式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化
2019年3月7日
ここで表現し、可溶化、酵母を用いた SLC4 トランスポーター家族に相同性を有するいくつかの真核生物のホウ酸トランスポーターを浄化するプロトコルを提案します。ポリコームタンパク アセンブリの精製 homomeric タンパク質を評価する化学架橋法についても述べる。これらのプロトコルは、他の困難な膜タンパク質の合わせることができます。
下流の用途に十分な量の膜タンパク質を得るは、依然として重要な技術的課題です。このプロトコルは、均質性に複数の膜輸送タンパク質の精製を可能にする。この技術の主な利点は、サッカロミセス・セレビシエは、多くの主要な実験変数の最適化を可能にする膜タンパク質の時間と費用対効果の高い真核生物発現系であるということです。
ヒスチジンを含まない完全な補充選択的培地の50ミリリットルで、3つの形質転換酵母コロニーを接種することから始める。1分あたり190回転、摂氏30度で一晩インキュベーションのために酵母窒素ベースと2%グルコースを補充。翌日のカルチャを削除します。
分光光度計を使用して、600ナノメートルまたはOD 600で光学密度を決定します。500ミリリットルの培養培地を含む4つの2リットルフラスコをそれぞれ0.01のOD600に接種する。その後、細胞がブドウ糖のすべてを消費し、高密度に成長できるように、30°Cで毎分190回転で培養を30時間振ります。
ホウ酸トランスポーター発現を誘導するには、5 x酵母ペプトン培地の125ミリリットルを加え、16時間摂氏30度で毎分190回転で10%ガラクトースを補う。その後、遠心分離によって酵母細胞を収穫し、100ミリリットルの冷水でペレットを再懸濁します。渦巻きは、酵母ペレットを再懸濁し、ペレットを含むすべてのボトルでこれを行うために溶液を連続的に移す。
酵母膜を収穫するには、まず、1モルトリス11.25ミリリットル、0.45ミリリットルの0.5モルEDTA、100ミリモルPMSFの2.25ミリリットルを再懸濁細胞に加えます。225ミリリットルの最終体積に水を加え、450ミリリットルの金属ビーズを叩くキャニスターに細胞を移します。冷たい0.5ミリメートルガラスビーズで残りのボリュームを上げ、ローターでビーズのビーディングチャンバーを組み立てます。
チャンバーを氷浴に浸し、ライセートの過熱を防ぐために2分間の休憩時間で区切られた6つの1分間のパルスを実行します。最後のパルスの後、ガラス瓶にねじ込まれたプラスチック製の使い捨てボトルトップフィルターからろ過膜を取り外し、真空を適用しながらビーズビーディングチャンバーの内容物をアセンブリに注ぎます。その後、2つのxビーズ洗浄バッファーをチャンバーに加えて旋回し、ビーズに追加して洗い流します。
225ミリリットルの洗浄バッファーでビーズのビーディングチャンバーをすすいで、チャンバーの内容物でビーズを洗います。遠心分離によってリセートを収集し、膜の収集のための超遠心分離のためのポリカーボネートボトルに上清をデカント。超遠心分離の終わりに上清を捨て、膜の再懸濁液の約35ミリリットルで膜を再懸濁する前に、膜ペレットでボトルを秤量します。
ガラスDouncerに懸濁液を加え、その後、膜にホモジュネートのアリコートを均質化し、50ミリリットルの円錐管にしてマイナス80°Cの貯蔵を行います。空の遠心分離機ボトルの重量を量って、収穫された膜の質量を決定します。タンパク質の可溶化と精製のために、氷上のビーカーに膜1グラム当たり攪拌棒と150ミリグラムのDDMを加え、解凍した膜を膜再懸濁液の15ミリリットルの最終体積に再懸濁させ、膜1グラムあたり1ミリモルPMSFと20ミリモルイミダゾールを補う。
膜溶液をビーカーに加え、氷浴で1時間攪拌します。続いて非可溶化材料をペレットに遠心分離する。4°Cの冷たい部屋で、5マイクロメートルのシリンジフィルターを通して上澄み液をろ過し、1ミリリットル固定化ニッケル親和性カラムにサンプルをロードするために毎分1ミリリットルの流量に設定された蠕動ポンプを使用し、洗浄バッファーの10カラム体積でカラムを洗浄し、溶出バッファーでタンパク質を希釈する。
10 1ミリリットル分の分画で溶出物を収集する。収集したゲル分数を4〜20%Tris-Glycine SDSページゲルに加え、可溶化した溶解物と室温で分画を洗浄し、収集した分画を500マイクロリットル以下の体積に引き上げ、ベンチトップ遠心分離器のベンチトップ遠心分離器で500マイクロリットル以下の体積に引き上げます。0.2マイクロメートルのスピンカラムフィルターを介して濃縮タンパク質をフィルターし、S-200バッファで平衡化されたサイズ排除カラムに濾過物を注入します。
2番目の4〜20%Tris-Glycine SDSページゲルでピーク画分を実行した後、ゲルを染色し、ちょうど実証したように摂氏4度で50キロダルトンカットオフ濃縮器に濃度のための純粋なピーク画分を収集します。次に、280ナノメートルの波長でタンパク質サンプルの吸光度を測定し、サンプルを80°Cの陰度で無期限に保存する前に濃度を測定します。グルタルアルデヒド架橋アッセイを実行するには、まず、解凍したタンパク質の1ミリリットル当たり0.5ミリグラムをS-200バッファーの3マイクロリットルに加え、S200バッファーの5マイクロリットルに添加します。
20%ドデシル硫酸ナトリウム1マイクロリットルと1.5%グルタルアルデヒドの1マイクロリットルを添加して、陰性対照反応を完了します。1マイクロリットルの水と1.5%グルタルアルデヒド1マイクロリットルを添加して、実験サンプルを完成させます。室温で30分後、3x SDSページゲルローディングダイの5マイクロリットルで反応を終了させ、過剰なトリスバッファーを含み、グルタルアルデヒドをクエンチし、溶液の15マイクロリットルすべてを4〜20%Tris-Glycine SDSページゲルにロードします。
次いで、染色前に200ボルトでゲルを30分間実行し、変性モノマーの2倍の大きさで走るバンドによって証明されるように、ダイマー架橋の程度を決定する。ゲルにゲル染色を加えた低速軌道シェーカーで振ってゲルを汚す。ここでニッケル親和性クロマトグラフィーから排除された分画の典型的なゲルは、溶解物の画分を有する3つの部分的に精製されたタンパク質を示し、十分に発現しないタンパク質に対して期待されるようにホウ酸輸送体に相当する有意なバンドを実証していない。
各ゲルのアドミリモル洗浄レーンは、比較的高いエミッタの古い濃度にもかかわらず、10個のヒスチジンタグ付きタンパク質の損失を最小限に抑えることを示しています。ホウ酸トランスポーターに対応するバンドは、排除された分数で容易に明らかである。S200カラム注入の前に、各サンプルの余分なバンドによって示されるように、タンパク質は多くの下流アプリケーションのために不十分に精製されます。
しかし、サイズ排除カラムへの注入後、高純度の分画を排除することが観察される。架橋は、精製されたホモメリックトランスポーターが互いに近接するリジン残基の数に依存する架橋の程度で容易に溶液中のアセンブリを持つことができることを示す細胞収穫が始まると、タンパク質は常に冷たく保たなければならないことを覚えておくことが重要である。4°Cの部屋で氷の上に、またはデリケースのいずれかで。
この手順に従って、膜タンパク質は、X線結晶学またはクライオ電子顕微鏡を含む生物物理学的、生化学的または構造的方法によってさらに特徴付けることができる。均質なタンパク質のミリグラム量の精製を可能にすることによって、これらの技術は、シロイヌナズナ1輸送体の結晶構造を決定するために使用された。
概要
この記事では、酵母を用いて真核生物のホウ酸塩トランスポーターを表現、溶解、精製するためのプロトコルを提示しています。また、精製されたタンパク質の多量体組立を評価するための化学的架橋アッセイも含まれています。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- 膜タンパク質研究
背景
- 膜タンパク質は十分な量で精製することが困難です。
- 酵母は真核生物の効果的な発現システムとして機能します。
- 実験変数の最適化は、タンパク質発現の成功に不可欠です。
- 架橋アッセイはタンパク質の組立を評価するのに役立ちます。
研究の目的
- ホウ酸塩トランスポーターを精製するための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 膜タンパク質組立の研究を促進すること。
- 他の膜タンパク質に適応可能な方法を提供すること。
使用した方法
- 選択培地における形質転換酵母コロニーの接種。
- ガラクトースによるタンパク質発現の誘導。
- DDMを用いた膜の回収とタンパク質の溶解。
- ニッケル親和クロマトグラフィーおよびサイズ除外クロマトグラフィーによる精製。
主な結果
- ホウ酸塩トランスポーターの同質性への精製の成功。
- 架橋アッセイによる多量体組立の証明。
- 様々な膜タンパク質に適応可能なプロトコルの確立。
結論
- このプロトコルは真核生物の膜タンパク質を研究するための堅牢な方法を提供します。
- 架橋アッセイはタンパク質相互作用の評価に効果的です。
- 酵母は膜タンパク質研究に貴重なツールです。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Expression and purification of eukaryotic membrane proteins remain a bottleneck in target validation and structural biology efforts. This protocol enables milligram-scale production of homogeneous borate transporters using a cost-effective yeast expression system, supporting downstream biophysical and functional assays. The approach enhances predictive confidence in early discovery by providing reliable access to challenging targets for mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transporter function and oligomerization state for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible yeast-based platform for expressing eukaryotic membrane proteins at scale.
- Predictive Value: Supports assessment of multimeric assembly via crosslinking, informing target druggability and mechanism of action.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified protein suitable for ligand-binding and functional assays.
- Operational Value: Delivers detergent-solubilized, monodisperse protein preparations compatible with biophysical screening.
- Assay Readiness: Enables standardization of purification workflows across borate transporter homologs from plant, yeast, and fungal sources.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates structural studies that inform inhibitor design and selectivity profiling.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of protein-protein interactions and conformational states relevant to physiological function.
- Preclinical Model Support: Provides material for characterizing transporter activity in disease-relevant contexts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target expression to lead identification, enabling progression from molecular target validation to mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports cloning, expression, and initial characterization of eukaryotic membrane targets.
- Screening: Produces purified protein for assay development and compound screening campaigns.
- Analytics: Yields quantitative outputs via crosslinking and size-exclusion chromatography to assess purity and oligomerization.
- Translational Research: Connects expression data to structural insights for target-based drug design.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable platform for purifying diverse eukaryotic membrane proteins across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation success rates by enabling structural and functional studies of difficult-to-express proteins.
- Operational Value: Reduces time and cost associated with membrane protein production through optimized yeast expression and purification.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable biophysical data on target behavior.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on structural and mechanistic feasibility.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast culture, membrane isolation, and detergent-based solubilization.
- Depends on access to ultracentrifugation, nickel affinity, and size-exclusion chromatography systems.
- Necessitates standardized protocols for crosslinking and SDS-PAGE analysis across teams.
- Involves optimization of expression conditions (e.g., galactose induction) for different transporter homologs.
- Limited by the inherent instability of some membrane proteins post-solubilization, requiring careful handling at 4°C.
