レンチ ウイルスのベクトルの直噴ハイライト ラット脊髄における複数の運動経路
2019年3月15日
このプロトコルは、ラット脊髄組織への逆行性可搬型ウイルスのベクトルの注入を示します。ベクトルはシナプスでとらし、ターゲット ニューロンの細胞体に運ばれます。このモデルは、重要な脊髄経路またはターゲット細胞遺伝子治療用の逆行のトレースに適しています。
ウイルスベクターは、欠陥遺伝子を補うために細胞に遺伝物質を導入したり、重要な成長タンパク質をアップリデンスしたり、神経回路を追跡できるマーカーを製造することができます。神経系にウイルスベクターを導入することは、生来の生物学的障壁のために困難です。脊髄組織への直接注入はこれらの障壁をバイパスし、細胞体またはシナプスへのアクセスを可能にする。
L1からL4脊髄レベルを正しく標的にすることは困難です。ランドマークを使用してターゲットを検証し、これらのセグメントが T11 から T13 の椎骨にラインすることを覚えておくことが重要です。手順の日に、マイクロポンプにインジェクターを差し込み、マイクロポンプをバーニアスケールのマイクロマニピュレーターに入れる。
柔軟な針で注射器を使用して、色付きの染料をガラスの針の1つに慎重にロードし、ガラス針を注入器に挿入します。次に、針がワッシャーに正しく播種されていること、および注入器キャップがしっかりとねじ込まれ、スチールインジェクター針がガラス針の長さの約4分の3を延長していることを確認します。処置を開始する前に、少なくとも1マイクロリットル、および冷凍庫貯蔵からの注射あたりの少量の余分なウイルスを解凍し、麻酔下のラットにおけるつま先ピンチの応答の欠如を確認する。
腰から動物の肩甲骨の下角まで、後方の正中線に沿って剃り、より簡単かつ正確な剃剃りのために皮膚を引っ張り、露出した皮膚をシーケンシャルな5%ヨウ素と70%エタノールスクラブで消毒します。両眼に眼軟膏を塗布する。その後、動物を無菌の布の上に置き、膀胱の下にガーゼを置いて尿を採取します。
皮膚切開部位を特定するには、最後の肋骨で指を軽く押してL1椎骨を見つけます。この椎骨をランドマークとして使用し、メスでしっかりと押しながら穏やかに広げて皮膚を張り、数10の外科用ブレードを使用して、筋肉を露出させるためにL1に劣る3〜4センチメートルの皮付き切開を行います。スピンスプロセスを感じるために鉗子とはさみを使用してください。
小さなロストラルカットを行い、ラット歯の鉗子で上のプロセスにしっかりとつかむ余地を確保します。そして、可能な限りプロセスに近い2つの長い、深いカットを行います。所定の位置に横筋を固定した後, 彼らの頭の形状を決定するプロセスの周りの筋肉をクリア.
次に、ラミネクトミー部位を特定するために、棘の頭部の形状を可視化する。T11と結合T12およびT13プロセスは、ラミテクトミーの部位となる。標的領域が正しく特定されたら、椎骨を穏やかに広げて椎間靭帯を明らかにし、回転器を使用して脊椎のプロセスと脊椎の背側の側面を小さく噛みます。
正中血管が観察されるように、正中線から骨を取り除き、脊髄組織をはっきりと明らかにし、破片のない窓を残します。次に、安定した鉗子を亜染色体に固定し、静脈切除窓に尾状を固定し、動物を脊椎ホルダーに固定します。そして、呼吸の動きの効果を否定するために動物の腹部を上げます。
ウイルスをインジェクターにロードするには、解凍したストックの約5マイクロリットルをパラフィルムにピペットし、先端がドロップ内になるようにガラス針を配置します。マイクロポンプを使用して、毎秒20〜100ナノリットルの速度で最大4マイクロリットルのウイルスを取り出し、それがブロックされていないことを確認するために針先から少量のウイルスを放出する前に注入するようにコントローラを設定します。実験室のワイプで余分なウイルスを拭き取り、バーニアスケールが見えるようにマイクロマニピュレータを配置します。
針を脊髄の正中線に置き、マイクロマニピュレーターのバーニアスケールを使用して針を横方向に0.8ミリメートル向けます。その後、針を脊髄に下げて、穿刺しない硬膜を穿刺し、針の先端が1.5ミリメートルの深さまで沈むまで、針で硬膜を穿刺するために素早くねじった動きを使用します。針が所定の位置に入ったら、インジェクターをプログラムして毎分400ナノリットルの速度でウイルスを送達し、ウイルスが色素前線の進行を観察して脊髄に入っていることを確認します。
注射が終了したら、針を脊髄で2〜5分間休ませてウイルスの拡散を容易にし、次の注射部位でゆっくりと針を引き出す。最後の注射の後、脊髄のホルダーから動物を取り除き、横筋を広げるために使用されるあらゆる装置を除去することを可能にする。その後、4.0クロミックキャットグ縫合で筋肉を閉じ、9ミリメートルの巻きクリップで皮膚をホチキス止めします。
注射に成功してから4週間後、側の胸部脊髄の灰色物質内のニューロンに有意なGFP発現が観察され、注射に対するイプシラショナルである。白質では、特にプロプリオ脊髄軸索に典型的な領域において、イプシラショナルコードの軸索にGFP発現が認められる。灰色物質ニューロンの高倍率は、ニューロン細胞体および樹状突起における典型的なシグナル発現の例を明らかにする。
ニューロンにおけるGFP発現は、ポンチン網状形成中などの脳幹核においても観察することができる。脊髄注射術の成功の重要な要因は、正しい椎体標的化であり、ウイルスが組織に入っていることを保証するこの手順の前にrostral脊髄損傷が行われた場合、直接注射を使用して、傷害の周りの接続を再確立するニューロンを追跡することができる。
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概要
このプロトコルは、ラットの脊髄組織への逆行性に運搬可能なウイルスベクターの注入を実証し、神経回路のトレースと潜在的な遺伝子治療応用の可能性を示しています。この手順により、ベクターがシナプスで取り込まれ、標的ニューロンの細胞体に運搬されるようになり、脊髄経路への洞察を促進します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 遺伝子治療
- 神経解剖学
背景
- ウイルスベクターは欠陥遺伝子を補償し、細胞に遺伝物質を導入できます。
- 脊髄への直接注射は、効果的な標的化のための生物学的障壁を回避します。
- 脊髄レベルの正確な標的化は、成功した結果にとって重要です。
- 椎骨などのランドマークが外科的アプローチに役立ちます。
研究の目的
- 脊髄へのウイルスベクター注入の詳細なプロトコルを提供すること。
- 脊髄経路の逆行性トレースの可能性を示すこと。
- 遺伝子治療応用研究を促進すること。
使用した方法
- このプロトコルは、ラットの脊髄に直接外科的に注射することを含みます。
- 標的領域はL1からL4の椎骨レベルにわたり、正確な標的化のためにランドマークを使用します。
- 注射とモニタリングの特定のタイムラインでウイルスベクターを注意深く投与することの詳細が記載されています。
- 注射後の観察は、ニューロンにおけるGFPの発現に焦点を当てています。
主な結果
- 成功した注射は、隣接するニューロンと軸索にGFPの顕著な発現をもたらします。
- 明らかになった神経経路は、ウイルスベクターの逆行性運搬の有効性を示しています。
- GFPの発現パターンは、胸髄脊髄における標的化と取り込みの成功を示しています。
- 結論は、成功した応用のために正確な椎骨の標的化の重要性を強調しています。
結論
- この研究は、ウイルスベクターの脊髄注入のための信頼できる方法論を提供します。
- この手順は、ニューロンの接続性と潜在的な遺伝子治療戦略についての理解を深めます。
- 神経回路のトレースと特定のニューロン集団の標的化に意味を持っています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Direct spinal cord injection of lentiviral vectors enables targeted delivery of genetic material to specific neuronal populations, bypassing biological barriers that limit systemic approaches. This method supports mechanistic de-risking in target validation by allowing precise tracing of motor pathways such as rubrospinal and reticulospinal tracts. The approach provides predictive confidence in preclinical models by revealing neuronal connectivity patterns relevant to motor circuit function and repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracing specific spinal motor pathways and their interconnections.
- Operational Value: Provides a reproducible method for functional target validation through retrograde transport of viral vectors to neuronal cell bodies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying pathway engagement and neuronal uptake efficiency in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by defining neuronal targets with high anatomical fidelity.
- Operational Value: Ensures assay standardization through consistent viral delivery to propriospinal interneurons and brainstem nuclei.
- Scalability Value: Facilitates platform reuse across spinal cord segments and injury models for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates continuity from discovery to preclinical validation by mapping GFP expression in thoracic spinal cord and pontine reticular formation.
- Mechanistic De-risking: Highlights age-dependent integration patterns that inform risk-adjusted advancement decisions in neurodegenerative models.
- Predictive Confidence: Supports biomarker alignment by identifying neuronal populations that reestablish connections post-injury.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through lead optimization to preclinical validation, particularly for motor circuit disorders.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling retrograde tracing of spinal pathways to clarify motor circuit architecture.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized viral injection and quantitative GFP expression readouts in defined neuronal populations.
- Analytics: Provides quantitative measurements of transduction efficiency and axonal transport that help compare conditions across experimental groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by tracing neurons that reestablish connections around injury sites, informing repair mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for spinal cord targeting across multiple disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in spinal motor pathway engagement.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through landmark-based targeting and controlled viral delivery parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early biological de-risking of targets involved in motor circuit function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on neuronal uptake patterns and pathway-specific transduction efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent spinal surgery and microsurgical techniques for accurate vertebral targeting.
- Depends on microsyringe pumps, micromanipulators with vernier scales, and sterile surgical instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of viral titer, injection volume, and post-operative monitoring protocols.
- Involves adaptation considerations across rodent ages and injury models due to observed age-dependent integration into corticospinal tracts.
- Limited by the need for precise dorsal laminectomy and spinal stabilization to avoid tissue damage during needle insertion.
