Name: BALB/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学ぶ薬物誘発性自己免疫性肝炎の発症機序をBALB/cマウスを用いたin vivoモデルで。性別差を含む肝障害の再現性ある解析手法と免疫応答評価法を解説し、新規治療戦略開発への応用可能性を示します。

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Njoku博士は、このモデルの策定につながった彼の指導と洞察に満ちた議論について、MD博士のNoel R. Rose博士に感謝したいと思います。

すべての手順は、動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 肝臓S-100細胞質ゾルタンパク質またはCYP2E1エピトープのトリフルオロアセチル化
注:まず、トリフルオロアセチル化S100(TFA-S100)およびトリフルオロアセチル化CYP2E1エピトープ(TFA-JHDN5)を調製する。同系S100タンパク質が免疫化に必要であり、BALB/cマウスが免疫原を産生するために必要であるためである。調製物は、大量の免疫原を生じる。したがって、この部分を年に4回程度実行する予定です。TFA-JHDN5 の作成には、同じ方法が使用されます。CYP2E1エピトープ(JHDN5)、GII/FNN/GPT/WKD/IRR/FSL/TTLは、配列決定または購入することができる。
<ol><li>肝臓のS100画分の単離。
	<ol>
<li>40-60mg/kgのケタミンと4~6mg/kgキシラジンを混合した5~10匹のBALB/cマウスを鎮静した後、右心反射の喪失および眼瞼反射の喪失に加えて、筋緊張の低下およびつま先のピンチ(離脱反射)などの痛みを伴う刺激に対する応答がないことを観察することによって、適切な麻酔の深さを確認する。</li>
		<li>顕微手術用はさみを使用して、正中線切開を用いて腹腔内内容物を露出させ、下大静脈に小さな切り込みを入れて血液を除去する。</li>
		<li>門脈に24ゲージの血管カテーテルを置き、4°Cの水浴中で40mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)pH7.4で肝臓10mL/分を灌流する。 プールされた肝臓を取り外して秤量し、それを小片(10〜15mm)に切断する。 注:安楽死は、追加のケタミン/キシラジン(80mg / kg:8mg / kg)の腹腔内注射、続いて子宮頸部脱臼および胸腔を開いて肺を崩壊させることによって誘発される。この方法は、動物に最小限の痛みと不快感を提供します。この方法は、米国獣医師会の安楽死に関するパネルの勧告と一致しています。</li>
		<li>スクロース(250 mM)-TRIS(10 mM)-EDTA(1 mM)ホモジナイズバッファー(pH 7.4)の重量の4倍を加え、メーカーの推奨に従って完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤( 材料表を参照)を添加します。15mLポリプロピレンチューブ中で均質化し、一般的な実験室組織ホモジナイザーを用いて、氷上で中速で滑らかになるまで。均質化中に組織が暖かくなるのを防ぐために、氷上で均質化します。</li>
		<li>肝臓ホモジネートを1500 x g で10分間遠心分離し、上清を流し出す。上清を100,000 x gで1時間遠心分離する。上清をスナップ凍結し、-80°Cで保存する。 上清は細胞質ゾルS-100である。</li>
	</ol></li>
	<li>S100およびJHDN5のトリフルオロアセチル化 注:S−100のリジン残基のε−アミノ基のトリフルオロアセチル化は、Satoh18の手順に従って行われる。透析の末日を除いて、この実験のすべての部分はヒュームフードで行われます。<ol>
<li>細胞質ゾルS-100の総タンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ(BCAアッセイ)7を用いて決定する。BALB/c マウス S100 または JHDN5 20 mg を dH2O で 10 mL に希釈し、50 mL 三角フラスコに入れます。1N KOHでpHを10に調整します。</li>
		<li>4.7mmolのS-エチルトリフルオロチオ酢酸(S-ETFA)を溶液に加える。約1時間、液滴状にKOHを投与することにより、1N KOHでpHを9.9〜10.0に維持する。各反応のKOHの総体積を記録する。</li>
		<li>溶液を別々の透析カセットに移す(過剰充填しないでください)。カセットを4LのdH2Oに対して72時間透析し、1日3回交換する。透析後、TFA-S100またはTFA-JHDN5の最終容量を記録し、標識されたチューブにアリコートします。スナップ凍結し、–80 °Cで保存します。</li>
		<li>推定濃度は、S100またはJHDN5の初期量(mg単位)を透析後の最終容量(mL)で割ることによって決定される。天然タンパク質19の改変率を決定するために、各天然およびTFA改変タンパク質の1.0mg(最終濃度が1.0mgを超える場合)を別々の弾丸チューブ中でdH2Oと共に1.0mLに希釈し、1.0mLdH2Oを用いてブランクを調製する。TFA改変タンパク質の濃度が1.0mg未満の場合は、希釈しないでください<ol>
<li>96ウェルプレートのウェルを分離するには、ブランクタンパク質、天然タンパク質、および改変タンパク質を50μL加えます。50 μL の 4% NaHCO 3 を、 続いて 50 μL の 0.1% 2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸を各ウェルに加えます。</li>
			<li>プレートを40°Cで2時間インキュベートする。インキュベーションに続いて、50 μL の 10 % SDS を各ウェルに加え、続いて 25 μL の 1N HCl を加えます。</li>
			<li>334nmのODで読み取り、334nmでの吸光度の特徴的な低下を確認するために、200〜600nmの各化合物の吸光度を記録します。TFAによるリジン残基の修飾パーセントを計算し、以下の式を用いて: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59174/59174eq1.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 肝炎を誘導するマウスの免疫
注:DIHは、トリフルオールアセチルクロリド(TFA)、モデル薬物代謝産物、TFA-S1006 、またはTFA9、肝炎を誘導するTFA-JHDN5、自己反応性T細胞、およびCYP2E1自己抗体によって共有結合的に変化したCYP2E1のエピトープによって共有結合的に変化した肝細胞質ゾルタンパク質による免疫化によって、BALB/cマウスにおいてモデル化される。マウスは、初期免疫の2週間後に脾臓活性化期を呈し、顆粒球性炎症を特徴とする3週間後には肝期を示す。このモデルでは、雌のBALB/cマウスは雄よりも肝炎の影響を受けやすい。
<ol><li>0日目に、6~8週齢のBALB/cマウスを首の付け根の皮下に、200μgのTFA-S100または100μgのTFA-JHDN5を等量の完全フロイントアジュバント(CFA)で乳化させた状態で免疫する。0日目に、マウスを50ngの百日咳毒素で、後肢の1つに筋肉内に免疫する。7日目に、200μgのTFA-S100または100μgのTFA-JHDN5を等量のCFAに乳化させて、各マウスが同じ免疫原の注射を2回受けられるようにして、尾の基部でマウスを皮下免疫する。 注:マウスは、免疫後最初の6時間は1時間ごとに監視され、その後、少なくとも1日2回、1週間監視されます。マウスが、むしゃぶりついた姿勢や毛皮のフリルなど、痛みや苦痛の兆候を示す場合、鎮痛薬は局所ACUCに従って投与する必要があります。重大な痛みや苦痛が認められた場合は、獣医師によってマウスを評価して、安楽死が必要かどうかを判断する必要があります。</li>
	<li>フローサイトメトリーを用いた自己タンパク質全体、自己タンパク質のエピトープまたはTFAハプテンに対するCD4+ T細胞免疫応答の決定
	<ol>
<li>腹腔内注射により40-60mg/kgケタミンと4-6mg/kgキシラジンを混合したマウスを鎮静した後、ステップ1.1.1に記載のように適切な麻酔深さを確認し、顕微手術用はさみを用いて腹腔内を露出させた後に脾臓を同定する。椎弓根で脾臓を切って、PBS / 2%ウシ胎児血清(FCS)を入れたペトリ皿に入れます。 注:安楽死は、追加のケタミン/キシラジン(80mg / kg:8mg / kg)の腹腔内注射、続いて子宮頸部脱臼および肺を崩壊させるために胸腔を開くことによってマウスにおいて誘発される。この方法は、動物に最小限の痛みと不快感を提供します。この方法は、米国獣医師会の安楽死に関するパネルの勧告と一致しています。</li>
		<li>すりガラススライドを使用してセルを解放し、50mLの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。PBS/2% FCS で洗浄するには、容量を最大 50 mL にし、ベンチトップ冷蔵遠心分離機を使用して 335 x g で遠心分離します。上清を注ぎ、このステップを繰り返します。</li>
		<li>1 mL の ACK ライシングバッファーを使用して赤血球を 1 分間除去し、PBS/2% FCS で最大 50 mL の容量にします。335 x g で遠心分離し、上清を流し出す。</li>
		<li>セルをカウントします。製造元の指示に従って、暗闇の中で氷上で30分間CFSEで細胞にラベルを付けます。単一細胞懸濁液を、PBS/2% FCS 中で 1 ウェルあたり 3x10 6 細胞/mL の6 ウェルプレートに懸濁します。</li>
		<li>標識細胞をCYP2E1、JHDN5、またはTFA-OVA(10 μg/mL)のいずれかで、5%CO2、95%空気(加湿)中で37°Cで72時間刺激します。インキュベーション後、細胞をCD4-APC(1:100)で氷上で30分間染色し、3日以内にフローサイトメトリーで分析する。</li>
		<li>CD4+CFSE+細胞を同定するには、以下のゲーティング戦略を利用する:CD4+CFSE+細胞は、ゲーティングされた生きた細胞から同定され、増殖細胞のヒストグラムとして表示される。</li>
	</ol></li>
	<li>免疫マウスからの浸潤免疫細胞の単離。 
	<ol>
<li>14日目または21日目に肝臓に浸潤した免疫細胞を単離するには、40〜60mg/kgのケタミンと4〜6mg/kgキシラジンを混合した腹腔内注射によりマウスを麻酔し、ステップ1.1.1で説明したように適切な麻酔の深さを確認する。1.1.2に記載されているようにマイクロ外科用はさみで作った正中線切開を用いて開腹後、門脈を25ゲージ針でカニューレを作り、腎静脈の下の下大静脈を切断する。</li>
		<li>37°Cの水浴中で40mLのPBSで各肝臓を10mL/minの流速で灌流する。 灌流後、マイクロ外科用はさみを使用して、肝ペディクルで肝臓を切断し、胆嚢を除去し、次いでヒルムで肝臓を切断する。</li>
		<li>20mLの滅菌シリンジ乳棒と冷たいPBSを使用して、メッシュのステンレススチールシーブで肝臓を破砕します。得られた細胞懸濁液を300メッシュスクリーンを用いて50mL予備滅菌遠沈管に濾過する。冷PBSを使用して各懸濁液を50mLにしてから、370 x gで10分間遠心分離して懸濁液を洗浄する。</li>
		<li>上清を捨て、処理によって各ペレットを新しい50mLチューブにプールする(マウス1本につき1本のチューブを推奨するが、サンプルをプールする場合は2〜4本のペレット/チューブを推奨)。プールしたペレットを45mLパーコール35%(PBS中)および100IU/mLヘパリンに懸濁する。</li>
		<li>各チューブを500 x gで20°Cで10分間回転させます。 上清を捨て、ペレットを5mLのPBSに懸濁し、次いで氷上で10分間、各ペレットに1mLのACK溶解バッファーを加える。</li>
		<li>各チューブをPBSで50mLにし、370 x gで10分間遠心分離して洗浄します。上清を捨て、PBS/2% FCSで細胞を370 x gで10分間遠心分離して洗浄します。セルをカウントします。</li>
		<li>
フローサイトメトリーによる細胞型の解析 注:誘導されたFoxp3 + Tregsを検出する方法の例を次に示します。<ol>
<li>1x106細胞をFcRブロッキング試薬と共にインキュベートし、氷上でCD4-FITCおよびCD25-PE、およびCD45-PerCPの1:100希釈液で30分間染色する。次に、細胞内をFoxP3-APCで染色する。</li>
			<li>250 μLの固定バッファー( 材料表参照)で細胞を固定し、フローサイトメトリーによる分析まで3日以内に4°Cで保存した。</li>
			<li>フローサイトメトリーを使用して肝臓、脾臓またはリンパ節からの単一細胞懸濁液中の誘導Foxp3 + Tregsを検出するために、以下のゲーティング戦略が推奨されます:生/死固定可能なアクア死細胞染色キットを使用して生細胞を同定する。次に、CD45+である肝細胞(PerCP、クローンRA3-6B2)にゲートし、CD45+ゲートからCD4+細胞(FITCの、クローンGK1.5)にゲートする。CD4+細胞から、CD25+(PE、クローン7D4)およびFoxP3+(APC、クローン3G3)細胞の割合を同定する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>肝炎に対する肝臓組織の組織学的解析
	<ol>
<li>21日目に、肝臓切片(厚さ5μm)を10%中性緩衝ホルマリンに固定し、ヘマトキシリン&amp;Eosinで染色する。</li>
		<li>最初に2ビューの平均で低電力(40X)で組織学スコアを決定し、64Xで確認します。次のように組織切片をスコア付けする:グレード0=炎症または壊死なし;グレード1 =壊死のない軽度の小葉炎症;グレード2=セクションの&lt;50%を含む小葉の炎症;グレード3=セクションの50%≥関与する小葉性炎症;グレード4 =壊死を伴う炎症。</li>
	</ol></li>
	<li>脾臓および肝臓における組織サイトカインレベルの決定。 
	<ol>
<li>14日目または21日目に、培地設定時に一般的な実験室用ホモジナイザーを使用して、各マウスの肝臓または脾臓サンプル(1g)を1mLのRPMI/2% FCSで滑らかになるまでホモジナイズします。氷の上でサンプルを冷たく保ちます。</li>
		<li>ホモジネートを冷蔵卓上遠心分離機を用いて4°Cで1455 x gで15分間遠心分離する。上清をスナップ凍結し、使用準備ができるまで-80°Cで保存します。サイトカインおよびケモカインレベルは、キットの説明書に従って、市販のELISAキットで測定することができる。サイトカインのレベル(mLまたはμL単位)を組織のpg/gに変換することによって、サイトカインのレベルを標準化します。</li>
	</ol></li>
	<li>CYP2E1、CYP2E1エピトープJHDN5およびTFA薬物代謝産物に対する血清抗体の検出。
	<ol>
<li>14日目または21日目に、40〜60mg / kgのケタミンと4〜6mg / kgのキシラジンを混合してマウスを鎮静させる。正しい反射の喪失および眼瞼反射の喪失に加えて、筋肉の緊張の低下およびつま先のピンチ(離脱反射)などの痛みを伴う刺激に対する反応がないことを観察することによって、麻酔の適切な深さを確認する。ツベルクリン注射器に取り付けられた25G針を利用し、針を肋骨の下の胸腔にゆっくりと進め、剣状突起の直後に横に進んで心臓に近づく。心臓内穿刺を使用して血液を採取する。</li>
		<li>血液が採取されたら、室温で凝固させます。血液サンプルを295 x g で室温で20分間遠心分離します。血清を慎重に取り出し、血清をアリコートし、-20°Cでスナップフリーズする。</li>
		<li><li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li></ol>

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<li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li>
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著者らには開示するものは何もありません。

このプロトコルの強みは、その再現性にあります。したがって、提案された手順に従うことが重要です。免疫原の製剤は、いくつかの障壁となり得る;しかし、我々は我々の文書に記載されているエピトープを使用してモデルを再現したので、肝臓のS100画分を単離する必要性は取り除かれた。追加のエピトープまたはタンパク質が改変され、免疫化後に肝炎を誘発する可能性がある。ただし、信頼できる結果で使用したタンパク質について説明します。いくつかのタンパク質は、ハロゲン化麻酔薬曝露時にトリフルオロアセチル化されることが実証されている。エピトープ拡散に起因する可能性が最も高いが、これらのタンパク質のいくつかは、それらの天然の非トリフルオロアセチル化状態における自己抗体の標的でもある。一例として、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体(PDH-E2)のE2サブユニットは、TFA付加物中のTFA部分と構造的に類似したエピトープ(リポ酸補欠分子基)を運ぶ。ハロタン肝炎患者において産生された抗体は、TFAタンパク質およびPDH−E2に対して交差反応性であることが実証されている20,21<sup class="xr...

この方法の目的は、生体内で発症する薬物誘発性自己免疫性肝炎のマウスモデルを記述し、この疾患の分子的、免疫学的および遺伝的基盤を調査するためにどのように利用できるかを実証することである。私たちの研究の長期的な目的は、感受性のある患者のDIHを研究することによって、慢性肝臓の炎症および傷害の発症に関与するメカニズムを明らかにすることです。肝疾患および肝硬変は、25〜64歳の成人における6番目に多い死因を構成する。薬物誘発性自己免疫性肝炎(DIH)と呼ばれることもある特異なDILIは、米国における急性肝不全の3番目に一般的な原因である。DIHは、自己免疫性肝炎患者の約9〜12%で観察される最も一般的な肝薬剤誘発性過感作プロセスである1。DIH患者の圧倒的多数は女性2,3,4である。DIHの一種は、イソフルラン、セボフルラン、デスフルランまたはハロタンなどのハロゲン化揮発性麻酔薬の投与後に感受性の高い個体に発症する。これらの麻酔薬は、代謝の反応性産物とともに肝臓タンパク質に共有結合し、アレルギー応答または自己免疫応答を惹起することができる新規自己抗原を創り出す5。
麻酔薬およびあらゆる形態のDIHの発達に関与する病原性メカニズムの研究は、ヒト疾患の誘発を密接に模倣する動物モデルの欠如によって以前に妨げられてきた。我々は、患者における免疫媒介性DILIに似た特徴を有するDIHの実験的マウスモデルを開発した。肝炎は、酵素シトクロムP450 2E1(CYP2E1)5による麻酔薬の酸化的代謝に続いて形成されるトリフルオロアセチルクロリド(TFA)代謝産物によって共有結合的に修飾された2つの自己抗原のうちの1つによる免疫によって誘導される。1つの自己抗原は、いくつかのタンパク質6の混合物である肝細胞質S100肝臓画分であり、第2の自己抗原は、麻酔免疫媒介性DILI7を有する患者からの血清によって認識されるCYP2E1のエピトープである。実験的自己免疫性肝炎に比較的耐性のあるBALB/cマウスを用いることで、C57Bl/6Jマウスの自己免疫性肝炎のS100誘導免疫モデルと我々のモデルを区別した8.
その多様な臨床プレゼンテーションのために、DIHは患者で研究することは困難です。翻訳実験モデルは、インビボおよびインビトロで疾患の病因を評価する能力を提供する。現在のところ、動物を使用せずにインビボまたはインビトロの適応免疫応答または自然免疫応答を完全に調べるDIHを誘導するための他の代替方法はありません。さらに、S-100またはCYP2E1エピトープのトリフルオロアセチル化は刺激性免疫原を産生するようには見えず、TFA改変タンパク質による免疫化によってDIHを誘導しているため、これらの動物は、免疫化または他の処置の前にエーテル、ハロゲン化麻酔薬、バルビツール酸またはアルコールを投与されない。それでも、我々は、発見したCYP2E1エピトープ9 の結合嗜好を確認するためにコンピュータシミュレーションを利用してマウスの使用を減らし、雌のBALB/cマウスがより重篤なDIH10を発症することを実証することによって、女性の性別に関与するヒトDIHを反映した。
患者におけるDIHの多様な提示および臨床疾患の研究における課題にもかかわらず、反応性薬物代謝産物による天然タンパク質の翻訳後修飾は、ハロゲン化麻酔薬に続く病因DIHにおいて受け入れられている重要なメカニズムである11。研究者らはまた、CYP2E1がこのプロセスにおける主要な自己抗原であることを認める12,13。翻訳後修飾CYP2E1および他の肝臓タンパク質を認識するインターロイキン(IL)-4-アップレギュレートCD4+T細胞の役割は、好中球、好酸球および肥満細胞を肝臓に引き込むことによって麻酔DIHの受け入れられた開始剤であり14、このメカニズムはDIH15,16の多くの形態で確認されている。誘導されたFoxP3発現CD4+CD25+T細胞(Tregs)はDIHの重症度を低下させ、脾臓におけるこれらの細胞の相対的欠損はDIHを悪化させる10,7。したがって、DIHの理解における進歩の大部分は、in vivoマウスモデルを利用して、in vivoおよびin vitroの両方でDIHの遺伝的、代謝的および免疫学的メカニズムを評価することによって可能になった。
我々と他の研究者は、異なるマウスモデルを用いたDIHの開始におけるIL-4、好中球、好酸球の役割を明らかにしたので、この観察は、利用されたDIHモデルにかかわらず、肝炎および傷害はIL-4によって誘発されるという我々の主張を支持すると信じている。私たちのプロトコルの強みは、雄と雌の両方のマウスのin vivo方法論の利用、および組織学、CD4+ T細胞増殖アッセイ、サイトカインの繰り返しにあります。インビトロ研究の強みは、DIHを駆動する細胞相互作用を単離するための方法論を提供しながら、必要なマウスの数を減らすことです。これは、DIHの発生率、有病率、および重症度が女性でより高いため、結果の解釈における無意識の偏りの可能性を低減し、研究の翻訳の可能性を強化するため、雄および雌マウスの使用をお勧めします17。マウスは単一のベンダーから入手することをお勧めします。ただし、これが不可能な場合は、遺伝子組み換えマウスと同じベンダーから同腹仔対照または野生型マウスを入手してください。

<table><tbody><tr><td>0.1% 2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP基板キット</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>BALB / cマウス</td><td>ジャクソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace&trade;CFSE 細胞増殖キット</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>FcR ブロッキング試薬</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>一般サプリメント</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG&trade; 細胞 凍結保存</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead 固定可能アクアデッドセルステインキット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>ミリポアシグマ</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>パーコレクション</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>リスト生物製剤</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水pH 7.4</td><td>さまざまな</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピアス&トレード;プロテアーゼ阻害剤ミニ錠、EDTAフリー</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-エチルトリフルオロチオアセテート (S-ETFA)</td><td>ミリポア シグマ</td><td>177474</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer 透析カセット (10 K、12 ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&trade;SDS溶液、10%</td><td>サーモフィッシャー</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>ウィリアムズ培地E、フェノールレッド不使用</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

balb/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

薬物誘発性自己免疫性肝炎(DIH)は、自己免疫性肝炎患者の約9〜12%で観察される最も一般的な肝性薬物誘発性過敏症プロセスである。DIH患者の圧倒的多数は女性です。有病率におけるこれらの性差の根底にあるメカニズムは、ヒトの疾患を模倣する動物モデルの不足のために不明である。それでも、根底にあるメカニズムは、ヒト白血球抗原ハプロタイプおよび性ホルモンと関連していると広く考えられている。対照的に、DIHマウスモデルを用いて、我々は、シトクロムP450 2E1のエピトープに対するIL-4開始CD4+ T細胞が、好中球、マクロファージおよび肥満細胞の雌BALB/cマウスの肝臓への流入を誘導することを明らかにした。このモデルを用いて、我々はまた、IL-33誘導性FoxP3+制御性T細胞が雌および雄マウスにおいてDIHに対する保護を付与することも示した。このDIHモデルは、DIHに関連する薬物代謝産物と共有結合で改変されたCYP2E1のエピトープでマウスを免疫することによって誘導される。このエピトープは、DIHを有する患者によって認識される。我々の方法は、DIHの病因を研究するために利用することができる堅牢で再現性のある肝炎および自己抗体を誘導する。インビボ研究は不適切に行われるとマウスに過度の痛みや苦痛を引き起こす可能性がありますが、インビボモデルの利点は、多数のマウスにおける疾患の病因を評価する能力です。さらに、改変された肝臓タンパク質の生物学的効果は、侵襲的手順を用いて研究することができる。実験計画にin vitro研究を追加することで、細胞レベルでの迅速な反復と機械解析が可能になります。したがって、我々は、我々のモデルプロトコルと、DIHのインビボおよびインビトロメカニズムを研究するためにそれをどのように利用することができるかを示す。

図1に示すDIHを誘導するために利用される免疫化スケジュールは、首の付け根(0日目)および尾の付け根(7日目)で必要とされる2つの免疫化を表す。図2は、麻酔薬のCYP2E1、JHDN5、CYP2E1エピトープおよびトリフルオロアセチル(TFA)代謝産物に応答してCFSEを使用して14日目に得られた代表的な増殖データを示す。図3は、14日目に得られた誘導CD4+CD25+FoxP3+Tregsのゲーティング戦略および代表的なフローサイトメトリー分析を示す。図4は、代表的なヘマトキシリンおよびエオジン染色スライドを示し、6日目の21日目の肝炎の進化を実証する。図5は、これらの肝臓10における比較細胞含量に加えて、21日目に雄と比較した場合、雌BALB/...

BALB/cマウスにおけるin vivo免疫型翻訳型肝炎モデルについて、本疾患に見られる性差を含む薬剤性自己免疫性肝炎の病態解明に利用することができる。このモデルが、in vivoおよびin vitro実験技術を使用して再現可能な分析をどのように実証するかを説明します。

BALB/cマウスにおける薬物誘発性自己免疫性肝炎の誘導による発症機序の研究

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

肝疾患と肝硬変は、25歳から64歳までの成人の6番目に多い死因です。特異体質DILIは、薬物誘発性肝炎、自己免疫性肝炎、または免疫介在性肝炎と呼ばれることもあり、米国で3番目に多い急性肝不全の原因であり、最も一般的な肝薬物誘発性減感作プロセスです。このプロセスは、自己免疫性肝炎患者の約9〜12%で発生し、この形態の肝炎は、医薬品が商業市場から排除される最も一般的な理由です。薬物誘発性肝炎の患者の圧倒的多数は女性です。このプロトコルでは、肝炎、自己抗体、性差など、患者に見られる重要な特徴について説明します。この技術の主な利点は、in vivoマウスモデルでの再現性であり、これにより科学者は病気の進行とその続編を観察する機会を得ることができます。このプロトコルを使用して、麻酔薬とウイルス性肝炎に共通のエピトープを発見しました。これは、麻酔薬性肝炎患者の支配的なエピトープであり、ウイルス性肝炎患者の線維化と有意に関連しています。私たちは、この情報を使用して、薬物誘発性肝炎またはウイルス性肝炎、または関連する線維症の特定の診断検査を開発できると考えています。これにより、この疾患またはその後遺症を発症するリスクのある個人を予測できると期待されています。書かれた手法は、結果の再現性を確保するために常にいくつかのチェックとバランスを使用しているため、圧倒される可能性があります。初めて実験を行うときは、十分な時間を確保してください。初めてスルーした後、それはかなり速く進みます。BALB/cマウスの安楽死後、正中線切開を使用して顕微手術用ハサミで腹腔内内容物を露出させ、下大静脈に小さな切り込みを入れて血液を採取します。次に、24ゲージの血管カテーテルを門脈に留置します。PBSを摂氏4度の水浴に保持し、蠕動ポンプを使用して、毎分10ミリリットルの割合で40ミリリットルのPBSを肝臓に大量に投与します。マイクロハサミで、腹部から肝臓を慎重に解放し、風袋を引いた計量ボートで肝臓の重さを量ります。肝臓を10〜15ミリメートルの小さな小片に切ります。肝臓サンプルと、マウス肝臓の4倍の重量の均質化バッファーを15ミリリットルのポリプロピレンチューブに加え、原稿に従って完全なプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤を補充します。一般的なラボ用組織ホモジナイザーを中速で使用して、サンプルを氷上で滑らかになるまで均質化します。肝臓のホモジネートを1, 500倍Gで10分間遠心分離し、上清の細胞質S100を注ぎます 再び100, 000倍のGで遠心分離した後、上清の細胞質S100をドライアイスで急速凍結し、チューブをマイナス80°Cで凍結します。トリフルオロアセチル化を開始するには、S100を室温で解凍します。次に、三角フラスコで、20ミリグラムのマウスS100を脱イオン水で10ミリリットルに希釈します。pHメーターを使用して、1-ノルマル水酸化カリウムでpHを10に調整します。ドラフトで、4.7ミリモルのS-ETFAを溶液に加えます。1-ノルマル水酸化カリウムを液滴状で約1時間投与することにより、pHを9.9〜10.0に維持します。.各反応の水酸化カリウムの総量を記録します。溶液を別々の透析カセットに移します。カセットを4リットルの脱イオン水に入れ、1日3回の交換で72時間透析します。透析後、トリフルオロアセチル化S100の最終量を記録し、標識チューブに分注します。チューブをドライアイスで急速冷凍し、マイナス80°Cで保存します。原稿に従って決定されたタンパク質濃度で、1ミリグラムあたり1ミリグラムを超える場合は、天然タンパク質とTFA修飾タンパク質をそれぞれ1ミリグラムずつ、別々の弾丸チューブ内の1ミリリットルの脱イオン水に加えます。1ミリリットルの脱イオン水を使用して弾丸チューブにブランクを準備します。96ウェルプレートに、ブランクタンパク質、ネイティブタンパク質、および改変タンパク質をそれぞれ50マイクロリットルずつ二重に加えます。次に、50マイクロリットルの4%重炭酸ナトリウム溶液を追加し、続いて50マイクロリットルの0.1%2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸を各ウェルに加えます。プレートを摂氏40度で2時間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルに50マイクロリットルの10%SDSを加え、続いて25マイクロリットルの1-ノルマル塩酸を加えます。マウスの免疫と麻酔の後、顕微手術用ハサミを使用して腹腔を露出させます。脾臓を特定します。椎弓根で脾臓を切開し、2%の子牛胎児血清を含むPBSを入れたペトリ皿に入れます。細胞を放出するには、脾臓を2つのすりガラススライドの間に挟み込み、それらをこすり合わせます。電動ピペットを使用して、細胞を50ミリリットルの円錐形ポリプロピレンチューブに移します。洗浄するには、2%FCSを含むPBSをチューブに加えて50ミリリットルの容量にし、卓上型冷蔵遠心分離機を使用してGの335倍で遠心分離します。上澄みを注ぎ、洗浄手順を繰り返します。1ミリリットルのACK溶解バッファーをチューブに加え、1分間洗浄して赤血球を除去します。次に、FCSを添加したPBS洗浄ステップを繰り返します。CFSEで細胞を30分間標識した後、1ミリリットルあたり10マイクログラムのシトクロムP450 2E1、JHDN5、またはトリフルオロアセチル化オボアルブミンを加えて、インキュベーター内で標識細胞を摂氏37度で72時間刺激します。インキュベーション後、アロフィコシアニンで標識したCD4で細胞を1:100の比率で氷上で30分間染色します。原稿に記載されているように免疫マウスの開腹術後、25ゲージの針で門脈をカニューレし、腎静脈の下の下大静脈を切断します。摂氏37度の水浴で、毎分10ミリリットルの流量で40ミリリットルのPBSを各肝臓に灌流します。灌流後、顕微手術用ハサミを使用して、肝茎で肝臓を切断し、胆嚢を切除し、次に肺門で肝臓を切断します。300メッシュのステンレス鋼ふるいで、20ミリリットルの滅菌注射器乳棒と冷たいPBSを使用して肝臓を破壊します。このスクリーンを使用して、得られた細胞懸濁液を50ミリリットルの滅菌済み遠心チューブにろ過します。冷たいPBSを使用して各懸濁液を50ミリリットルに戻し、次いで懸濁液を370倍Gで10分間遠心分離して洗浄し、上清を廃棄し、次いで処理によってペレットを新しい50ミリリットルのチューブに結合する。PBSおよび1ミリリットルあたり100国際単位であるPBSおよび100国際単位を含むPBS中の35ミリリットルの混合ペレットを懸濁します。次に、各チューブをGの500倍で20°Cで10分間回転させます。上清を捨て、ペレットを5ミリリットルのPBSに懸濁し、次に各ペレットに1ミリリットルのACK溶解緩衝液を加えて氷上に10分間保存します。370倍Gの遠心分離によりPBSで再度洗浄した後、上清を捨て、FCSを添加したPBSで細胞を370倍Gで10分間遠心分離して細胞を洗浄します。この実験では、CD4+T細胞の免疫応答をフローサイトメトリーを用いて決定しました。代表的な増殖データは、トリフルオロアセチル代謝物、シトクロム-P450 2E1、シトクロム-P450 2E1エピトープ、JHDN5に応答してCFSEを使用して14日目に取得されました。.抗原を含まないウェルをコントロールとして使用しました。対照と比較すると、BALB/cマウスはトリフルオロアセチル化オボアルブミンおよびシトクロムP450 2E1に応答して増殖を発症したが、JHDN5には応答しなかった。完全なフロイントのアジュバント免疫でTFAを乳化してから3週間後、雌のBALB/cマウスは、雄のBALB/cマウスと比較して、より多くの薬物誘発性自己免疫性肝炎を発症しました。肝臓組織の組織学的分析でも、雌マウスでは雄マウスよりも重度の肝炎炎症が示されています。肝臓のCD4+CD8+NK+およびNKT+細胞の数は、男性よりも女性の方が有意に多かった。これらのマウス間でB細胞に違いは見られませんでしたが、長い一日ですが、この製剤は長持ちすることを忘れないでください。この手順は、エピトープをトリフルオロアセチル化するためにも実行できます。この手順により、研究者は肝疾患の発症の時間経過を解剖し、タンパク質と経路の新たな発見の可能性を高めることができました。S-エチルトリフルオロチオアセテートは有毒であり、ドラフトで取り扱う必要があります。さらに、優れたラボの実践と手法を強くお勧めします。

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