Name: シードとマウス モデルにおける合成組織設計気管移植片の移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶ 組織工学気管移植片のマウスモデルへの移植手法。骨髄単核細胞を用いたシード法と電気紡糸スキャフォールド製造、マイクロ外科手術の詳細を解説。気管再生における細胞メカニズムの理解と臨床応用への展望を示す。

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グラフィック デザインのロバート ・ ストラウス ・研究情報ソリューション支援全国の小児病院で技術革新部門を認識したいと思います。この作品は、NIH (米国 K08HL138460) からの助成金によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) 全国こども病院で承認されています。
1. 足場製造
<ol><li>による高分子ナノファイバー前駆体溶液を準備: 1) 溶解 8 wt % ペット 1,1,1,3,3,3 hexafluoroisopropanol と 2) 3 wt % PU 1,1,1,3,3,3-hexafluoroisopropanol 室温で溶解することにより 60 ° c とのソリューションを加熱します。</li>
	<li>冷却、ペットと PU (20: 80) の最終的なポリマーの混合物を作成するソリューションを結合します。</li>
	<li>PET:PU 液でいっぱい 60 mL の注射器に 20 G 鈍い先端針を利用したステンレス鋼の棒 (直径 1 mm) に PET+ PU ソリューション +14 に高電圧 DC 電源供給セットを使用して針、別の高電圧 DC 電源に kV 供給-3 に設定 Electrospin kV、5 mL/h の流量と 20 cm のヒント-基板距離。繊維堆積時 350 rpm にロッドを回転させます。</li>
	<li>300 μ m の目的足場壁の厚さが達成されるまでは、エレクトロスピニングを続けます。ロッド、足場をスライドし、任意の残留溶媒を除去するためには一晩を真空下でそれを保持します。</li>
	<li>注入前に 350 mJ/cm2の紫外線光量を使用して足場を滅菌します。</li>
</ol>2. 骨髄由来単核細胞 (BM 多国籍企業) の収穫
<ol><li>6-8 週間を安楽死させるケタミン (200 mg/kg)、キシラジン (20 mg/kg) およびケトプロフェン (10 mg/kg) のカクテルが古い、女性、C57BL/6 マウス。尾ピンチによる完全な安楽死をチェックします。安楽死のための地域のガイドラインに従ってください。</li>
	<li>無菌条件下で大腿骨と脛骨高級はさみおよびアドソン マイクロ鑷子を使用して骨を公開する皮膚を削除します。筋膜や腱を削除するのに・ デュモン #5 鉗子とデュモン #5/45 鉗子を使用します。骨を分離し、両端にそれらのそれぞれをカットします。5 mL シリンジ、25 G 針を使用して、ローズウェル公園記念研究所 (RPMI) メディアの 30 mL を含むペトリ皿の骨髄をフラッシュします。50 mL のチューブに 70 μ m ナイロン携帯こし器を通ってこの RPMI 骨髄をフィルターします。</li>
	<li>安全キャビネット、polysurcrose、ナトリウム diatrizoate 15 mL チューブに 5 mL を配置します。2 つの層の混合を避けるために管の下側骨髄単核細胞を含む RPMI をそっと追加します。24 ° C で「ブレーキ 1」461 x gで 30 分間遠心 注: 当社の遠心ブレーキ 1 略最長を減速時に時間を実行します。</li>
	<li>形成された 3 つの層、外 (ピンク) 上層部にプラズマを破棄し、骨髄単核細胞から成る中間 (クリア) 層を収集します。赤血球沈殿を破棄します。</li>
	<li>24 の ° C のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1:1 の比率で 461 × gで 10 分間遠心する「ブレーキ 9」で骨髄単核細胞 (BM MNC) を希釈します。</li>
	<li>上澄みを除去し、5 mL の PBS でペレットを希釈します。24 の ° C で「ブレーキ 9」461 x gで 10 分間遠心</li>
	<li>上澄みを除去し、RPMI 〜 10 mL にペレットを希釈します。</li>
	<li>0.4% トリパン ブルー 1 mL 管の等しいボリューム BM MNC ソリューションの 10 μ L を希釈します。チェンバー スライドを数える細胞における解の場所 10 μ L。自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。手順を繰り返し、細胞の平均の数を計算します。 注: 1 X 10 の8セルの平均セル数は、2 つのドナー マウスの使用から得られました。これは 2 つの大腿骨に相当するだろうし、骨髄 2 脛骨から分離されます。</li>
	<li>遠心分離機の 24 ° c. で「ブレーキ 9」と 461 x gで 10 分間で BM MNC ソリューション上澄みを除去し、107セル/移植する細胞濃度を希釈します。 メモ: 我々 がシード 1、10、1 億の細胞間の効率を検討して移植あたり 1000 万の細胞が最高の播種効率を生成することを発見します。</li>
</ol>3. 細胞播種、移植
<ol><li>足場の長さを測定し、必要な場合、5 mm の長さに切り取ります。</li>
	<li>あらかじめ 5 分削除、RPMI RPMI の 5 μ L で足場を濡れています。</li>
	<li>10 分の足場の内腔に BM MNC ソリューションの 5 μ L を追加します。</li>
	<li>移植を 21 G 針を渡し、インキュベーターの 37 ° C で一晩 RPMI の 1000 μ L で移植を孵化させなさい。</li>
</ol>4. 移植注入
注: 移植移植手術中の無菌技術を維持するために注意する必要があります。
<ol><li>シード細胞移植の受信者として 6-8 週齢女性 c57bl/6 マウスを使用します。エンロフロキサシン (10 mg/kg) を皮下 24 h 手術前に、と切開の直前に挿入します。</li>
	<li>マウスの重さし、鎮痛法として腹腔内麻酔薬ケタミン (100 mg/kg)、キシラジン (10 mg/kg) およびケトプロフェン (5 mg/kg) のカクテルの 0.1 mL/10 g の投与量を管理します。</li>
	<li>尾ピンチによる麻酔の平面が達成されているかどうか確認してください。鎮静のレベルを確認するには、滅菌の眼軟膏を目に適用し、あごから鎖骨に手術部位の毛をクリップします。背臥位でパッドに動物を配置します。最初にポビドン ヨードの準備パッド、アルコール準備パッド (70% アルコール)、続いてもう一度ポビドン ヨード準備パッドを使用する手術部位を消毒します。</li>
	<li>外科医からその頭を解剖顕微鏡の下で動物を配置します。高級はさみやアドソン マイクロ鑷子の助けを借りて、舌骨鎖骨からまでの正中切開を行います。デュモン #5 とデュモン #7 微細鉗子、自己保持のコリブリ リトラクターを挿入し、必要に応じて滅菌綿棒と一緒に筋膜をきれいに。</li>
	<li>甲状軟骨、輪状軟骨、気管を公開するデュモン #5 とデュモン #7 微細鉗子でストラップの筋肉 (図 3A) を開きます。にべもなく続く円周方向分離気管食道 (図 3B) から、両側に並列実行している反回神経から気管を区切ります。</li>
	<li>20 G 針、手術用マーカーを使用して、気管の前方部分を染色します。</li>
	<li>気管を識別し、第 3 気管軟骨輪の下切開 Vannas テュービンゲン春はさみのペアとデュモン #7 微細鉗子のペアを使用して気管のトランセクトします。良いカーブタイプ鉗子でそれを保持、一時的な気管切開 (図 3C) を作成する 9-0 ナイロン縫合糸の滅菌を使用して胸骨に気管を保護します。注: 使用できる代替縫合材料は気管注入、筋肉 reapproximation の 9-0 PDS です。</li>
	<li>20 G 針、手術用マーカー汚れの前方部分を表す移植を実行します。</li>
	<li>インプラントの移植、近位後方、近位側を挿入して 9-0 滅菌ナイロン縫合糸 (図 3D) ・ デュモン #7 を使用してその注文の近位前方縫合糸微細鉗子、持針器。</li>
	<li>外科医から尻尾を配置する動物の 180 ° を回します。一時的な気管切開をリリースします。気管は、切り株として切除の撤回のための使用を許可する不完全離断します。不要になったときは、5 MM の気管セグメントが完全に削除されます。</li>
	<li>近位吻合術と同様の方法での縫合糸を置くことによって遠位吻合を完了します。</li>
	<li>おおよその再移植位置とストラップの筋肉。実行中のパターンで 9-0 滅菌ナイロン縫合糸を使用して切開を閉じる。</li>
	<li>ブプレノルフィン (0.1 mg/kg) の 0.1 mL を皮下に注入し、動物回復ケージ、檻の中で他の動物なし加熱パッドの上に配置します。</li>
	<li>意識であり、及ぶ、柔らかい寝具、しっとり食事 48 h の薬用水 (イブプロフェン、30 mg/kg) と新しいケージへマウスを移動することができるまでは、マウスを観察します。この期間の経過後、マウスを他のマウスと通常ケージに戻ります。 注: 呼吸困難を維持または注入後活性が低下したマウスは 32 ° C の定温器でスタッフが研究室や動物観察されます。この状態が 48 時間以上続く場合、マウスが安楽死する必要があります。</li>
</ol>5 組織および免疫組織化学
注: ヘマトキシリンとエオシン汚れによって行われた標準的な技術を使用して全国の子供たちの病院形態コア。よると免疫組織染色を行った、以下の手順を実行します。
<ol><li>スライドを deparaffinize H2O (dH2O) 5 分の 5 分、2) キシレン 5 分、5 分、5 分の 4) 90% エタノール、5) 70% のエタノールの 5 分の 3) 100% エタノールをキシレン 1) 6) 蒸留します。</li>
	<li>クエン酸バッファー内のスライドを水没、水で満たされた圧力鍋に配置します。10 分間加熱し、室温まで冷まします。0.1% ウシ血清アルブミン (BSA PBS) PBS の dH2o ・ 5 分すすぎ洗浄します。 注: 浴槽にお湯や電子レンジで 15 分加熱を行うもできます。</li>
	<li>室温で 1 時間 PBS で 3% ヤギ血清とスライドを孵化させなさい。0.1% でよく洗って 5 分間 BSA PBS はケラチンの濃度と一次抗体の孵化 5 (1: 1000)6、ケラチン 14 (1: 250)6 4 ° C で一晩 18 h の F4/80 (1: 100)7</li>
	<li>0.1% BSA PBS 2 回 10 分の各洗浄で洗ってください。K5/K14 と室温で 1 時間 1: 300 F4/80 の 1: 500 の濃度で適切な二次抗体とインキュベートします。0.1% BSA PBS 2 回 10 分の各洗浄で洗ってください。</li>
	<li>使用してマウント 4', 6-diamidino-2-phenolindole (DAPI) 取付・ ガラス カバー スリップを含みます。イメージングの前に 30 分間座ることができます。</li>
</ol>

<ol><li>Macchiarini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+transplantation+of+a+tissue-engineered+airway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Clinical transplantation of a tissue-engineered airway.</a> The Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).</li>
<li>Jungebluth, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracheobronchial+transplantation+with+a+stem-cell-seeded+bioartificial+nanocomposite%3A+A+proof-of-concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Tracheobronchial transplantation with a stem-cell-seeded bioartificial nanocomposite: A proof-of-concept study.</a> The Lancet. 378 (9808), 1997-2004 (2011).</li>
<li>Elliott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell-based%2C+tissue+engineered+tracheal+replacement+in+a+child%3A+A+2-year+follow-up+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: A 2-year follow-up study.</a> The Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).</li>
<li>Chiang, T., Pepper, V., Best, C., Onwuka, E., Breuer, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Translation+of+Tissue+Engineered+Trachea+Grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Otology%2C+Rhinology+and+Laryngology%22%5BJournal%5D)">Clinical Translation of Tissue Engineered Trachea Grafts.</a> Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 125 (11), 873-885 (2016).</li>
<li>Clark, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+on+neotissue+formation+in+a+tissue+engineered+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding on neotissue formation in a tissue engineered trachea.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 49-55 (2016).</li>
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<li>Onwuka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+myeloid+cell-derived+PDGF-B+in+neotissue+formation+in+a+tissue-engineered+vascular+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of myeloid cell-derived PDGF-B in neotissue formation in a tissue-engineered vascular graft.</a> Regenerative Medicine. 12 (3), 249-261 (2017).</li>
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<li>Haag, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+and+angiogenic+properties+of+tissue-engineered+rat+trachea+using+genipin+cross-linked+decellularized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue.</a> Biomaterials. 33 (3), 780-789 (2012).</li>
<li>Best, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+tissue-engineered+tracheal+scaffold+for+preclinical+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pediatric+Otorhinolaryngology%22%5BJournal%5D)">Designing a tissue-engineered tracheal scaffold for preclinical evaluation.</a> International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 104, 155-160 (2018).</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

設計組織気管マウス モデルの開発は臨床 TETGs; 翻訳が限られている点を理解する上で不可欠であります。すなわち移植崩壊、狭窄と遅延上皮化4.これらの制限に貢献するいくつかの要因には、移植材料、製造プロセス、足場設計および細胞播種プロトコルの選択が含まれます。このモデルは、それらに影響を与える細胞および分子メカニズムを理解するためにこれらの要因の高速評価できます。
我々 がここで示したをグラフト狭窄 (図 5) を要約するモデルの能力と同様に、上皮細胞 (図 4) の存在モデルの使用の成功は注入プロセスの間にいくつかのキーの手順と異なります。まず、初期の切開とマウスの気管の分離の間に損傷を避けるために不可欠または気管食道溝にある隣接する反回神経のストレッチです。ネイティブ気管切除時にもう一つの重要な要因は、気管に後方に座っている食道への損傷を避けるためです。
...

長いセグメント気管欠陥を完全な気管軟骨輪と気管無形成と同様、外傷、悪性腫瘍、感染症などの稀な先天性の条件として提示できます。大人または小児の気管の長さの 30% で 6 cm を超える場合これらの欠陥は再建術によって処理されません。自家組織、脳死移植、人工気道を置き換える試みは、慢性感染、肉芽、機械の故障、および狭窄症に悩まされています。
設計組織気管移植片 (TETGs) 潜在的生涯免疫抑制療法の必要性を回避しながらこれらの問題に対応できます。過去 10 年間で TETGs は動物モデルでテストし、まれに思いやりの使用1,2,3の臨床的に利用されています。臨床と大規模な動物実験、設計組織気道交換から術後の回復必要戦闘狭窄する多数の介入 (として定義 > 50% の内腔狭小化) し、気道の開存性を維持します。TETG の追加作業は、細胞播種の選択、血管新生と足場設計の役割を評価することによってこの狭窄を削減を求めています。細胞播種選択肢とネイティブの気管の構造・機能の回復を目指した足場設計が主に呼吸の上皮細胞と軟骨細胞の様々 な吸収性、非吸収性、脱足場でシードに注目されています。可能性があります血管新生は、狭窄の開発で主要な役割を果たしている、他のグループは、体外または血行再建術または促進4を促進するために異所性モデルを最適化することに焦点を当てています。それにもかかわらず、課題のまま機械的に有能で機能的な TETG をまた維持しながら成功した血管新生を達成します。最近の進歩にもかかわらず臨床的翻訳に重要な障害のまま狭窄を最小限に抑えることです。
この病理組織学的応答 TETG 注入体内を調べるため、組織代用気管の羊モデルを開発しました。移植された混合ポリエチレンテレフタル酸塩 (ペット)、ポリウレタン (PU) エレクトロスピニング足場骨髄単核細胞 (BM 多国籍企業) のシードで構成されます。この小さなコホートでシード自家 BM-多国籍企業が再上皮化を加速し、狭窄5を遅延を行った。自己改善 BM 多国籍企業生存の播種が、BM 多国籍企業は、機能 neotissue の形成を調節する細胞のメカニズムは不明のまま。
組織のマウスモデルの細胞レベル必要な発達に関する研究には、気管が設計されています。羊の研究と同様に、我々 は BM とシード PET:PU エレクトロスピニング足場を活用-多国籍企業羊モデル、TETG 狭窄注入1,2,3 に続く最初の 2 週間にわたって開発に一致して。 ,5。これはマウスのモデルがさらに気道狭窄の基になる細胞のメカニズムを調査する私たちを有効にする以前は、観測された病理を締めくくっていることが示唆されました。
本報告では、組織設計足場製造、BM MNC 分離、播種、移植、注入 (図 1図 2) を含むマウス モデルの気管の交換のため、我々 のプロトコルを詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>0.9%塩化ナトリウム注射</td><td>APP医薬品</td><td>NDC 63323-186-10</td><td></td></tr><tr><td>10cc血清ピペット</td><td>ファルコン</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>18G 1.5in。ニードル</td><td>BD</td><td>305190</td><td></td></tr><tr><td>1mL シリンジ</td><td></td><td>BD 309659</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>25cc 血清ピペット</td><td>ファルコン</td><td>356535</td><td></td></tr><tr><td>25G 1in.ニードル</td><td>BD</td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>50ccチューブ</td><td></td><td>BD352070</td><td></td></tr><tr><td>アルコール準備パッドフィ</td><td>ッシャーヘルスケア</td><td>NDC 69250-661-02</td><td></td></tr>バイト<tr><td>リル(エンロフロキサシン)溶液</td><td>バイエルヘルスケア、LLCNDC</td><td>0859-2267-01</td><td></td></tr><tr><td>ブラックポリアミドモノフィラメント縫合糸、9-0</td>ア<td>ロスサージカルインスツルメンツコーポレーション</td><td>T05A09N10-13C57BL</td><td></td></tr> /<tr><td>6、女性</td><td>ジャクソン研究所</td><td>664</td><td>6-8週齢</td></tr>ク<tr><td>エン酸緩衝液pH 6.0 20倍濃縮</td>物<td>サーモフィ</td><td>ッシャー5000</td><td></td></tr>コリ<tr><td>トラクターF.S.T</td><td>17000-04</td><td></td><td></td></tr>コットン<tr><td>チップアプリケーター</td><td>フィッシャー科学</td><td>23-400-118</td><td></td></tr><tr><td>サイトケラチン14モノクローナル抗体</td><td>サーモフィッシャーMA5-11599</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>F.S.T</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5/45 鉗</td>子 <td>F.S.T</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #7 ファイン鉗子</td><td>F.S.T</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 ラット抗マウス抗体</td><td>バイオ・ラッド</td><td>MCA497R</td><td></td></tr><tr><td>フィコール</td><td>シグマ</td><td>10831-100mL</td><td></td></tr><tr><td>細ハサミ シャープ鈍</td><td>F.S.T</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrandのプレミアムカバーメガネ</td><td>ThermoFisher</td><td>12-548-5M</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield 封入剤</td><td>DAPI</td><td>Abcam ab104139</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG二次抗体 Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG二次抗体 Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ラットIgG二次抗体 Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofen</td><td>Precision Dose, Inc</td><td>NDC 68094-494-59</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素調製パッド</td><td>プロフェッショナル ディスポーザブル インターナショナル Inc.</td><td>NDC 10819-3883-1</td><td></td></tr><tr><td>ケラチン5ポリクローナル抗体、精製</td><td>バイオレジェンド</td><td>905501</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン塩酸塩注射</td>剤 <td>Hospira Inc.</td><td>NDC 0409-2053</td><td></td></tr><tr><td>マイクロアドソン鉗子</td><td>F.S.T</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>不織布スポンジ</td><td>Covidien</td><td>441401</td><td></td></tr><tr><td>眼科軟膏</td><td>Dechra 獣医製品</td><td>NDC 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PET/PU (ポリエチレンテレフタレート&ポリウレタン) 足場</td><td>ナノファイバーソリューション</td><td></td><td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>BD</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 ミディアム</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>TISH ニードルホルダー/鉗子</td><td>Micrins</td><td>MI1540</td><td></td></tr><tr><td>トリマー</td><td>Wahl</td><td>9854-500</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml;bingenの春はさみ</td><td>FST15008-08</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温水recirculator</td><td>ゲイ</td><td>マーTP-700</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン無菌溶液</td><td>Akorn動物の健康</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr></tbody></table>

シードとマウス モデルにおける合成組織設計気管移植片の移植

Seeding and Implantation of a Biosynthetic Tissue-engineered Tracheal Graft in a Mouse Model

先天性またはセカンダリ セグメントを長い気管欠損に対する治療の選択肢は、歴史的に機能的な組織を置き換えることができないのため限られています。ティッシュ エンジニア リングは、3 次元足場に細胞シグナリング分子を統合する能力と潜在的なソリューションとして大きい約束を保持します。設計組織気管移植片 (TETGs) と最近の研究は、いくつかの成功を見ているが、その翻訳グラフト狭窄によって制限されており、崩壊を移植し上皮化を延期します。これらの問題を駆動機構を調査するために組織気管移植移植モデルマウスを開発しました。TETGs は、ペットと PU (20: 80% 重量) の混合物のエレクトロスピニング ポリマー ポリエチレンテレフタル酸塩 (ペット)、ポリウレタン (PU) を使用して構築されました。足場は、6-8 週から骨髄単核細胞を用いた播種-勾配遠心法によって古い c57bl/6 マウス。移植あたり 1000 万の細胞足場の内腔にシード, 3 番目と 7 番目気管リング間の注入の前に一晩インキュベートする許可。これらのグラフト狭窄所見を要約することが、組織学的解析と蛍光抗体法で 5 ケラチンとケラチン 14 の基底上皮細胞の欠如によって示されるように、上皮化を遅延しました。このモデルは、ホストの改造に関与する細胞および分子メカニズムを調査するためのツールとなります。

TETG 播種および注入の概略図を図 1に示します。骨髄は c57bl/6 マウスから収穫され、の in vitro培養します。BM 多国籍企業は、密度遠心分離によって分離され、シード、TETG に。シードの TETGs は、同系 c57bl/6 受信者マウスに移植されました。
図 2は、製造工程 PET:PU TETG 足場の概要です。PET:PU ソリューションは、300 μ m とルーメン ネイティブ マウスの気管を近似する 1 mm 直径の最終的な TETG の壁の厚さを達成するために 20 G の鈍針にエレクトロスピニングをでした。TETG の表面は、アニメーションの単核細胞の走査型電子顕微鏡画像で見ることができます。
<p class="jove_content" fo:keep-together...

グラフト狭窄組織気道交換に重大な障害を引き起こします。狭窄症の基になる細胞のメカニズムを調べるためには、エンジニア リング組織シード骨髄単核細胞 (BM MNC) で代用気管のマウスモデルを駆使します。ここでは、私たちプロトコルの足場製造、BM MNC 分離、移植はシード、および注入を詳しく説明します。

Treatment options for congenital or secondary long segment tracheal defects have historically been limited due to an inability to replace functional ...

組織設計気管の臨床応用は、移植片狭窄および上皮化の遅れのために限定されている。直交性気管置換のマウスモデルは、再生を駆動する細胞機構の研究を可能にする。気道の長いセグメントの欠陥は、現在の治療法が治癒することができるものを超えることができます。組織で設計された気管は、これらの条件の代替臓器を作成する可能性を提供します。このモデルは、トランスジェニックおよび系統トレースプロパティを持つ動物に適用できます。その後、移植片の再生に寄与する宿主因子を調節することができます。スキャフォールドを製造する上での重要な課題の1つは、エレクトロスピニングパラメータが毎回同じであることを測定し、決定することです。したがって、スキャフォールドを生成するたびに、先端からコレクターまでの距離、湿度、温度を測定して、スキャフォールドが毎回同じになるようにする必要があります。このモデルの成功にとって重要なのは、手術を通して自発的な換気を可能にする、マイクロサージカル技術の改良と麻酔の正しい平面の維持である。宿主気管は約1ミリメートルの内径を有するため、移植片およびネイティブ組織の取り扱いと縫合の配置が重要であり、視覚的に最もよく実証される。まず、8重量%のポリエチレンテレフタレート(PET)を六フッ化イソプロパノールに溶解し、得られた溶液を摂氏60度に加熱します。溶液が温められている間、3重量%ポリウレタン、またはPUを六フッ化イソプロパノールに溶解し、PET溶液が冷却されたら溶液を組み合わせる。ポリマー混合物と20ゲージの鈍い先端の針が装備されている60ミリリットルのシリンジをロードする。注射器と高電圧DC電源を針の正の14キロボルトに設定し、別の高圧DC電源をマイナス3キロボルトに設定し、5ミリメートル/時の流量を設定し、ポリマーをエレクトロスピンする20センチメートルの先端から基板までの距離を使用して、1ミリメートルの直径のステンレス鋼棒を1ミリメートル回転に変えます。300マイクロメートルの足場壁の厚さが達成されるまでエレクトロスピニングを続けます。次に、足場をロッドからスライドさせ、残存溶媒を除去するために一晩真空下に足場を置き、約15分間2乗/センチメートル350ミリジュールの紫外線投薬量で足場を殺菌する。無菌状態では、6〜8週齢の女性、C57-Black/6マウスの後肢から細かいはさみとマイクロAdson鉗子を取り除き、デュモンナンバー5鉗子とデュモン番号5/45鉗子を使用して筋膜と腱を取り除きます。骨を分離して両端で切断し、25ゲージの針を備えた5ミリリットルの注射器を使用して、骨髄を30ミリリットルのRPMI培地を含むペトリ皿に洗い流します。すべての骨が洗い流されたら、骨髄を70マイクロメートルのナイロンセルストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管にフィルターし、チューブをバイオセーフティキャビネットに移します。濾過された単核細胞溶液を、ポリスクロースと珪酸ナトリウム5ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブの側面に、層を混合することなく静かに加え、密度勾配分離によって白血球と赤血球から血漿を分離する。遠心分離の終わりに、骨髄単核細胞からなる中間透明層を採取し、遠心分離によりPBSで骨髄単核細胞を1対1の割合で洗浄する。2回目の洗浄のためにPBSの5ミリリットルでペレットを再懸濁し、続いてカウント用の新鮮なRPMI培地の10ミリリットルで再懸濁を行う。次いで、さらなる遠心分離で細胞を採取し、新鮮なRPMI濃度の5マイクロリットル当たり7細胞に10倍に希釈した。足場を播種する前に、必要に応じてポリマーを5ミリメートルの長さにカットし、5マイクロリットルのRPMI培地で足場を5分間濡らします。インキュベーションの終わりに、余分な培地を取り除き、5マイクロリットルの骨髄単核細胞溶液を足場の腔に10分間ロードする。次に、足場の内腔に21ゲージの針を挿入し、移植片を37°Cインキュベーターで一晩RPMI培地の1ミリリットルに入れます。全身麻酔の誘導後、レシピエント動物のつまみつまみへの応答の欠如を確認し、動物の目に軟膏を適用する。顎から鎖骨まで外科部位の毛をクリップし、動物を後回しリカンベント位置の外科パッドに置きます。無菌技術を用いて、シーケンシャルポビドネヨウ素、70%エタノール、ポビドネヨウ素ワイプシリーズで外科部位を消毒し、12時に頭部を持つ解剖顕微鏡の下でマウスを動かす。細かいはさみとマイクロAdson鉗子を使用して鎖骨から舌骨への正中線切開を行い、デュモン番号5とナンバー7の細かい鉗子と無菌綿棒を使用して鼻隠しを清掃してから、自己保持のコリブリトラクターを切開に挿入します。鉗子を使ってストラップの筋肉を開いて甲状腺軟骨、口骨、気管を露出させ、組織の両側で平行に走る再発喉頭神経から気管を鈍く分離し、続いて食道から気管を周回分離する。20ゲージの針と外科用マーカーを使用して、気管の前部を染色する。ヴァンナス・チュービンゲンのスプリングハサミとデュモン番号7の細かい鉗子のペアを使用して、3番目の気管軟骨リングの下に切開を行い、気管の3リングセクションを切除します。細かい湾曲した鉗子で気管を保持し、滅菌9-0ナイロン縫合糸を使用して気管の遠位端を胸骨に固定し、一時的な気管切開術を行い、20ゲージの針と外科マーカーを使用して移植片の前部を染色します。移植片を移植するには、9-0の無菌ナイロン縫合糸、デュモン番号7の細かい鉗子、および針のホールダーを使用して、近位後部、近位横方向、および近位前部のステッチを挿入し、動物を180度回す。マウスが位置に入ったら、一時的な気管切開術を解除し、側面切開を移植片の前部から5ミリメートル離れて行い、遠位吻合を容易にする。遠位吻合を完了するには、接合糸を近位吻合と同様の方法で配置し、移植片の位置とストラップの筋肉を再近似します。次に、9-0の無菌ナイロン縫合糸で切開をランニングパターンで閉じ、完全に回復するまで監視して加熱パッドに置かれた回収ケージに動物を単独で入れる。移植の2週間後、いくつかの基底上皮細胞は、組織で設計された気管移植組織切片における基底細胞ケラチン5および14染色によって観察することができる。基底細胞はまた、移植後7日で移植片の発光表面上で検出される。排泄および組織学的分析の際に、移植片狭窄は、呼吸困難およびストリドールの徴候を示す移植片移植マウスの主要な要因として同定された。なお、移植片および在来性気管の伸縮は、外科的手法の結果として一般的な発見である。F4/80の染色は、基底上皮細胞の存在と併せて移植片のステナティック領域内の宿主マクロファージを明らかにする。再発性喉頭神経の操作を避け、吻合で気密シールを可能にするために近位および遠位縫合糸が整っていることを確認する。このプロトコルは、生体安全レベル1剤マウスに由来する骨髄単核細胞を扱うため、汚染を避けるために適切な個人用保護具を着用することが重要である。

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Bioengineering

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シードとマウスモデルにおける合成組織設計気管移植片の移植

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シードとマウス モデルにおける合成組織設計気管移植片の移植

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