Nanoplasmon の散乱と低倍率の顕微鏡イメージングによる腫瘍由来エキソソームの定量化
May 24th, 2019
疾患および悪性細胞に対するエキソソーム由来のバイオマーカーの臨床翻訳は、迅速かつ正確な定量方法の欠如によって妨げられている。このレポートは、低倍率の暗視野顕微鏡画像を使用して、少量の血清または血漿サンプル中の特定のエキソソームサブタイプを定量化することについて説明する。
ナノプラズモン強化散乱(nPES)は、時間のかかる労力を要するエキソソーム浄化ステップをスキップし、外因性分析の臨床現場への応用を拡大することができる外科的生検に対する単純で非侵襲的な代替手段である。このnPESアッセイは、分離した分離および精製ステップを必要としないエキソソームの外膜上の特定のバイオマーカーを分析するための迅速な手順である。このアッセイには非常に小さな臨床サンプルしか必要としないです。
したがって、この方法は、遺伝子操作またはPDXマウスモデルの研究にnPESの使用を拡大することができます。このプロトコルには、困難に思えるいくつかの手順があります。しかし、いくつかの練習を行えば、基本的なウェットラボスキルを持つすべての人がnPESを正常に実行することを学ぶことができます。
手順を開始するには、NeutrAvidin機能性ゴールドナノロッドの懸濁液の40マイクロリットルを、200マイクロリットルの冷たいpH 7リン酸緩衝生理食塩水と組み合わせます。8500倍のgで摂氏4度で10分間遠心し、上清を取り除きます。この洗浄プロセスをさらに2回繰り返し、ナノロッドを40マイクロリットルの冷たいPBSで再懸濁します。
次に、150マイクロリットルの冷たいPBSと10マイクロリットルの適切なビオチン化抗体の1ミリリットルの溶液を懸濁液に加えます。抗体コンジュゲートゴールドナノロッドを得るために2時間摂氏4度で混合します。冷たいPBSの200マイクロリットル部分を摂氏4度でそれぞれ10分間、6500倍の遠心分離でナノロッドを3回洗浄します。
その後、洗浄した抗体共役ナノロッドを200マイクロリットルの冷たいPBSで再懸濁し、最大24時間摂氏4度で保存します。スライドの準備を開始するには、PBSで1ミリリットル当たり025ミリグラムに所望のエキソソーム捕捉抗体を希釈します。この溶液のピペット1マイクロリットルは、光学グレードのガラスで裏打ちされたタンパク質A/ G処理スライドの各ウェルに入れられます。
その後、スライドを加湿ボックスに移し、インキュベーション中に井戸が乾燥しないようにします。キャプチャ抗体を固定するために、スライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。次いで、残りの溶液を吸引し、非結合抗体を除去する。
PBSを1マイクロリットルずつ3回加えて吸い出して井戸を洗います。次に、PBSベースのブロッキングバッファーを1マイクロリットルずつ素早く各ウェルにロードし、スライドを摂氏37度で2時間インキュベートします。15個のサンプルを動かしている場合、ブロッキング剤の蒸発を避けるために、ブロッキングバッファを5分以内で120の井戸にロードするために、単一チャネルのピペットを使用する必要があります。
スライドブロッキング中に抗体コンジュゲートゴールドナノロッドの溶液の調製を開始します。ブロッキングが終了する約30分前に、室温の水浴中の血漿または血清サンプルを急速に解凍する。30秒間解凍したサンプルをボルテックスして、懸濁液が均質であることを確認します。
次いで、サンプルを500倍gで15分間遠心分離し、タンパク質凝集体および他の破片を沈殿させた。上清の10マイクロリットルのアリコートを新鮮なチューブに移し、PBSで1対1の希釈液を作ります。希釈したサンプルを、適宜穏やかな渦または反転によって混ぜます。
スライドブロッキングが終了したら、ブロッキングバッファーを吸引し、PBSの1マイクロリットルの部分でウェルを3回洗浄します。すぐに井戸あたり1マイクロリットルとサンプルあたり8つの複製で井戸にサンプルをロードします。同様に適切な井戸にエキソソーム標準をロードします。
スライドを摂氏4度の冷蔵庫で12~18時間インキュベートします。次いで、ウェルを吸引し、PBSを1マイクロリットルでそれぞれ1回よく洗う。抗体コンジュゲートゴールドナノロッド懸濁液を1マイクロリットルずつ各ウェルに積み込み、スライドを摂氏37度で2時間インキュベートします。
その後、ナノロッド懸濁液を吸引し、1%ポリソルベート20を10分間ミキサーを用いてPBSでスライドを洗浄した。次いで、ウェルを吸引し、回転ミキサーで10分間脱イオン水でスライドを洗浄した。水を取り除き、スライドをきれいなペトリ皿で空気乾燥させてから、スライドを暗視野顕微鏡に持ち込みます。
暗視野油浸縮器、4xの目的およびモーター式の段階が装備されている逆の顕微鏡を置く。デジタルカメラで顕微鏡をコンピュータに接続し、イメージングソフトウェアを開きます。次に、サンプルスライドを顕微鏡ステージ上で上下逆さまに置き、凝縮レンズがスライドに接触するところに液浸油の小さな滴を塗布する。
画像ソフトウェアで顕微鏡を通してビューを表示します。高濃度標準によく照らされた時間を調整して、画像が飽和しないようにします。次に、大きな画像をスキャンするためのツールを開き、目的の倍率を10倍に設定します。
ステージの動きの間にアクティブなシャッターを閉じ、各キャプチャの前に20ミリ秒待つことを選択します。ステッチオーバーラップを20%に設定し、最適なパスを使用してステッチを選択します。スキャンから大きな画像を作成することを選択します。
スキャンの開始時にカメラが手動でフォーカスされるように設定し、20 フィールドごとに自動的にステップバイステップのフォーカスを有効にします。次に、ターゲットスキャンフィールドの左、右、上、および下の制限を設定し、顕微鏡ステージを所望の範囲のそれぞれに移動してスキャン領域を定義します。次に、焦点、凝縮器、および領域照明を調整して、明るく明るい画像を得る。
作成するイメージ ファイルに名前を付け、スキャンを開始します。完了したら、画像を開いて1/8スケールで保存します。画像解析ソフトウェアを開きます。
次に、[プラグイン] メニューを開き、[DSM スキャン] をクリックし、列と行の数を定義し、サイズ変更の割合を 25 に設定し、スポット直径をピクセル単位で 190 ~ 200 に設定し、直径の範囲を 32 に設定し、増分直径をピクセル単位で 8 に設定します。DSM の上限を 0 と 62 に、隣接する距離を 100 に、減算バイアスをゼロに設定します。DSM アルゴリズムを実行し、結果のデータを保存します。
DSM分析技術は、マイクロリットル当たり0.24~1.2マイクログラムの連続希釈PANC-1エキソソームサンプル全体で良好な再現性を示した。金ナノロッドからの散乱応答とエキソソームタンパク質濃度との間には強い線形相関が認められた。膵臓癌患者と健康な患者の間で癌関連バイオマーカーEphA2を発現する血清エキソソームの存在量に有意な差が認められた。
ブロッキング剤の添加以降、サンプルの蒸発を避け、クロスコンタミネーションを導入し、スライドの表面を傷つけるために、迅速かつ正確なピペット処理が重要です。この手順に従って、対象となるエキソソームバイオマーカーの発現と、研究されている疾患の異なる段階との間の相関関係を調べる統計解析を行う。この技術を確立した後、初期の膵臓癌の外生バイオマーカーを見つけることができます。
現在、この発見を他のタイプの癌や感染症に拡大しています。通常、このアッセイで取り扱うサンプルは、患者のサンプルまたは癌細胞株からの精製エキソソームサンプルのいずれかで、特別な安全トレーニングを必要とする。
概要
この研究は、小規模な臨床サンプルにおけるエクソソーム由来のバイオマーカーの迅速な分析のための新しいナノプラズモン増強散乱（nPES）アッセイを提示します。この方法は、エクソソームの精製の必要性を排除することでプロセスを簡素化し、臨床応用に適しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- バイオマーカー分析
- エクソソーム研究
- 臨床診断
背景
- エクソソーム由来のバイオマーカーは、様々な疾患を理解する上で重要です。
- エクソソームを定量化するための現在の方法は、しばしば時間と労力がかかり複雑です。
- 迅速で正確な定量化技術の必要性があります。
- nPESは従来の生検方法に対する非侵襲的な代替手段を提供します。
研究目的
- エクソソームバイオマーカーを分析するための迅速なアッセイを開発すること。
- 臨床設定におけるエクソソーム分析の使用を促進すること。
- 最小限のサンプル体積で実行できる方法を提供すること。
使用された方法
- NeutrAvidin機能化された金ナノロッドの調製。
- バイオチニル化抗体とのナノロッドの組み合わせ。
- エクソソーム捕捉抗体を用いたスライドの準備。
- エクソソームのイメージングと定量化のためのダークフィールド顕微鏡。
主要な結果
- nPESアッセイは、特定のエクソソームサブタイプを正確に定量化します。
- 様々なサンプル希釈にわたる再現性を示しました。
- 小さな血清または血漿サンプルの分析を可能にしました。
- 遺伝子改変マウスモデルへの応用可能性を示しました。
結論
- nPESアッセイは、臨床バイオマーカー分析のための有望なツールです。
- この方法は、疾患メカニズムの理解を深めることができます。
- 将来の応用には、より広範な臨床診断が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid quantification of tumor-derived exosomes using nanoplasmon-enhanced scattering (nPES) and low-magnification imaging addresses a critical bottleneck in translational biomarker discovery and disease monitoring. By eliminating labor-intensive exosome purification, this workflow enables scalable, reproducible analysis of membrane-associated biomarkers from minimal clinical samples. The approach supports early-stage target validation and accelerates biomarker-driven portfolio decisions in oncology and infectious disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of disease-associated exosome biomarkers from patient or model samples.
- Facilitates functional target validation by quantifying biomarker abundance without isolation artifacts.
- Supports predictive confidence in biomarker selection for downstream translational studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible assay format for high-throughput exosome biomarker screening.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across conditions and cohorts.
- Reduces sample handling complexity, minimizing variability and supporting platform scalability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns exosome biomarker quantification with disease-relevant models, including PDX and genetically engineered mice.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting biomarker-driven stratification.
- De-risks translational advancement by providing robust, reproducible biomarker data from small-volume samples.
Pipeline & Workflow Integration
This nPES-based exosome quantification method integrates from early discovery through translational biomarker validation, supporting lead identification and preclinical decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking by enabling direct measurement of exosome-associated biomarkers.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for scalable biomarker evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, statistically analyzable outputs for cross-sample comparison.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for exosome biomarker analysis across multiple disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in biomarker-driven programs.
- Operational Value: Streamlines workflows through standardization, reproducibility, and minimal sample requirements.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in biomarker portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of biomarker candidates.
Implementation Considerations
- Requires basic wet lab skills and familiarity with antibody-based assays.
- Needs access to dark-field microscopy and compatible image analysis software.
- Demands precise pipetting and timing to ensure reproducibility and avoid cross-contamination.
- Adaptable to both clinical and preclinical sample types, including patient plasma and model-derived exosomes.
- Sample safety and handling protocols must be followed for clinical and cell line materials.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
Preparation of Nanoparticle Probes (AuNR-IgG)
2:17
Preparation of Extracellular Vesicle Capture Slides and Exosome Capture
5:17
Low-Magnification Dark-Field Microscope (LMDFM) Image Acquisition and Analysis
7:48
Results: Exosome Quantification by Analysis of LMDFM Images
8:25
Conclusion
