Name: Nanoplasmon の散乱と低倍率の顕微鏡イメージングによる腫瘍由来エキソソームの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶナノプラズモン増強散乱法による腫瘍由来エキソソームの迅速定量法。精製不要で少量の臨床サンプルから外膜バイオマーカーを解析し、がん診断や疾患メカニズム解明に応用可能です。

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この作品は主に NIH (U01CA214254、R01HD090927、R01AI122932、R01AI113725、R21Al126361)、アリゾナ生物医学研究委員会 (ABRC) 若手研究者賞によって提供された調査資金によって支えられました。

1. ナノ粒子プローブの作製
注: このアッセイでは、ニュートラポリマー (AV) と共有結合されている官能化ゴールドナノロッド (AuNRs の直径 x 71 nm の長さ) と、DFM で赤 (641 nm ピーク) の散乱信号を生成する表面プラズモン共鳴ピークがあります。照明。
<ol><li>遠心分離および吸引 (10 分間の4° c で 8500 x g) による200μ l の PBS (pH 7.0) で AuNR (2.56 x 10 11 粒子) を3回40洗浄し、続いて AuNR-AV ペレットが懸濁される最終遠心分離および吸引ステップPBS に40μ l を加えた。</li>
	<li>対象のエキソソームサブタイプと PBS の150μ l の表面の抗原に特異的な10μ l のビオチン化抗体 (0.5 mg/mL) でこの AuNR 懸濁液を混合し、4° c で2時間混合し、ミキサーを使用してニュートラ-ビオチン結合を完了させます。</li>
	<li>得られた抗体共役 AuNRs (AuNR) を遠心分離と吸引 (10 分間は4° c で 6500 x g ) で3回洗浄し、200μ l の PBS で懸濁し、使用まで4° c で保存します。 注: 滅菌技術および短い貯蔵時間は、AuNR-IgG の汚染および分解を避けるために使用する必要があります。それは、それらのコンジュゲーションの24時間以内に抗体共役 AuNRs を使用するのが最善です。</li>
</ol>2. EV キャプチャスライドの作成
<ol><li>希釈したエキソソームは、PBS で 0.025 mg/mL の抗体を捕捉し、この希釈液をマルチウェルプロテイン A/G スライド上に1μ l/ウェルを加え、このスライドを加湿されたチャンバ内の37° c でインキュベートし、タンパク質 A/G に固定化された抗体結合を可能にします。スライド。</li>
	<li>未結合抗体を除去するために井戸を吸引し、PBS の1μ l/ウェルの添加と吸引によってウェルを3回洗浄し、その後、1μ l のブロッキングバッファー (材料の表を参照) で各ウェルを負荷し、加湿されたチャンバ内の37° c で2時間スライドをインキュベートします。残りのタンパク質結合部位をロックします。</li>
	<li>ブロッキングバッファーを除去するためにウェルを吸引し、PBS の1μ l/ウェルの添加および吸引によってウェルを3回洗浄し、ブロックされたスライドを直ちに使用してエキソソームを捕捉および分析する。</li>
</ol>3. 標準曲線の準備
<ol><li>特定のエキソソームサブタイプの絶対的または相対的な存在量を正確に定量化するために、ユーザは、目的のエキソソーム表面バイオマーカーを均一に発現する純粋なエキソソーム集団を有する標準曲線を生成しなければならない。本研究は、膵癌期と予後6,18との関係が報告されている転移関連膜タンパク質、エフリン A2 受容体を発現するエキソソームの存在量を分析する。 注: ヒト膵臓がん細胞株 PANC およびそのエキソソームは、このタンパク質を発現することが知られており、この細胞株から単離されたエキソソームを、複雑なエキソソームにおいてこのタンパク質を発現するエキソソームの数を定量化する標準曲線を生成するために使用したサンプル。</li>
	<li>無血清培地中で37° c で48時間培養細胞を培地中にエキソソーム蓄積させ、次いで、付着細胞培養から培養培地の懸濁培養または直接吸引の遠心分離によって細胞培養上清を単離する。</li>
	<li>2000 x gで回収した培地を30分間遠心し、残骸を除去し、上清を回復させる。</li>
	<li>適切な容量の0.45 μ m 低タンパク質結合フィルタユニット (例えば 250 mL polyethersulfone 真空濾過ユニット) を通して、清澄化された培養上清を濾過する。</li>
	<li>得られた濾液を、10万の公称分子量制限フィルタシステムを用いて 3200 x gで遠心分離することによって、250μ l の最終体積に濃縮する。このフィルターから保持された容積を集め、200μ l の PBS でフィルターを洗浄し、集められたエキソソームのサンプル容積とこの洗浄容積を結合しなさい。</li>
	<li>このサンプルを45分間、21000 x gで遠心分離して慎重に上澄み液を回収し、沈殿した物質を収集しないように注意してください。</li>
	<li>回収した上清を 10万 x gで3時間遠心し、エキソソームを沈殿させる。上澄みを吸引し、エキソソームペレットを100μ l の PBS で回収します。</li>
	<li>得られたエキソソーム懸濁液は、24時間以内に使用した場合は4° c、長期保管の場合は-80 ° c で保管してください。 注: 凍結融解サイクルを繰り返すためにエキソソームサンプルを対象としないでください。</li>
	<li>エキソソーム数の直接測定によって混合後のエキソソーム懸濁液のアリコートを定量化する (例えば、ナノ粒子追跡分析またはチューナブル抵抗パルスセンシングによる、またはマイクロ bicinchoninic によるエキソソームライセートのタンパク質濃度を測定することによって酸アッセイ、または同等の方法、エキソソーム量に近似する手段として)16、19。</li>
	<li>エキソソーム懸濁液の連続希釈のセットを生成して、ナノ粒子シグナルのエキソソーム数またはタンパク質含量の比較を可能にする。</li>
	<li>各エキソソーム標準の1μ l を、アッセイプレート上の各複製ウェルに移します。 注: 標準曲線は、ナノ粒子シグナルとエキソソーム濃度の間の相関線の傾きを計算するために使用することができ、(1) アッセイ性能を評価し、(2) 実験サンプル中の標的エキソソームの相対濃度を決定する。</li>
</ol>4. ヒト血漿または血清サンプルの処理
<ol><li>標準的な方法によって血しょうまたは血清のサンプルを集め、エキソソームの分析のために必要とされるまで-80 ° c で貯える。室温の水浴でサンプルを急速に解凍します。融解したサンプルを繰り返し混ぜて均質懸濁液を促進する。 注: 血清および血漿サンプルからの結果は、凝固反応中にエキソソームの有意な放出があるため、同等ではない可能性がある。</li>
	<li>血漿または血清サンプルを15分間 500 x g で遠心分離し、タンパク質凝集体およびその他の破片を沈殿させます。血漿または血清サンプルのアリコートを新鮮なチューブに移し、PBS を加えて1:1 希釈を生成する。希釈したサンプルを、適宜、穏やかなボルテックスまたは反転によって混ぜる。各血漿または血清懸濁液の1μ l をアッセイプレート上のそれぞれの複製ウェルに移す。</li>
</ol>5. エキソソームの捕捉と検出
<ol><li>ブロックされた EV キャプチャーの負荷ウェルは、エキソソームサンプルの1μ l/ウェルを使用して、サンプルあたり8回の反復を用いて、加湿チャンバ内の4° c で一晩中スライドをインキュベートします。すべてのサンプルウェルを吸引し、PBS の1μ l/ウェルを加えて井戸を洗浄し、未結合のエキソソームおよびその他の汚染物質をロードされたエキソソームサンプルから除去します。</li>
	<li>前もって調製された AuNR 懸濁液の1μ l を使用してサンプルウェルを負荷し (上記の第1項を参照)、加湿チャンバ内で37° c で2時間スライドをインキュベートします。ナノ粒子溶液を吸引し、PBS 中のスライドをミキサーを使用して10分間 0.01% トゥイーンスパン (PBST) で補充し、回転ミキサーを使用して10分間、すべてのサンプルウェルを脱イオン水で洗浄し、その後の LMDFM 画像に対して空気乾燥します。 注: アッセイ間の変動係数 (Cv) は、同じサンプルの8回の反復から評価されます。Cv > 20% を示すサンプルは、情報がないと見なされ、十分なサンプルがある場合は繰り返す必要があります。</li>
</ol>6. DFM イメージキャプチャ
<ol><li>ダークフィールドコンデンサー (1.2 < NA < 1.4) を搭載した顕微鏡に接続されたデジタルカメラと 1/220 s の露光時間を採用した4倍の対物レンズを使用して、一貫した照明下でのエキソソーム定量の画像をキャプチャします。</li>
	<li>イメージキャプチャソフトウェアを開きます。 注: 以下に説明するプロトコルの NIS 要素顕微鏡イメージングソフトウェア (資料の表を参照) を使用しますが、そのイメージキャプチャパラメータと一致する別のソフトウェアを使用することは可能です。NIS 要素ビューアーイメージングソフトウェアは、分析、視覚化、およびアーカイブツールを含む画像ファイルとデータセットを表示するための無料のスタンドアロンプログラムです。以下のパラメータはオートフォーカスを備えた顕微鏡用でもあり、複数の画像を自動的にキャプチャして単一の画像にステッチすることを可能にする自動化ステージもあります。</li>
	<li>スライドを顕微鏡の段階に逆さまに置き、スライドの位置を調整し、コンデンサーレンズがスライドに接触するスライドの背部に液浸オイルの小さい低下を加える。</li>
	<li>ソフトウェアインターフェイスの [ライブ] ボタンをクリックし、高濃度の標準ウェルに対して露光時間を調整して、画像が飽和していないことを確認します。</li>
	<li>[取得] タブから [大容量画像をスキャン] ウィンドウを開き、ソフトウェアインターフェイスのパラメータを次のように設定します。マクロイメージオプティカル conf = current;目的: 2: 10x、走査光 conf = 現在、目標: 2: 10x。ステッチオーバーラップ= 20%;Via = 最適なパスをステッチします。</li>
	<li>大きい画像の作成を選択し、ステージの移動中にアクティブなシャッターを閉じ、各キャプチャの前に待機します:20 ミリ秒、開始時に手動でフォーカスし、 20 フィールドごとにステップバイステップのフォーカスを使用します。これらの設定は、スキャンした画像と一緒に保存されます。</li>
	<li>[顕微鏡] ステージを移動して、ターゲットスキャンフィールドの左上右下の下限を定義します。モニター上の鮮明な画像を実現するためにフォーカスを調整し、必要に応じてコンデンサー設定と環境照明を調整して、フォーカスされた画像内の照明の不規則性を最小限に抑えます。</li>
	<li>ソフトウェアのイメージ出力ファイルに名前を付けます。スキャンボタンをクリックして、顕微鏡がスキャンし、作成し、スライド全体のステッチ画像を保存することができます。</li>
	<li>使用している画像キャプチャソフトウェアで保存した画像を開き、ImageJ の DSM プラグインでのその後の解析のために1/8 スケールで保存します。</li>
</ol>7. DFM 画像解析
<ol><li>ImageJ プログラム (https://imagej.nih.gov/ij/) をダウンロードします。Https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually に記載されている手順を使用して、DSM アルゴリズムプラグインを ImageJ にインストールします。</li>
	<li>ImageJ ソフトウェアを開き、DSM アルゴリズム内で次の入力パラメータを設定します。輪郭閾値 (Ct) = 253.020、タイプ= 赤、中心スケール (S) = 0.8、低 (Lt)/High (Ht) 定量限界= 0/62。</li>
	<li>セクション6.8 から保存された画像を ImageJ で開きます。プラグインタブからDSM スキャンボタンを選択し、開いた画像に応じて列と行の数を定義します。プログラムは、検出領域を認識し、自動的に領域に従ってナノ粒子の散乱強度を解析することができます。DSM スキャンウィンドウ内で次の入力パラメータを設定します。サイズ変更の割合= 25、スポットの直径 (ピクセル単位) = 190 –200、直径の範囲= 32、増分の直径 (ピクセル) = 8、 DSM の構成-低limit = 0、上限= 62、隣接距離= 100、バイアス = 0 の減算。 注: ナノ粒子の散乱強度の結果は、スライド上の結合したエキソソームの量を反映しています。</li>
</ol>

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<li>Boussadia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidic+microenvironment+plays+a+key+role+in+human+melanoma+progression+through+a+sustained+exosome+mediated+transfer+of+clinically+relevant+metastatic+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+%26+Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Acidic microenvironment plays a key role in human melanoma progression through a sustained exosome mediated transfer of clinically relevant metastatic molecules.</a> Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 37 (1), 245(2018).</li>
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<li>Koshikawa, N., Minegishi, T., Kiyokawa, H., Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+detection+of+soluble+EphA2+fragments+in+blood+as+a+new+biomarker+for+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Specific detection of soluble EphA2 fragments in blood as a new biomarker for pancreatic cancer.</a> Cell Death & Disease. 8 (10), e3134(2017).</li>
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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

エキソソームは、多体を産生する外側エンドソーム膜の制御された invaginations から生じ、成熟を放出するために形質膜との融合を受ける多数の管腔内小胞を含むエンドソームの特殊化したサブセットであるエキソソームを細胞外空間に入れる。この生合成経路のために、エキソソームは、エンドソーム膜と融合するか、または複数の異なるタイプの細胞質成分を含む膜画分に関連した膜結合因子を運ぶことができ、したがって蛋白質の積荷、DNAおよび種々の RNA サブタイプ (mRNAs、マイクロ Rna、長尺非コード Rna) を起源20のそれらの細胞の表現型を反映することができる。エキソソームは、全ての細胞型ではないにしてもほとんどによって分泌されるので、病変または悪性細胞からの分泌の増加を示すことができ、大部分の体液中に蓄積して、エキソソームは、最小限の有望としての包括的かつ系統的な調査の対象である侵襲的手段は、特定の疾患状態を検出し、治療21に対するそれらの応答を監視する。
最新のエキソソーム解析に必要なエキソソームの分離は、時間と労力を要する手順であり、医療関連の可能性のあるエキソソーム関連付けられたバイオマーカーの臨床翻訳を制限します。多くの一般的な分離法 (超遠心よる、サイズ排除、沈殿など) では、多くの場合、エキソソーム (30 ~ 100 nm) と、それらのサイズ範囲のオーバーラップにより微小小胞 (100-1000 nm) およびアポトーシス (100 ~ 5000 nm) から十分に区別されません。物理的特性、またはエキソソーム完全性15に損傷を与える可能性がある。より迅速なエキソソーム分析を可能にする新しいアプローチが開発中ですが、これらのプラットフォームの多くを臨床設定によって実装することがどれほど実現できるかは明らかではありません。
本報告では、低倍率の暗視野顕微鏡画像を用いて、ナノ粒子ベースの高スループットエキソソーム定量化を可能にする斬新なアプローチを紹介する。この方法は、エキソソーム精製、高価な専用機器、または新しい技術的専門知識を必要とせず、したがって、ほとんどの研究と臨床の設定で迅速な翻訳に従うべきです。当社のアッセイは、アッセイ結果が標準曲線と比較された場合に特定のバイオマーカーを使用している標的エキソソーム母集団の濃度を正確に定量するために適用することができ、結果には強い線形相関があることが示されている (r2 = 0.99)光応答とエキソソーム濃度の間。このアプローチの現実世界の可能性を示すために、我々は、この方法を用いて患者から得られた血清サンプルにおいて膵癌に関連するエキソソームバイオマーカーの濃度を定量化するために、この手法を採用したデータを提供した。膵癌。
LMDFM では、サンプルウェル全体をイメージングして、次の画像解析でキャプチャするサンプルフィールドを直接選択する必要があるが、サーフェスからの光散乱アーチファクトの対象となる高倍率 DFM 解析で検出された選択バイアスを回避することができます。傷やサンプルデブリを含む凹凸。この背景は、NIH 画像解析プログラム ImageJ で実行される DSM ノイズリダクションアルゴリズムを使用してターゲットエキソソーム信号を検出するために削減することができますが、ダイナミックレンジを減少させる可能性があるようなアーティファクトを導入しないように注意する必要がありますアッセイ。
このアッセイで使用される材料:
1μ l/ウェルを保持するマルチウェル SuperProtein A/G スライドは Arrayit 株式会社 (AGMSM192BC) から購入した。ナノ粒子は、Nanopartz (C12-25-650-DIH-50-1, 6.4 x 1012/mL) から得た。DFM イメージは、一貫した照明と 1/220 s の露光時間で、ニコンの DiR2 顕微鏡に取り付けられたニコンのデジタルカメラで捕獲される。本研究で用いられた PANC 細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションから購入した。

エキソソームは、ほとんどの細胞タイプから放出され、様々な疾患に関連する病態生理学的プロセスを含む細胞間通信において重要な役割を果たし、特定の組織または細胞タイプに帰することができ、様々な核酸を含む、タンパク質および脂質はそれらの起源の細胞を反射し、レシピエント細胞1、2、3、4に対して調節作用を及ぼすことができる。エキソソームは、多くの場合、疾患状態での上昇レベルで分泌され、隣接する細胞と遠くのセルの両方と相互作用することができ、循環中の比較的高濃度であり、唾液、尿、膵臓および胆汁を含む他のほとんどの体液とともに見出されるジュース、及び気管支肺胞洗浄液5、6、7、8、9、10、11。人体の体液中のエキソソームのこの豊富さと安定性は、それらの情報が豊富な性質と相まって、疾患診断および治療モニタリングに理想的なバイオマーカーになります。
これには、腫瘍由来のエキソソーム (TDEs) が含まれ、これは腫瘍特異的または選択的因子を含み、これは腫瘍関連変異型アレルを含む疾患バイオマーカーとしての役割を果たすことができる。TDEs は、腫瘍の発達および転移を促進するために腫瘍微小環境のリモデリングに参加し、そして抗腫瘍反応を調節することができる12.TDE 分泌の増加は、ほとんどの癌の一般的な表現型であり、腫瘍微小環境のいくつかの特徴は、低酸素症、酸性 pH、および炎症を含む、エキソソーム分泌を促進することが知られている。驚くべきことに、エキソソームを分泌する細胞の数を考えると、総エキソソームレベルの増加は、それ自体が、癌バイオマーカーとして機能することができる。たとえば、最近の研究では、胆汁酸ジュース中の総 EV 濃度が、一般的な胆管狭窄患者の悪性度と非悪性を、100% の精度で差別していることがわかりました。同様の結果は、プラズマを含む他の体液を用いた研究でも見出されている。しかし、対象の変化、および他の交絡因子の対象となる可能性のために、疾患バイオマーカーとしてのエキソソームを調査するほとんどの研究は、総エキソソームの代わりに TDEs と選択的に関連するバイオマーカーの検出に焦点を当てている。番号。
しかし、エキソソームバイオマーカーを臨床現場に翻訳することは、ほとんどの報告エキソソームアッセイアプローチには時間と労力を要する分離手順13が必要であるため、依然として困難です。現在普及しているエキソソーム分離法には、超遠心よる、密度勾配、サイズ排除、共沈殿、アフィニティー捕獲、マイクロ流体分離アプローチなどがあります。超遠心よるは「ゴールドスタンダード」法であり、エキソソーム隔離に最も一般的に使用されていますが、この手順は時間がかかり、エキソソーム損傷およびエキソソーム膜クラスタリングをもたらし、汚染されたエキソソームサンプルを生成します。タンパク質、リポ蛋白質およびその他の分析に影響を与えることができる他の因子14.超遠心よるを含むほとんどのエキソソーム分離法では、サイズによって異なるメカニズムで発生し、異なる機能を持つ微小小胞 (100-1000 nm) およびアポトーシスボディ (100 ~ 5000 nm) からエキソソーム (30 ~ 150 nm) を分離することはできません。これらの群の間で重複し、そしてエキソソームの多様性は15である。エキソソームの損傷と汚染を削減しながら、エキソソームの回復を改善することによってエキソソームアッセイの感度と再現性を向上させる新しいアプローチが必要ですが、そのような方法に基づくアッセイもまた、それらをレンダリングするために最適化される必要があります。臨床設定の適用への翻訳のために適した。
いくつかの最近の研究は、体液から直接エキソソームを捕捉して分析する統合プラットフォームを採用することを提案した。これらの方法は、微小流体、electrokinetic、親和性捕捉、およびエキソソーム分離、電気化学、表面プラズモン共鳴、および捕捉されたエキソソームを検出する他の方法を用いている。これらのアプローチの多くが、複雑さ、費用、低スループット、その他の問題により、臨床現場でどのように実現可能であるかは明らかではありません。
我々は、少量のサンプルしか必要としない TDEs などの疾患関連エキソソームを含む、総エキソソームおよび特定のエキソソームサブタイプの高感度かつ特異的な定量化に使用できる迅速で安価なアッセイを開発しました。臨床環境に適した合理化されたワークフローを採用しています。本アッセイでは、エキソソーム表面に発現しているエキソソーム特異的または疾患特異的マーカーのいずれかを結合する抗体をコーティングし、少量の血漿または血清サンプル中に存在する標的エキソソームを直接捕捉し、スライド。捕捉されたエキソソームは、次に、これらのエキソソーム上の目的のバイオマーカーを認識する抗体共役ナノ粒子と共にハイブリダイズし、これは、一般的なエキソソームマーカーまたは関心のあるエキソソームサブタイプに特異的な因子のいずれかであり得る。これらのサンプルウェルの画像は、次いで、暗視野顕微鏡 (DFM) を用いて捕捉し、分析し、各サンプルウェル6、16、17に捕捉された目的のエキソソームに結合したナノ粒子から散乱した光を測定する。特に、低倍率 DFM (LMDFM) によって試料全体をよく撮像することは、ユーザーがその後の画像解析のためにキャプチャするフィールドを直接選択する必要がある場合に、高倍率 DFM 解析で検出された選択バイアスを回避します。LMDFM 画像解析は、傷やサンプルデブリを含む表面の凹凸からの光散乱アーチファクトの対象となりますが、この背景は、我々は、NIH 画像解析プログラム上で動作するように開発した単純なノイズリダクションアルゴリズムを使用して低減することができ、ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)。このアルゴリズムは、最初にサンプルウェルの境界を検出するために使用される入力コンターしきい値を適用し、その後の解析のためにイメージの領域を定義します。このコンター領域によって定義された領域は、その後、画像の赤、青、緑のチャンネルに存在する別々の信号に分割し、青チャンネルは、表面のアーチファクトやナノロッドからの不均一な照明から生じる信号を除去するために赤チャンネルから減算される信号。
この資料では、このアッセイを使用して、血漿または血清サンプル中の合計または特定のエキソソームレベルを迅速に定量する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>エッペンドルフリピーターストリーム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-401-040</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフリサーチプラス</td><td>エッペンドルフ</td><td>3120000011</td><td>0.1 &ndash; 2.5 & マイクロ;L、ダークグレー</td></tr><tr><td>官能化金ナノロッド</td><td>ナノパルツ</td><td>C12-25-650-TN-DIH-50-1</td><td>in vitro ニュートラアビジンポリマー官能基化</td></tr><tr><td>HulaMixer サンプルミキサー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>インキュシェーカー 10L</td><td>ベンチマークサイエンティフィ</td>ック <td>H1010</td><td></td></tr><tr><td>倒立研究用顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>Ti-DH</td><td>暗視野コンデンサー、DS-Ri2カメラ、Ti-SH-Uユニバーサルホルダー、電動ステージ</td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>ニコン</td><td></td><td>顕微鏡イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1X)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30256.02</td><td>HyClone</td></tr><tr><td>Protein A/G Treated Glass Substrate Slides</td><td>Arrayit Corp.</td><td>AGMSM192BC</td><td>プレミアムマイクロアレイ基板</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator Qsonica</td><td>, LLC</td><td>Q500-110</td><td>標準プローブ (#4220)</td></tr><tr><td>付き スーパーブロックブロッキングバッファー</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

nanoplasmon の散乱と低倍率の顕微鏡イメージングによる腫瘍由来エキソソームの定量化

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

感染または悪性細胞は、しばしばより多くのエキソソームを分泌し、循環中の疾患関連エキソソームのレベル上昇につながる。これらのエキソソームは、疾患診断のためのバイオマーカーとして機能し、疾患進行および治療応答をモニターする可能性を有する。しかし、ほとんどのエキソソーム分析手順では、エキソソームの分離と精製の手順が必要であり、通常は時間と労力がかかり、臨床現場では限られた有用性を持っています。このレポートは、個別の分離および精製ステップを必要とせずに、エキソソームの外側膜上の特定のバイオマーカーを分析する迅速な手順を説明しています。この方法では、エキソソームをエキソソーム特異的抗体によってスライドの表面に捕捉し、その後、疾患に特異的なナノ粒子共役抗体プローブとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、標的エキソソーム集団の存在量は、結合したナノ粒子の低倍率暗視野顕微鏡 (LMDFM) 画像を分析することによって決定される。このアプローチは、疾患にリンクされた膜関連エキソソームバイオマーカーを分析するための研究および臨床使用に容易に採用することができる。

マルチウェルプロテイン A/G コーティングされたスライド (図 1a) を抗 EphA2 抗体で官能化し、膵臓癌 (1 μ l/ウェル) の患者の血清サンプルから EphA2 陽性エキソソームを特異的に捕捉し、インキュベート金ナノロッドを抗 CD9 抗体とコンジュゲートさせた (図 1b)。これらのナノ粒子から散乱された光の DFM 画像を、各ウェル中の結合した EphA 陽性エキソソームを定量化するために ImageJ ソフトウェアにおける DSM プラグインを用いて分析した。DSM アルゴリズムは、自動的にサンプルの境界を定義し、アーティファクトからノイズをフィルタリングし、各ウェルから散乱された信号を計算し、この情報を出力します (図 2)。DSM アルゴリズムは、サンプル中の傷や破片からの光散乱アーチファクトを強く減衰し、ナノ粒子検出の感度と再現性を向上させ、ハイスループットのためのスライド画像のバッチを自動的に処理することができます使用。このアルゴリズムでは、ユーザが入力した ImageJ コマンドとパラメータを使用して、画像の背景を減算し、各ウェルからの散乱信号を計算し、データと画像ファイルを出力します (図 3)。対象となる領域は、ImageJ マクロプログラムの輪郭閾値関数を用いて、捕捉画像中の高輝度ウェル境界によって定義される。画像解析では、定義済みのコンター閾値と画像パラメータを使用して、各ウェルのナノ粒子散乱の強度を計算します。
我々の前作 (リアン et al.6の補足情報) で報告されたように、透過電子顕微鏡とウェスタンブロットによって特徴付けられる PANC-1 細胞培養物から単離されたエキソソームは、サイズ範囲、形態、およびタンパク質マーカーを示した発現は、高純度エキソソーム試料と一致する。前の作業と同じ手順で調製した PANC エキソソームは、ここでエキソソーム定量のための nPES アッセイを検証するために使用されました。このアッセイは、総エキソソーム集団からエキソソームの大集団を捕捉するために抗 EphA2 抗体を使用し、捕獲されたエキソソームを検出するために一般的なエキソソームタンパク質 CD9 に対する抗体を用いた。0.24 から1.2 μ g/μ l の範囲のタンパク質濃度を有する PANC-1 エキソソームサンプルを逐次希釈して得られた結果は、複製ウェルにおいて良好な再現性を示し (図 4a)、散乱応答との間に強い線形相関エキソソームタンパク質濃度 (図 4b)。
この方法の潜在的な適用を示すために、膵癌の有無を有する患者からの血清検体を分析し、癌関連バイオマーカー EphA2 を発現する血清エキソソームの存在量を検出し、抗 EphA2 抗体を用いて結合されたエキソソームを検出するために抗 CD9 抗体とコンジュゲートした血清およびナノ粒子から標的エキソソームを直接捕捉する。この分析により、膵臓癌の患者からの血清サンプルは、それらのコントロールよりも有意に高いレベルの EphA2 + エキソソームを有していたことが明らかになった (図 5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig1.jpg"> 図 1: エキソソーム定量方式(A) このアッセイで使用されるマルチウェルプロテイン A/G スライド (192 ウェル) の概略図。(B) 標的エキソソームは、血清および血漿を含む試料から直接捕捉され、そのスライドに結合した捕捉抗体 (例えば抗 EphA2 抗体) 上の表面固定化によって、次いで、検出と結合した金ナノロッドと共にインキュベートする抗体 (例えば抗 CD9 抗体) DFM 画像解析による分析前。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig1large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig2.jpg"> 図 2: LMDFM 画像に DSM アルゴリズムを適用して定量化するエキソソーム。低倍率の画像は DSM アルゴリズムで処理され、スクラッチ、空隙、破片、不均一なサンプルイルミネーションによって生じるバックグラウンド信号や信号アーティファクトを排除して、ゴールドナノロッド信号のロバストな検出を可能にします。エキソソーム濃度と相関する。この図は、太陽の許可に適合されている、d. et al. 低倍率暗視野顕微鏡遠方界画像におけるナノ粒子光散乱を定量化するためのノイズ低減法。分析化学88 (24)、12001-12005 (2016)。著作権 (2016) アメリカ化学会.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig2large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig3.jpg"> 図 3: DSM アルゴリズムのコマンドと出力の概略示されたステップは ImageJ からのネイティブコマンドを使用し、すべての入力パラメータはグラフィカルユーザインタフェースによる実験の要件に従って選択される。この図は、太陽の許可に適合されている、d. et al. 低倍率暗視野顕微鏡遠方界画像におけるナノ粒子光散乱を定量化するためのノイズ低減法。分析化学88 (24)、12001-12005 (2016)。著作権 (2016) アメリカ化学会.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig3large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig4.jpg"> 図 4: 代表的な NPES LMDFM 画像と DSM 出力データ(A) PANC エキソソームの濃度勾配を分析する nPES アッセイの LMDFM 画像および (B) このスライドからの光信号とエキソソーム濃度の線形相関 (左から右: 0.24、0.356、0.53、0.80、1.20 μ g/μ l各列に対してそれぞれ)。データは平均± SE、n = 6 として提示され、ピアソン相関係数 R2 = 0.99、および各濃度の反復に対する変動係数 &lt; 0.2 がある。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig4large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig5.jpg"> 図 5: EphA2+エキソソームの LMDFM シグナルは、膵臓がんの有無にかかわらず血清中に異なる。抗 EphA2 捕捉抗体 (癌関連) および抗 CD9 検出抗体 (一般エキソソームマーカー) を用いて nPES によって分析された血清サンプルは、患者の血清検体中の EphA2 + エキソソームの濃度に有意な差を呈し膵癌なし (N = 7/群)。結果は平均値± SE として表示されます * *p = 0.002 マン・ホイットニー U 検定 (両面)。この図は、[Sun, d. et al.] 低倍率暗視野顕微鏡遠方界画像におけるナノ粒子光散乱を定量するためのノイズ低減法から変更されている。分析化学88 (24)、12001-12005 (2016)]。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig5large.jpg" target="_blank">この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

疾患および悪性細胞に対するエキソソーム由来のバイオマーカーの臨床翻訳は、迅速かつ正確な定量方法の欠如によって妨げられている。このレポートは、低倍率の暗視野顕微鏡画像を使用して、少量の血清または血漿サンプル中の特定のエキソソームサブタイプを定量化することについて説明する。

Nanoplasmon の散乱と低倍率の顕微鏡イメージングによる腫瘍由来エキソソームの定量化

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

ナノプラズモン強化散乱(nPES)は、時間のかかる労力を要するエキソソーム浄化ステップをスキップし、外因性分析の臨床現場への応用を拡大することができる外科的生検に対する単純で非侵襲的な代替手段である。このnPESアッセイは、分離した分離および精製ステップを必要としないエキソソームの外膜上の特定のバイオマーカーを分析するための迅速な手順である。このアッセイには非常に小さな臨床サンプルしか必要としないです。したがって、この方法は、遺伝子操作またはPDXマウスモデルの研究にnPESの使用を拡大することができます。このプロトコルには、困難に思えるいくつかの手順があります。しかし、いくつかの練習を行えば、基本的なウェットラボスキルを持つすべての人がnPESを正常に実行することを学ぶことができます。手順を開始するには、NeutrAvidin機能性ゴールドナノロッドの懸濁液の40マイクロリットルを、200マイクロリットルの冷たいpH 7リン酸緩衝生理食塩水と組み合わせます。8500倍のgで摂氏4度で10分間遠心し、上清を取り除きます。この洗浄プロセスをさらに2回繰り返し、ナノロッドを40マイクロリットルの冷たいPBSで再懸濁します。次に、150マイクロリットルの冷たいPBSと10マイクロリットルの適切なビオチン化抗体の1ミリリットルの溶液を懸濁液に加えます。抗体コンジュゲートゴールドナノロッドを得るために2時間摂氏4度で混合します。冷たいPBSの200マイクロリットル部分を摂氏4度でそれぞれ10分間、6500倍の遠心分離でナノロッドを3回洗浄します。その後、洗浄した抗体共役ナノロッドを200マイクロリットルの冷たいPBSで再懸濁し、最大24時間摂氏4度で保存します。スライドの準備を開始するには、PBSで1ミリリットル当たり025ミリグラムに所望のエキソソーム捕捉抗体を希釈します。この溶液のピペット1マイクロリットルは、光学グレードのガラスで裏打ちされたタンパク質A/ G処理スライドの各ウェルに入れられます。その後、スライドを加湿ボックスに移し、インキュベーション中に井戸が乾燥しないようにします。キャプチャ抗体を固定するために、スライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。次いで、残りの溶液を吸引し、非結合抗体を除去する。PBSを1マイクロリットルずつ3回加えて吸い出して井戸を洗います。次に、PBSベースのブロッキングバッファーを1マイクロリットルずつ素早く各ウェルにロードし、スライドを摂氏37度で2時間インキュベートします。15個のサンプルを動かしている場合、ブロッキング剤の蒸発を避けるために、ブロッキングバッファを5分以内で120の井戸にロードするために、単一チャネルのピペットを使用する必要があります。スライドブロッキング中に抗体コンジュゲートゴールドナノロッドの溶液の調製を開始します。ブロッキングが終了する約30分前に、室温の水浴中の血漿または血清サンプルを急速に解凍する。30秒間解凍したサンプルをボルテックスして、懸濁液が均質であることを確認します。次いで、サンプルを500倍gで15分間遠心分離し、タンパク質凝集体および他の破片を沈殿させた。上清の10マイクロリットルのアリコートを新鮮なチューブに移し、PBSで1対1の希釈液を作ります。希釈したサンプルを、適宜穏やかな渦または反転によって混ぜます。スライドブロッキングが終了したら、ブロッキングバッファーを吸引し、PBSの1マイクロリットルの部分でウェルを3回洗浄します。すぐに井戸あたり1マイクロリットルとサンプルあたり8つの複製で井戸にサンプルをロードします。同様に適切な井戸にエキソソーム標準をロードします。スライドを摂氏4度の冷蔵庫で12~18時間インキュベートします。次いで、ウェルを吸引し、PBSを1マイクロリットルでそれぞれ1回よく洗う。抗体コンジュゲートゴールドナノロッド懸濁液を1マイクロリットルずつ各ウェルに積み込み、スライドを摂氏37度で2時間インキュベートします。その後、ナノロッド懸濁液を吸引し、1%ポリソルベート20を10分間ミキサーを用いてPBSでスライドを洗浄した。次いで、ウェルを吸引し、回転ミキサーで10分間脱イオン水でスライドを洗浄した。水を取り除き、スライドをきれいなペトリ皿で空気乾燥させてから、スライドを暗視野顕微鏡に持ち込みます。暗視野油浸縮器、4xの目的およびモーター式の段階が装備されている逆の顕微鏡を置く。デジタルカメラで顕微鏡をコンピュータに接続し、イメージングソフトウェアを開きます。次に、サンプルスライドを顕微鏡ステージ上で上下逆さまに置き、凝縮レンズがスライドに接触するところに液浸油の小さな滴を塗布する。画像ソフトウェアで顕微鏡を通してビューを表示します。高濃度標準によく照らされた時間を調整して、画像が飽和しないようにします。次に、大きな画像をスキャンするためのツールを開き、目的の倍率を10倍に設定します。ステージの動きの間にアクティブなシャッターを閉じ、各キャプチャの前に20ミリ秒待つことを選択します。ステッチオーバーラップを20%に設定し、最適なパスを使用してステッチを選択します。スキャンから大きな画像を作成することを選択します。スキャンの開始時にカメラが手動でフォーカスされるように設定し、20 フィールドごとに自動的にステップバイステップのフォーカスを有効にします。次に、ターゲットスキャンフィールドの左、右、上、および下の制限を設定し、顕微鏡ステージを所望の範囲のそれぞれに移動してスキャン領域を定義します。次に、焦点、凝縮器、および領域照明を調整して、明るく明るい画像を得る。作成するイメージ ファイルに名前を付け、スキャンを開始します。完了したら、画像を開いて1/8スケールで保存します。画像解析ソフトウェアを開きます。次に、[プラグイン] メニューを開き、[DSM スキャン] をクリックし、列と行の数を定義し、サイズ変更の割合を 25 に設定し、スポット直径をピクセル単位で 190 ~ 200 に設定し、直径の範囲を 32 に設定し、増分直径をピクセル単位で 8 に設定します。DSM の上限を 0 と 62 に、隣接する距離を 100 に、減算バイアスをゼロに設定します。DSM アルゴリズムを実行し、結果のデータを保存します。DSM分析技術は、マイクロリットル当たり0.24~1.2マイクログラムの連続希釈PANC-1エキソソームサンプル全体で良好な再現性を示した。金ナノロッドからの散乱応答とエキソソームタンパク質濃度との間には強い線形相関が認められた。膵臓癌患者と健康な患者の間で癌関連バイオマーカーEphA2を発現する血清エキソソームの存在量に有意な差が認められた。ブロッキング剤の添加以降、サンプルの蒸発を避け、クロスコンタミネーションを導入し、スライドの表面を傷つけるために、迅速かつ正確なピペット処理が重要です。この手順に従って、対象となるエキソソームバイオマーカーの発現と、研究されている疾患の異なる段階との間の相関関係を調べる統計解析を行う。この技術を確立した後、初期の膵臓癌の外生バイオマーカーを見つけることができます。現在、この発見を他のタイプの癌や感染症に拡大しています。通常、このアッセイで取り扱うサンプルは、患者のサンプルまたは癌細胞株からの精製エキソソームサンプルのいずれかで、特別な安全トレーニングを必要とする。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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このビデオでは、低倍率の暗視野顕微鏡を使用して、少量の生体流体サンプル中の特定のエクソソームを定量する方法について説明します。このようにして同定されたエキソソームは、潜在的ながんバイオマーカーとして役立つことができます。...

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Nanoplasmon の散乱と低倍率の顕微鏡イメージングによる腫瘍由来エキソソームの定量化

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