Name: コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: 学ぶカーネルスクリーニングアッセイでAspergillus flavusの生育とアフラトキシン産生を解析する方法。GFP発現株を用いてトウモロコシの感染動態をリアルタイムでモニタリングし、抗真菌タンパク質の効果を評価します。

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デビッド Meints、アーカンソー大学の開発と初期世代の中に遺伝子組み換えトウモロコシを分析の彼の援助に感謝いたします。この仕事は、USDA-ARS クリス プロジェクト 6054-42000-025-00D の金融サポートを受け取った。商号またはこの資料の商用製品の言及は固有の情報を提供する目的は、勧告または米国農務省によって承認とは限りません。米国農務省アルス ' 平等雇用機会均等政策すべての人に平等な機会を義務付けし、代理店の人事政策、プラクティス、および操作のすべての面で差別を禁止します。

1 プラスミドの構造とトウモロコシの変換
<ol><li>PCR 増幅フジマメ属AILP 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'と 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3' プライマーを使用して挿入します。PCR 条件を含める 30 98 ° C で初期変性ステップ 10 98 ° C で変性続いて s (ステップ 1)、s (手順 2)、30 55 ° C で熱処理 s (ステップ 3)、延長 20 の 72 ° C、s (ステップ 4)、ステップ 2 からステップ 4 の 31 のサイクル、と私は、 pst ファイル、最終伸長は 72 ° c で 5 分間Xbaを使用してベクトルの変更された pCAMBIA 1,300 に PCR の製品をクローン ステップ私制限のサイト。最終工場キャスト先のベクトル方向とベクトルでクローン化したAILP遺伝子のシーケンスを確認するシーケンスします。</li>
	<li>以前説明した16としてアグロバクテリウムひずみ EHA101 最終的なベクトル構造 (図 1) を変換します。</li>
	<li>アグロバクテリウム植物キャスト先のベクトルを含む未熟なトウモロコシ (Zea mays l. こんにちは II) 胚 (アイオワ州立大学植物変換施設で実行されます) を変換するために変換された使用16。</li>
	<li>温室効果 (26-29 ° C; 高圧ナトリウム ランプを添加した 16/8 h 日長) T0植物を育てるし、形質転換形質 homozygosity を達成するために T6世代を取得する繰り返し自家受粉します。</li>
</ol>2. 胞子発芽アッセイ
<ol><li>葉のサンプルを収穫し、-80 ° C で保存乳鉢と乳棒を使用して液体窒素と葉のサンプルを挽きます。2 mL マイクロ遠心チューブ用で 0.5 g を量り、プロテアーゼ阻害剤、17 μ L を追加し、氷の上チューブを置きます。</li>
	<li>16,000 x gで 10 分間のチューブを遠心します。0.5 mL の遠心管に植物エキスの 225 μ L を転送し、氷の上に配置。</li>
	<li>15 mL 遠心管でコウジカビ flavus 70-1% ジャガイモ ブドウ糖液 (w/v) GFP の 5 mL 胞子懸濁液を準備します。渦と、haemocytometer と 10 の5胞子/mL に胞子濃度を調整します。 注意: A. flavusはアフラトキシンを生成する、この菌で作業をすべては、生物学的安全キャビネットで 。</li>
	<li>文化が胞子発芽胞子の隆起によって示されるように 50% 開始を達成するまで、28 ° C で PDB 内インキュベートします。</li>
	<li>渦と 225 μ L 工場に分注 25 μ L 胞子ソリューションを抽出します。断続的な揺れの 28 ° C で 20 時間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>胞子液顕微鏡スライドとメジャー生殖の長さ 25 μ L 分注チューブ デジタル カメラ ソフトウェアを使用しての胞子です。各ラインの 20 レプリケート測定値の最小値を使用します。 注: この段階では、カウントする準備が整うまでコロニー成長を止めることの 4 ° C ですべての文化を配置します。</li>
</ol>3. カーネル スクリーニングアッセイ (サウジアラビア)
<ol><li>4 スナップ キャップ (22 mm) 60 × 15 mm のペトリ皿を接着してサウジアラビア キャップを構築します。キャップを使用する前に 48 時間乾燥して接着剤を許可します。サウジアラビア cap ごと次々 (図 2) を構成します。</li>
	<li>無菌生物学的安全キャビネット、70% エタノール: H2O (v/v) 正方形のバイオアッセイ トレイ (24 cm × 24 cm) をスプレーし、空気乾燥してみましょう。滅菌の濾紙をトレイに追加します。9 サウジアラビア キャップを 70% エタノール スプレー、空気乾燥とバイオアッセイのトレイに配置してみましょう。</li>
	<li>遺伝子組換えトウモロコシ、各ラインのテストされている 20 破損していないカーネルを選択し、50 mL の遠心管に配置します。70% エタノールを加えて 4 分間座ってみましょう。滅菌中のチューブを軽く振る。3 回滅菌脱イオン H2o. でエタノールとリンスのカーネルを注ぐ</li>
	<li>コウジカビ flavus 70-6 日間の古い文化から GFP17 V8 培 (5 %v8 ジュース、2% 寒天、pH が 5.2) の胞子懸濁液を準備します。<ol>
<li>20 mL 滅菌 0.02% トリトン X 100/脱イオン H2O (v/v) を追加し、滅菌ループを持つ胞子をスクラップします。接種と 300 mL 滅菌ビーカーに場所をピペットで移しなさい。</li>
		<li>0.02 5-fold 希釈を準備 % トリトン X-100、haemocytometer と胞子カウントを行います。4 x 106胞子/mL の濃度で 100 mL を取得する必要に応じて再度希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>攪拌棒滅菌 300 mL ビーカーにカーネルを配置します。接種をビーカーに加えます。 注意: 接種にカーネルを追加するスプラッシュへの解決策になります。3 分間撹拌プレートにビーカーを置きます。3 分後に、空のビーカーに接種を注ぐ。</li>
	<li>バイオアッセイ皿 (1 カーネル/キャップ) カーネルを配置、鉗子を使用して、します。30 mL 各生物検定トレイの底には、純水し、7 日間, 暗闇の中で 31 ° C で追加します。</li>
	<li>写真撮影のためのカーネルを準備します。<ol>
<li>顕微鏡分析、写真撮影のために、各行から 4 のカーネル置いておきます。 注: カーネルは、もはや写真を完了する前に 5 日間以上のための 4 ° C で保存できます。</li>
		<li>A. flavus (図 3) 接種の 7 日後に、カーネルの写真を撮る。</li>
		<li>軟部組織と脱イオン水でカーネルのきれいな外観です。カーネルの縦断を実行し、すぐに蛍光顕微鏡下で写真を撮る。</li>
	</ol>
</li>
	<li>分析用のカーネルを準備します。<ol>
<li>軟部組織と脱イオン水で残りのカーネルのきれいな外観です。</li>
		<li>場所 4 カーネルでは、15 mL スクリュー キャップ ポリカーボネートで、1 担当者を構成するバイアル含む 2 ステンレス鋼球です。すぐに液体窒素、-80 ° c 店でバイアルを凍結処理・解析まで。</li>
		<li>-80 ° C のフリーザーからバイアルを外し、3 分間、1,500 rpm でホモジナイザーでカーネルを挽きます。 注意: カーネルを液体窒素で凍結します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 遺伝子組換えトウモロコシの PCR のスクリーニング
<ol><li>DNA 抽出用キットを使用して、 A. flavus製造元の指示に従って感染粉砕トウモロコシからゲノム DNA (gDNA) を分離します。簡単に言えば、粉砕のトウモロコシの 10-15 mg 280 μ L バッファー F、20 μ L プロテアーゼ 3 μ L ジチオトレイトール (DTT) を追加します。孵化させなさい、(56 ° C、1,200 rpm, 30 分) thermomixer で振る。1 分の 10,000 × g で遠心分離し、明確な上澄みを釣合い列に転送します。3 分および gDNA を溶出する 1分間 700 × gで遠心するため室温で孵化させなさい。</li>
	<li>0.8 μ L の PCR キットを使用して各サンプルの 20 μ L の PCR 反応を設定する抽出された gDNA を取る。製造元のプロトコルで推奨されているサイクル条件に従います。PCR 条件を含める 5 98 ° C で変性が続く 5 分 (ステップ 1) 98 ° C で初期変性ステップ s (手順 2)、5 55 ° C で熱処理 s (ステップ 3)、延長 20 の 72 ° C、s (ステップ 4)、ステップ 2 からステップ 4 の 40 のサイクル、と 72 ° c 1 分 (ステップ 5) 最終的な延長のステップ。</li>
	<li>前方プライマー 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3 を使用して、' 逆プライマー 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3、' フジマメ属AILPの存在を確認する遺伝子組換えトウモロコシの遺伝子。</li>
</ol>5. RNA の隔離、cDNA 合成と半定量的 RT-PCR
<ol><li>均質化を取るA. flavus感染-80 ° C、RNA の抽出に以前格納されているトウモロコシ。トータル RNA 分離キット製造元のプロトコルによると、わずかな修正18を使用して RNA を抽出します。抽出バッファーで均質化されたトウモロコシ カーネル粉末 50 mg を追加した後も (ボルテックス) なしで 1 mL ピペット チップを使用してそれをミックスしておきます氷の上進む前に 5-6 分以降の手順を製造元のプロトコルで説明されているよう。</li>
	<li>製造元のプロトコル18によると cDNA 合成キットを使用して cDNA を準備します。</li>
	<li>以前説明した18として半定量 RT-PCR のため 0.5 μ L の PCR 反応あたり原液 cDNA を使用します。前方および逆プライマー qAILP F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3 の使用 ' と qAILP-R は 5'フジマメ属 AILPの遺伝子発現を検出し、前方および逆引きプライマー qRib F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ と qRib-R にそれぞれ 3' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA -トウモロコシ リボソーム構造遺伝子 (リブ) GRMZM2G02483819の家は維持遺伝子としての表現のためにそれぞれ 3ʹ 5ʹ TCAGTCCAACTTCCAGAATGG</li>
</ol>6. GFP 定量
<ol><li>各 0.2 M 塩基性リン酸ナトリウム (NaH2PO4) と 0.2 M 塩基リン酸ナトリウム (Na2HPO4·7H2O) 脱イオン H2o. の 50 mL を準備します。</li>
	<li>100 mL pH 7.0 ソレンソン リン酸バッファーを構成します。PH 7.0, 追加 19.5 mL NaH2PO4株、30.5 mL4NaHPO ·7H2O 株式と 50 mL の脱イオン H2o.</li>
	<li>25 mg 地面カーネル素材 (新鮮な重量、FW) 重量を量り、1.0 mL 遠心チューブに配置します。遠心管と 30 の渦に 500 μ L リン酸バッファーを追加 s。</li>
	<li>16,000 x gで 15 分遠心分離機のサンプル。黒 96 well プレートにピペット 100 μ L 清。蛍光光度計 (励起 485 nm、発光 528 nm) とサンプルを読みます。</li>
</ol>7. 総アフラトキシン分析法
<ol><li>サンプルの処理とアフラトキシンの抽出<ol>
<li>60 ° C で 2 日間の強制空気オーブンで乾燥カーネル サンプルサンプルの重量を量る、50 mL のガラス栓付け三角フラスコに配置します。</li>
		<li>発煙のフード各フラスコに 25 mL の塩化メチレンを追加します。 注意: 塩化メチレンは非常に揮発性と有害 (刺激、発ガン性物質) であります。ラテックスもニトリル手袋は、塩化メチレンの使用に対して安全です。改良された有機溶媒耐性ポリビニル アルコール手袋を使用します。</li>
		<li>手首のアクション シェーカーで 30 分間試料を振る。30 分後ゆっくりと 80 mL ビーカーにフルーティングを施されたフィルター ペーパー サークルを通じて抽出液を注ぐ。ヒューム フードのビーカー一晩乾燥をしましょう。</li>
		<li>次の日、噴出中を塩化メチレン (約 5 mL) 乾燥ビーカーのリム、周り旋回、2 dram ガラス瓶に注ぐ。発煙のフードで一晩乾燥させる残すバイアルを開きます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アフラトキシン分析法<ol>
<li>4.0 mL 80% メタノールを追加: H2O (v/v) バイアルに純水します。</li>
		<li>フィルターするアフラトキシン抽出キットを使用は、指定された列のメタノール溶液を浄化します。製造元の指示に従って、蛍光光度計の総アフラトキシン レベルを分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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著者は利害の対立があります。

病原体や害虫による農作物の収量の損失は、地球規模の問題20です。現在、合成殺菌剤と殺虫剤のアプリケーションが制御する植物病原菌や害虫のための有力な手段が、これらの発酵食品や飼料中の残留毒性は人間と動物の健康21に深刻な脅威を提起できます。食品と飼料作物としてトウモロコシの経済的重要性を考えるの削減やアフラトキシン汚染の除去は最も重要な2,3,22のです。時間のかかるプロセスであり、そのような抵抗は常に不安定なアフラトキシン抵抗はポリジーン形質と参加している遺伝子の発現が大きく異なる罹病性品種に抵抗性遺伝子遺伝子浸透を通じて従来の育種環境パラメーター4の変化。代替的なアプローチが増加し、環境にやさしい方法で行ったところ Aに対するホスト植物防御の安定評価されます。
<p class="j...

真菌属、アルテルナリアペニシリウム、フザリウム麹菌によるマイコトキシン汚染食品の主要な問題は、飼料作物栽培世界中1,2,3.これらの植物病原性菌の中で麹菌がトリミングの値と人間や動物の健康に及ぼす悪影響最高です。コウジカビ flavus(A. flavus) は、トウモロコシ、綿、ピーナッツなどのオイル豊富な作物に感染する、強力な発ガン性物質アフラトキシン、多数の有毒な二次代謝産物 (SMs) を生成日和見植物病原体です。トウモロコシの重要な食糧は、世界的な栽培作物をフィードし、 A. flavusによる汚染に非常に敏感であります。アフラトキシン汚染の経済的影響を失うとトウモロコシの減少値が地球規模の気候に限り $ 6 億 8660 万/年の米国2予測の変更をすることができます、アフラトキシンの影響とトウモロコシの大きな経済的損失につながる近い将来2に $ 16 億 8000 万/年として、高い見積もり。人間や家畜にアフラトキシンの経済と健康の悪影響を考えると、トウモロコシの収穫前アフラトキシン コントロールは食品のアフラトキシン汚染を防止し、飼料製品を最も効率的な方法かもしれない。
最後の数十年間で広く使用されているトウモロコシのアフラトキシン抵抗の主要な収穫前コントロール アプローチは、4時間のかなりの量を必要とする繁殖を中心にです。最近、生物的防除は、大規模なフィールド アプリケーション5,6アフラトキシン削減いくつかの成功を収めています。生物的防除、ほか 『 ホストによる遺伝子サイレンシング 』 (HIGS) を RNAi など最先端の分子ツールのアプリケーションと耐性関連蛋白の遺伝子組換え発現は、 A. flavusの生育とアフラトキシンの削減にいくつかの成功を収めています。小規模な実験室とフィールド研究の生産。これらのアプローチは、今後の操作のための新しい潜在的なA. flavus遺伝子ターゲットを識別する作業に加えて現在最適化されています。
初期段階の間に成功した病態とマイコトキシンの生産を維持するために重要な役割を再生するマイコトキシン産生遺伝子制御戦略の潜在的なターゲットとしてプロセスに直接かかわる遺伝子以外にも真菌アミラーゼが示されています。ホスト植物の感染。いくつかの例を含めるPythium pleroticum (ショウガ根茎腐敗病菌)、新称(カリフラワー病の病原)、α-アミラーゼと病原性の発現と活性と正の相関関係がを認められました。7,8。遺伝子ノックアウトまたはノックダウン アプローチを通じての α-アミラーゼ活性の阻害は、真菌の成長および毒素生産悪影響を与えます。A. flavusの α-アミラーゼ欠損株では、澱粉基板または degermed トウモロコシ9上に成長した場合、アフラトキシンを生成できませんでした。同様に、フザリウム関係でノックアウト、α-アミラーゼのひずみはトウモロコシ10の感染中のフモニシン B1 (マイコトキシン) を生成する失敗しました。最近の研究でギルバートら (2018 年) を示した HIGS を行ったところ A α-アミラーゼ式の RNAi によるノックダウンがトウモロコシ カーネル感染11 A. flavusの生育とアフラトキシン生産を大幅に削減.
Α-アミラーゼの発現のダウンレギュレーションをから得られる、同様の結果を作り出したの α-アミラーゼ活性の特異的阻害剤も。カビ抵抗性の α-アミラーゼ阻害剤の役割の最初のレポートは、分離・ A. flavus12に抵抗力があるトウモロコシ系統から 14 kDa のトリプシン-α-アミラーゼ阻害剤の同定から来た。さらにヒヤシンス豆、フジマメ属液体l.13の種子から Fakhoury と 36 kDa の α-アミラーゼ阻害剤のようなタンパク質 (AILP) の同定につながった Woloshuk によって植物種の数百のスクリーニング。レクチン-arcelin-α - アミラーゼインヒビターの家族に属しているに似ている AILP レクチンのペプチッド シーケンスは共通豆14,15を報告しました。精製 AILP は、哺乳類のトリプシンとさらに体外評価A. flavusの成長と胞子の発芽13, 有意に阻害を示した方はまったく阻害活性を示しません。報告書ここではっきりショー α-アミラーゼとして使用できる病原体または澱粉 (α - アミラーゼ) を動員と中にエネルギー源としての糖の獲得に依存する害虫を制限する制御アプローチでターゲットの宿主植物と病原菌の相互作用。
Α-アミラーゼは、 A. flavus病原性9,10、11、として強力な抗 -A. flavusエージェント (α-アミラーゼ阻害/antigrowth)13AILP の重要性を考えると重要なことに知られています。フジマメ属AILPを表現する遺伝子組換えトウモロコシ植物を生成した構成 CaMV 35S プロモーター遺伝子。目標は、トウモロコシのこの α - アミラーゼインヒビターの異種発現トウモロコシ カーネル感染時にA. flavus病態とアフラトキシン生産に対して有効である場合、調査することでした。大幅 AILP を表現する遺伝子組換えトウモロコシがカーネル感染時にA. flavusの生育とアフラトキシン生産を減らしたことを示した。

<table><tbody><tr><td>寒天</td><td>ケーソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アメージング マリン グープ</td><td>エクレクティック プロダクツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 タッチ CFX96 リアルタイム システム</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コーニング&nbsp;Falcon Tissue Culture Dishes, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp;5424 微量遠心分離機</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr>ック <tr><td>三角フラスコ ストッパー付き、50 mL</td><td>エース ガラス</td><td>6999-10</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フルオロクオン アフラ</td><td>ローマー ラボ</td><td>COKFA1010</td><td></td></tr><tr><td>溝付き定性的濾紙サークル、15 cm</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>09-790-14E</td><td></td></tr><tr><td>フォース エア オーブン</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FQ-Reader</td><td>Romer Labs</td><td>EQFFM3010</td><td></td></tr><tr><td>Geno/Grinder 2010</td><td>OPS Diagnostics</td><td>SP 2010-115</td><td></td></tr><tr><td>Improved PolyVinylAlcohol Organic Solvent Resistant Gloves</td><td>Ansell</td><td>012-15-554</td><td></td></tr><tr><td>Innova 44 Incubator Shaker</td><td>Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>低形態グリフィンビーカー、100 mL</td><td>DKW ライフサイエンス</td><td>14000-100</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td>塩化メチ<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>レン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexttec 植物用1ステップDNA分離キット</td><td>Nexttec</td><td>47N</td><td></td></tr><tr><td>ニコン Eclipse E600顕微鏡、ニコンDS-Qi1カメラ</td><td>付き ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニコン SMZ25 実体顕微鏡 C-HGFI エピスコピック イルミネーターと Andor Zyla 4.2 sCMOS カメラ</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc Square BioAssay ディッシュ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>フィア プラント ダイレクト PCR キット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>F130WH</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート バイアル、15 ml</td><td>OPS 診断</td><td>PCRV 15-100-23</td><td></td></tr><tr><td>ポテトデキストロース ブロス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スナップ キャップ、22 mm</td><td>DKW Life Sciences</td><td>242612</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性七水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム モノ塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrum Plant Total RNA Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼研削ボール、3/8''</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 375-1000-02</td><td></td></tr><tr><td>攪拌プレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シナジー 4 フルオロメーター</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>V8 juice</td><td>Campbell's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-820P</td><td></td></tr><tr><td>手首アクションシェーカー</td><td>バレルサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

食品及び飼料作物のアフラトキシン汚染は、世界中の主要な課題です。アフラトキシン、病菌Aspergillus flavus (A. flavus) は、トウモロコシと人間や動物の健康に深刻な脅威のポーズ以外にもピーナッツのような他の石油の豊富な作物作物の値を大幅に削減する強力な発ガン性物質です。従来の育種、遺伝子組換え発現の抵抗性関連蛋白質と RNA 干渉 (RNAi) など、さまざまなアプローチ-重要なA. flavusのホスト-誘導性遺伝子のサイレンシングを用いた遺伝子ターゲットが増加する評価されて影響を受けやすい作物でアフラトキシン抵抗。過去の研究では、α-アミラーゼこの遺伝子・酵素を示唆、 A. flavus病態とアフラトキシン生産の重要な役割は、 A. flavusの生育とアフラトキシン生産の両方を削減する潜在的な目標を示しています。この点で、現在の研究は、 A. flavusに対するトウモロコシのフジマメ属液体l. の α-アミラーゼ阻害剤のようなタンパク質 (AILP) の (構成 CaMV 35Sプロモーターの制御) の下で異種の式を評価する行われました。AILP A. flavus α-アミラーゼ酵素の競合阻害であり共通の豆のレクチン-arcelin-α-アミラーゼ阻害剤タンパク質ファミリーに属する 36 kDa 蛋白質であります。現在の仕事の前に、in vitro 試験は、 A. flavus α-アミラーゼ活性と真菌の増殖の抑制における AILP の役割を発揮していた。真菌の成長および成熟したカーネルでアフラトキシン生産は、gfp 発現するA. flavusひずみを使用してリアルタイムで監視されました。このカーネル スクリーニングアッセイ (サウジアラビア) を非常に簡単に設定し、感染症・定量化することができる広がりの程度遺伝と形質転換線の評価のため信頼性が高く、再現性のあるデータを提供します。GFP のひずみから蛍光が密接に相関する真菌の成長、延長によって、それはアフラトキシンの値に相関関係にあります。 現在の仕事の目標は、アフラトキシンの抵抗を増加するためにトウモロコシのような商業的に重要な作物でこの前知識を実装することでした。我々 の結果は、AILP を表現する遺伝子組換えトウモロコシのカーネルではターンでは、アフラトキシンの 62-88% 減少に翻訳するA. flavus成長 35-72% 減少を示します。

トウモロコシの変換と遺伝子組換え植物の分子のスクリーニング
フジマメ属液体 AILP発現 CaMV 35Sの制御の下で最終的な工場先ベクターを含むアグロバクテリウムEHA101 ひずみを用いたトウモロコシのやあ II 系統の未熟胚が変形しました。プロモーター。5 独立して変換されたトウモロコシ系統 T6 世代その後の研究のために高度であった。遺伝子組換えトウモロコシ植物ははるかに小さいとより積極的なが同質遺伝子陰性対照の植物に比べて他の異常を示さなかった。AILPの標的遺伝子の PCR 増幅を示した 548 bp の増幅、制御植物 (図 4 a) と比較して遺伝子組換えトウモロコシ系統でのみ観測されました。コントロール植物 (図 ...

ここでコウジカビ flavusの生育および抗真菌性蛋白を発現するトウモロコシのアフラトキシン生産を分析するためのプロトコルを提案する. 我々 は、感染とリアルタイムで成熟したカーネルでは菌の拡散を監視 gfp 発現するA. flavusひずみを用いたします。アッセイは、急速な信頼性と再現性です。

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

ここでは、抗真菌タンパク質を発現するトウモロコシカーネルにおけるアスペルギルス・フラヴスの成長とアフラトキシン産生を分析するための簡単なカーネルスクリーニングアッセイを提示する。アスペルギルスフラバス株を発現する緑色蛍光タンパク質を用いて、成熟したカーネルにおける真菌の感染と広がりをリアルタイムで監視します。この簡単なアッセイは、アスペルギルスフラヴス感染およびアフラトキシン産生に抵抗するトウモロコシカーネルの能力を評価する信頼性の高い手段を提供する。成熟したカーネル上の制御された条件下で行われたこの実験室のアッセイからの結果は、フィールド条件下での感染の結果とよく相関する。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室のポスドクであるRajtilak Majumdar博士と、クリスティーン・シックラーとデビッド・アンブロジオ(私たちの研究室の生物科学技術者)です。まず、ペトリ皿に20の2mmのスナップキャップを接着してKSAキャップを作成します。接着剤を48時間乾燥させてからキャップを使用します。生物学的安全キャビネットでは、水に70%エタノールを用いた正方形のバイオアッセイトレイをスプレーします。トレイの空気を乾燥させます。滅菌クロマトグラフィー用紙をドライトレイに追加します。KSAキャップの9個に70%エタノールをスプレーし、空気乾燥させます。その後、バイオアッセイトレイにキャップを置きます。テストされているトランスジェニックトウモロコシラインごとに、20個の損傷していないカーネルを選択し、50ml遠心管に入れる。卓上のステレオ顕微鏡を使用して、アッセイのために損傷していないカーネルのみを選択します。損傷したカーネルはアスペルギルス攻撃の影響を受けやすく、より多くのアフラトキシンを産生し、それによって結果を歪め、その多様性の真の抗真菌または抗菌特性を表さない。各チューブに70%エタノールを加えます。カーネルを4分間殺菌させ、時折穏やかに揺らします。この後、エタノールを穏やかに注ぎ、滅菌脱イオン水でカーネルを3回静かにすすいだ。V8培地上で増殖したGFPを発現するアスペルギルスフラブラスステイン70の6日間培養液を得る。20mlの無菌0.02%トリトンX-100を脱イオン水に加えます。そして、胞子を削り取るために無菌ループを使用してください。イノキュラムからピペットを取り除き、300mlの滅菌ビーカーに移します。0.02%トリトンX-100で5倍希釈を準備し、ヘモサイトメーターを使用して胞子数を計算します。必要に応じて再び希釈し、1ml当たり400万個の胞子の濃度で100mlを得る。空のビーカーに接種を注ぎます。カーネルをスティルバー付きの滅菌300mlビーカーに入れ、3分間かき混ぜます。鉗子を使用して、カーネルをバイオアッセイ皿に移し、各キャップに1つのカーネルだけを入れるようにします。各バイオアッセイトレイの底に30mlの脱イオン水を加えます。そして、7日間摂氏31度でインキュベートします。A.flavusで7日間の接種の後、顕微鏡分析と写真撮影のために指定された4つのカーネルの写真を撮ります。その後、軟部組織と脱イオン水を使用して、カーネルの外面をきれいにします。カーネルの縦断面を行い、蛍光顕微鏡ですぐに写真を撮ります。分析用のカーネルを準備するには、残りのカーネルの外側を軟部組織と脱イオン水で洗浄します。1つの担当者を構成する4つのカーネルを、2つのステンレスボールを含む15mlスクリューキャップポリカーボネートバイアルに入れる。すぐに液体窒素でバイアルを凍結し、さらなる処理と分析を進める準備ができるまで摂氏80度で保存します。準備ができたら、冷凍庫からカーネルを取り出し、ホモジナイザーを使用して1500 rpmで3分間粉砕します。GFP分析、アフラトキシン定量、分子分析には同じ地盤材料を使用し、すべての値がサンプルを代表するようにします。少なくとも 3 つの複製が推奨されますが、良質のカーネルの可用性によっては、より良い方が常に適しています。本研究では、トウモロコシHI-II線の未熟胚は、カリフラワーモザイクウイルスから35Sプロモーターの制御下でラブラブ純粋AILP遺伝子を発現する最終植物先ベクターを含むアグロバクテリウム・トゥメファシエンスEHA101株を用いて形質転換される。標的AILP遺伝子のPCR増幅は、トランスジェニックトウモロコシ株においてのみ観察された548bpアンプリコンを示した。AILP遺伝子はトランスジェニックラインで発現を示したのに対し、AILP発現は対照植物では認められなかった。初期の発芽胞子は、若いトランスジェニックトウモロコシ植物からの粗葉抽出物に20時間曝露される。トランスジェニック葉抽出物に曝露された胞子からの高い全長は、陰性対照と比較して58〜80%の減少を示す。使用されるA.flavus株は、リアルタイムでの真菌の成長の監視と定量を可能にするGFPレポーターが含まれています。GFP蛍光の有意な低下は、等原性陰性対照と比較してトランスジェニックAILPカーネルにおいて観察される。AILPライン4と5、69%および72%の真菌の成長に有意な減少が見られる。他の行は、コントロールカーネルと比較して35〜60%の減少を示しています。AILPカーネルでは、コントロールと比較して62〜88%のAILP含有量の減少が認められた。4行目は、486 ng/gで最も低いアフラトキシン含有量を有し、その後にカーネル内のg当たり640〜1498ngの範囲の内容を有する他の行が続く。この手順に従って、フッ素計を使用してGFPを定量化し、その真菌の増殖として追加の方法を実行することができます。免疫ベースの市販キットまたはHPLCまたはEPLCは、アフラトキシン定量を行うために使用することができます。KSAの入手可能性は、アフラトキシン汚染に対する耐性を決定する迅速かつ簡単な手段を提供します。異なるトウモロコシの繁殖ラインのこの技術を使用して迅速に評価することができます。カーネルスクリーニングアッセイは危険ではありませんが、オペレータはアスペルギルスフラヴス胞子への暴露から自分自身を保護し、適切な保護具を使用する必要があります。

inhibition-aspergillus-flavus-growth-aflatoxin-production-transgenic

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メズおよびテオシンテ植物を生物栄養病原体 ウスチラゴメイディス で接種する注射法の使用について説明する。 針注射接種方法は、病原体がアプリソリアの形成を通じて植物に入る植物葉の間の真菌病原体の制御された送達を促進する。この方法は非常に効率的で...

トウモロコシとテオシンテ線における ウスチラゴ の病原性を評価するための迅速かつ効率的な方法

我々は、真菌アスペルギルス・ フラバスでアフラトキシン合成遺伝子をサイレンシングするためのRNA干渉信号を含むピーナッツ種子でアフラトキシン及び導入遺伝子発現の分析のための方法を実証します。植物におけるマイコトキシンのRNAi媒介性制御は、以前に報告されていません。...

ピーナッツにおけるアフラトキシンのRNAi仲介制御：メソッドは、ピーナッツにマイコトキシン生産と導入遺伝子発現を分析します/<em&gt;アスペルギルス</em&gt; Pathosystem

我々は遺伝的にウスチラゴがmaydisスマット菌を操作する堅牢な遺伝子置換戦略を説明します。このプロトコルは、感染症の表現型を調べるために、欠失変異体を生成する方法について説明します。蛍光タンパク質タグをコードする配列を付加することによって、 例えば 、任意の所望の方法で遺伝子を修正するために拡張することができます。...

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

トロイの木馬として経路を用いたトウモロコシ蛋白質場配信で

植物形態素遺伝子は、再生成遺伝型の遺伝子変換を改善するために使用することができる。ここに記載されているのは、3つの重要な公共トウモロコシ近交線のためのアグロバクテリウム媒介遺伝形質転換(QuickCorn)プロトコルである。...

アグロバクテリウム-形態新生遺伝子を用いた再カルシトランストウモロコシ近交線の媒介性不成熟胚変態

アグロバクテリウムベースの注射(アグロインジェクション)プロトコルは、トウモロコシの苗木にフォックステールモザイクウイルスとサトウキビモザイクウイルスクローンを接種するために提示されています。このようにして接種すると、ウイルス感染、マーカー遺伝子のウイルス誘発遺伝子サイレンシング、およびGFPのウイルス過剰発現がもたらされる。...

組換えフォックステールモザイクウイルスおよびサトウキビモザイクウイルス感染性クローンの注射によるトウモロコシ苗木の直接農業接種

この原稿では、トウモロコシと真菌植物病原体との相互作用の再現性のある細胞学的、生理学的、および分子学的研究のために、剥離したトウモロコシの葉鞘を使用する最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。葉鞘は、未固定組織における生きた植物と真菌の間の細胞相互作用のリアルタイム観察を容易にします。...

真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

RIDL®(優勢致死性を持つ昆虫の放出)システムを用いてAedes...

ブラジルにおけるフィールドリリースのための遺伝子組み換え Aedes aegypti の大量生産

マイクロプレートベースの手順は、細胞外酵素活性の比色または蛍光分析に記載されている。これらの手順は、管理可能な時間枠内で環境サンプルの大規模な数のこのような活動の迅速なアッセイを可能にします。...

ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定

学ぶカーネルスクリーニングアッセイでAspergillus flavusの生育とアフラトキシン産生を解析する方法。GFP発現株を用いてトウモロコシの感染動態をリアルタイムでモニタリングし、抗真菌タンパク質の効果を評価します。

コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害

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