm. (e) 処理を電子レンジに入れられる反作用の管のサンプル。電子レンジの (f) 真空チャンバ、温度制御ユニット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig2.jpg"> 図 2: 最小限の樹脂を埋め込むと FIB SEM のための準備(スケール バー 4 cm。 (b) 神経脛骨がスケール バー 250 μ m (c) 顔面神経脛骨プラスチック フィルムに重合し、カットの SEM スタブ上部に取り付けられた、プラスチック フィルムの上にガレージの排水 a) プラスチック フィルム、最小限の樹脂埋め込み用つまようじ 銀の導電性樹脂、バーの 250 μ m (d) 試料の SEM のスタブは、スケールの上に重合スケール バー 3 mm. (e) SEM スタブ、スケールに金をコーティングしたサンプル 3 mm バー。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。</a> 。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig3.jpg"> 図 3: FIB SEM 内サンプルの準備(、および e)サンプルの FIB SEM 内二次電子像イメージングのため (a)顔面神経の脛骨筋、スケール バー 100 μ m. (e) c. の elegansスケール 2 μ m. (b d) と (f ・ h) 断面 ESB 検出器を用いたサンプルをバーの表面します。(b と c)顔面神経の脛骨筋、スケール バー 2 μ m. (f および g) c. の elegans、スケール バー 1 μ m および 200 nm。(b と f)他のすべての画像は、強化された凍結置換の結果を示すに対し、高圧凍結・凍結置換機能強化も結果は示しています。(d と h)ESB 検出器を用いたサンプルの詳細なイメージ。(d) 顔面神経脛骨、スケール バー 200 海里にあります。(h)線虫、スケール バー 200 海里にあります。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59156/59156fig4.jpg"> 図 4: 画像取得・視覚化します。(IMOD に示す a) EM データ事実上 x 断 z と y/z 平面規模の 2 μ m (b) 分割バー/EM データ (青)、レマック バンドル (赤)、髄鞘 (黄色とオレンジ)、ミトコンドリア (ターコイズ ブルー)、軸索は 2 μ m. (c と d) 3 d モデル、スケール バー 2 μ m、500 スケール nm。.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59156/59156fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

2 つのサンプル処理技術、高圧凍結を組み合わせることのためのプロトコルの紹介、マイクロ波試料処理は続いて集束イオンビームのビーム走査型電子顕微鏡 (FIB SEM) を使用してデータを取得するための埋め込み最小限の樹脂。マウス脛骨神経のサンプルと線虫を使用してこれを示します。

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

このサンプル調製技術は、最適な超構造保存と、集焦点イオンビーム走査型電子顕微鏡におけるイメージングモダリティに最適なコントラストを組み合わせるように設計されています。このプロトコルは、信頼性の高い超構造保存のために高圧凍結による調製を必要とするが、体積イメージングのための凍結置換時に十分なコントラストを得られないサンプルに特に有用である。最小限の樹脂埋め込みのためには、焦点を合わせたイオンビーム走査型電子顕微鏡で後で適切なターゲットを設定できるように、できるだけ多くの樹脂を除去することが不可欠です。まず、ピペットを使用して、カッティングマットに20%PVP PBSの1滴を滴下します。解剖されたネルバウス・チビアリスを液滴に浸します。メスを使ってサンプルの長さを2ミリメートルカットします。微小鉗子を使用して、深さ0.2ミリメートルのA型金属サンプルキャリアにサンプルを配置します。キャリアをカートリッジの中央プレートに移します。ヘキサデカンコーティングされたB型キャリアを蓋として上部に置きます。カートリッジの上半分を下げてアセンブリを閉じます。高圧冷凍庫のローディングステーションで3ピースカートリッジを閉じます。プロセスボタンを押して、製造元の操作手順に従って続行します。液体窒素の浴中で、凍結した0.1%タンニン酸とアセトンの2ミリリットルを含むクライオバイアルにサンプルキャリアを入れ、キャップを閉じます。クライオバイアルをマイナス90°Cに設定したフリーズ置換ユニットに入れ替えます。プログラムを起動し、100 時間そこにサンプルを保持します。凍結置換部では、2ミリリットルのアセトンを30分間3回洗浄します。0.1%の酢酸に2%オスミウム四酸化膜を冷却するための凍結置換ユニットに入れ、マイナス90°Cで染色を続けて7時間サンプルに加えます。凍結置換ユニットのプログラム温度がマイナス20°Cに達したら、サンプルをさらに16時間そこに保管してください。温度が摂氏4度に上がったら、バイアルの液体を捨てて純粋なアセトンを充填します。凍結置換ユニットからクライオバイアルを取り外します。凍結前およびオスモフィシング後のサンプル処理は、サンプルが深刻な損傷を受ける可能性があるため、非常に重要です。煙のフードでは、細かい鉗子を使用してクライオバイアルから金属キャリアを取り出し、サンプルをキャリアから移してアセトンで満たされた150ミリメートルの深い時計ガラス皿に沈めます。サンプルをアセトンで満たされた2ミリリットルの反応管に移す場合は、ファイン鉗子を使用してください。250ワットのマイクロ波を40秒間セットし、サンプルを洗浄して4回繰り返すように電子レンジを開始します。ピペット1%チオカルボヒドラジド溶液を反応管に1ミリリットル入れ、マイクロ波に入れる。2分と2分オフで真空機能をオンにし、合計14分間繰り返し、150ワットに設定します。電子レンジを起動します。前にしたようにアセトンでサンプルを4回洗浄します。ピペット2%オスミウム四酸化溶液を反応管に1ミリリットル入した。サンプルを電子レンジに入れ、チオカルボヒドラジドと同じ電子レンジ設定を使用します。前にしたようにアセトンでサンプルを4回洗浄します。25%の樹脂を反応管に1ミリリットル入れ、マイクロ波に入れる。真空機能を3分間オンにし、250ワットに設定します。電子レンジを起動します。爪楊枝を使用して反応管からネウバビアリスを取り出し、プラスチックフィルムの上に置きます。サンプルの近くにハロゲンランプを置き、樹脂を加熱します。爪楊枝を使用して、残りの樹脂が検出されないまで、プラスチックフィルムの上にサンプルを軽く押し回します。サンプルをオーブンの上に置き、温度を摂氏60度に設定して、サンプルを少なくとも48時間重合します。カミソリの刃を使用して、重合したサンプルをプラスチックフィルムと一緒にSEMスタブに合ったサイズで切り取ります。SEMスタブに導電性の銀樹脂を追加し、カットサンプルを取り付けるために爪楊枝を使用します。そしてサンプルのまわりに樹脂を加えます。オーブンにSEMスタブを入れて、少なくとも4時間または一晩摂氏60度で重合します。重合後、スパッタコーターにSEMスタブを配置します。スパッタコーターを35ミリアンペアに設定し、厚さ10ナノメートルの金のコーティングまたはコーティングを1分間塗布します。コーティング後、SEMスタブを集着したイオンビーム走査型電子顕微鏡の内部に置きます。本研究では、マウスのネルバシアリスとC.elegansの拡張プロトコルを実施し、焦点を合わせたイオンビーム走査電子顕微鏡で3D体積イメージングを行うための最適な保存とコントラストを示した。標準的なプロトコルは、多くの場合、強化されたプロトコルが強い膜コントラストを提供する膜コントラストの欠如に苦しんでいます。プロトコルと標準プロトコルが強化された C.elegans の断面画像は、独特の違いを示しています。ネルバシティシアリスの断面画像だけでなく、強化されたプロトコルは、標準的なプロトコルと比較してより強い膜コントラストを示すのに役立ちます。後処理後、画像処理・モデリングプログラムであるIMODを用いて電子顕微鏡データを可視化する。青でハイライトされた領域は、セグメント化された軸索を示します。赤くハイライトされた領域は、Remak バンドルを示しています。黄色とオレンジ色のハイライトされた領域は、ミエリン鞘を示しています。そして、ターコイズ色のハイライトエリアはミトコンドリアを示しています。仮想的な遺物と三次元モデルは、微細組織アーキテクチャを示し、その機能を理解するのに役立ちます。他の体積走査電子顕微鏡法は、シリアルブロック顔走査電子顕微鏡法やアレイ断層撮影法なども用いることができる。このプロトコルは、透過型電子顕微鏡や中枢神経系からのサンプルなどの他のサンプルタイプにも使用できます。四酸化オスミウム、チオカルボヒドロジド、酢酸ウラニルは有毒な化学物質であり、慎重に使用する必要があります。樹脂も有害であり、注意して使用する必要があります。手袋やラボコートなどの個人用保護具は、完全なプロトコルのために着用する必要があります。

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生物学

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高圧急速凍結、マイクロ波を用いたコントラスト強調、およびボリュームイメージングのために埋め込む最小限の樹脂による生体試料作製

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