高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験
2019年2月27日
血清中の抗体のShigellacidal活性を測定するためのプロトコルをご紹介します。血清は細菌培養、外因性の補足物と混合され、寒天版で反応混合物をメッキします。細菌はカウント、自動コロニー列挙子を使用して、殺菌力価を決定するために使用のコロニーを形成します。
シゲラ研究分野では、現在、免疫や感染によって生成される抗体の機能的役割を調べるための十分に定義されたアッセイが欠けています。このアッセイは、これらの免疫応答を修飾し、シゲラ特異的抗体の殺菌活性を測定するための明確に定義された方法を表す。このアッセイの主な利点は、複数のサンプルの高スループット分析が可能である点です。
このプロトコルで使用される技術は、抗体および血清サンプルの直接細菌の殺滅を測定するために、実践的な時間と全体的なアッセイ時間を大幅に短縮します。まず、56°Cの温水浴でサンプルを30分間加熱し、テストサンプルを活性化させます。アッセイプレートと20マイクロリットルのアッセイバッファーを1列から12行Aから12列まで取得し、各試験サンプルの列1および2列に20マイクロリットルのアッセイバッファーを追加し、アッセイプレートの行Hに複製します。
試験サンプルの三重の連続希釈を行う開始するには、マルチチャンネルピペットを使用して、ウェル3Hから12Hまでの10マイクロリットルを除去します。サンプルをG行とピペットの上下8~10回の対応するウェルに移し、サンプルをよく混ぜます。次に、これらのウェルから10マイクロリットルを取り除きます。
行Fとピペットの対応する井戸に8〜10回上下に移して混ぜます。行Aを通してこのシリアル希釈プロセスを続ける.行Aの井戸を混合した後、すべての井戸の最終容積が20マイクロリットルになるように、井戸3Aから12Aまでの10マイクロリットルを取り除いて捨てます。凍結対象細菌ストックのバイアルを1個取り出し、室温で解凍します。
次いで、20ミリリットルのアッセイバッファーで細菌を希釈します。所定の最適希釈係数に従って。マルチチャネルピペットを使用して、アッセイプレートの各ウェルに希釈細菌10マイクロリットルを加えます。
冷凍赤ちゃんウサギの賛辞の1バイアルと凍結熱活性化BRCの1バイアルを取得します。冷たい流水を使用してバイアルを室温まで解凍します。次に、100マイクロリットルの熱活性化BRCを400マイクロリットルのアッセイバッファーと混合します。
この20%の熱活性化BRC溶液の50マイクロリットルを列1のすべての井戸に加えます。天然BRCの1ミリリットルをアッセイバッファーの4ミリリットルと混合します。この20%の混合物の50マイクロリットルを2から12列のすべての井戸に加えます。
プレート1をプレートシェーカー1枚1枚10~15秒間置き、アッセイプレートを軽く混ぜます。微生物学的インキュベーターでアッセイプレートを2時間インキュベートします。一方、2つのLB寒天プレートから蓋を取り外し、プレートを生物学的安全キャビネットに40〜60分間置いて乾燥させます。
インキュベーションが完了したら、アッセイプレートを湿った氷に移し、10〜20分間インキュベートして反応を停止します。12チャネルピペットを使用して、LBAプレートの底に反応混合物の10マイクロリットルの行Hとスポットプレートのウェルを混合します。すぐにプレートを傾け、スポットが約1.5〜2センチメートルの間実行されるようにします。
行 G、F、および E に対して、前の行の上に配置して、この手順を繰り返します。溶液がLBAプレートに吸収されるまで、室温でLBAプレートをインキュベートします。その後、蓋をプレートに置き、それらを逆さまに微生物学的インキュベーターに移して一晩インキュベートします。
翌日、25ミリリットルのオーバーレイ寒天を摂氏55度で加え、1ミリリットルTTCあたり100マイクログラム、各LBAプレートに0.1%のアジドナトリウムを含む。生き残った細菌が赤い色を発達できるように、摂氏37度で2時間インキュベートします。次に、デジタルカメラを使用してプレートを撮影します。
画像をコンピュータに転送し、NISTの統合コロニー列挙ソフトウェアを使用して、テキストプロトコルで概説されているように画像を分析します。代表的なLBAプレートは、一晩のインキュベーションとオーバーレイの追加後に色の発達が行われ、生き残ったコロニーはすべて赤で見られることを示しています。細菌の殺傷は、最初の3つの希釈で試験されたすべてのサンプルについてはっきりと見られる。
細菌の殺死の減少は、サンプルがプレートのさらに上に希釈され、血清があまり濃縮されていないので見られる。マイクロコロニー数は、NISTソフトウェアを使用して実行されます。各サンプルの各希釈の平均 CFU カウントは、50% の強制終了値と同様に計算されます。
この50%の殺死値は、各血清希釈の平均CFUsに適用され、SBA KIの計算に必要な値を決定します。このプロトコルはLBオーガーの一貫した均一な細菌のめっきに依存する。良いスポットめっきおよび傾斜技術は離散的なマイクロコロニーおよび正確なコロニーの数えの成長を可能にする。この技術は、生きた毒性シゲラを使用し、適切な無菌技術とPPEを必要とし、細菌がBSL 2手順に従って安全に処理されることを保証する。
概要
この記事では、血清中の抗体によるシゲラ殺菌活性を測定するためのプロトコルを紹介します。この方法は、多数のサンプルを高スループットで分析し、シゲラ特異的抗体の殺菌活性を評価する際の作業時間を短縮します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 免疫学
- 微生物学
- 血清学
背景
- シゲラ研究分野では、抗体反応を検討するための定義されたアッセイが不足しています。
- このプロトコルは免疫反応を定量化し、殺菌活性を測定します。
- 複数のサンプルを効率的に分析することができます。
- BSL 2条件下で生きた強毒性のシゲラを使用します。
研究目的
- シゲラ殺菌活性を測定するための信頼性の高いアッセイを確立すること。
- 免疫化または感染からの免疫反応の評価を容易にすること。
- 作業時間を最小限に抑え、スループットを最大化する手法を提供すること。
使用方法
- 血清サンプルの熱活性化。
- 試験サンプルの3倍希釈による連続希釈。
- 希釈した細菌と補体を用いたアッセイプレートへの接種。
- 培養後の自動ソフトウェアによるコロニー数カウント。
主な結果
- 様々な希釈度における細菌殺傷の成功した測定。
- 培養後の生存コロニーの赤色による明確な可視化。
- CFU数の定量化と50%殺菌値の決定。
- アッセイの信頼性と効率性の実証。
結論
- このプロトコルは抗体機能を評価するための標準化された方法を提供します。
- シゲラに対する免疫反応の理解を深めます。
- 将来の応用にはワクチンの有効性研究が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
High-throughput Shigella-specific serum bactericidal assays (SBAs) address a critical gap in functional antibody evaluation for vaccine and immunotherapy development. By enabling robust, reproducible quantification of bactericidal activity, this assay supports predictive confidence in early discovery and translational research. Its standardized, scalable workflow enhances portfolio decision-making and risk-adjusted advancement for Shigella-targeted programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of functional antibody-mediated bacterial killing for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying immune effector function against Shigella.
- Facilitates comparative evaluation of candidate antigens or immunization strategies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, high-throughput platform for screening serum samples across multiple conditions.
- Delivers quantitative, reproducible outputs suitable for assay standardization and cross-lab comparison.
- Reduces manual labor and increases throughput using 96-well plates and automated colony counting.
Translational & Preclinical Research
- Enables assessment of functional antibody responses pre- and post-antigen exposure in preclinical models.
- Supports translational biomarker development by linking bactericidal titers to protective immunity.
- Facilitates continuity from discovery through preclinical validation for vaccine candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This SBA protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical evaluation, providing a standardized readout for functional antibody activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on antibody-mediated bacterial clearance and immune mechanism elucidation.
- Screening: Offers reproducible, quantitative bactericidal titers for candidate and cohort comparison.
- Analytics: Utilizes automated colony enumeration and 50% killing index calculations for robust data outputs.
- Translational Research: Aligns functional antibody measurements with preclinical and clinical immune response endpoints.
- Enterprise Reuse: Provides a scalable, transferable assay platform for multi-site and multi-program deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and functional immune response assessment.
- Operational Value: Streamlines workflows with automation, reducing labor and increasing sample throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing standardized, quantitative functional data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vaccine and immunotherapy candidates based on functional antibody activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, microbiology, and aseptic technique for BSL-2 pathogens.
- Needs access to 96-well plate handling, automated colony counting software, and microbiological incubators.
- Demands cross-team standardization for assay setup, plating, and data analysis.
- Adaptable to various serum sources and Shigella strains with protocol optimization.
- Live virulent Shigella use necessitates strict biosafety and PPE compliance.
