Name: 根治的前立腺切除術後の勃起不全治療のための脂肪由来再生細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶ脂肪由来再生細胞の単離法。根治的前立腺切除術後の勃起不全治療に応用され、酵素処理と遠心分離により細胞を精製する。再生医療と泌尿器科の研究に有用な標準化プロトコルを提供する。

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この研究は、オーデンセ大学病院(11/31936)、デンマーク再生医療センター(14/50427)、デンマーク癌協会によって設立されました。

プロトコルに記載されているすべての方法は、デンマーク国家倫理委員会(第37054号)、デンマーク保健医薬品局(EUDRA-CT番号2013-004220-11)、およびデンマークデータ保護庁(2008-58-0035)によって承認されました。この研究は ClinicalTrials.gov に登録された(NCT02240823)。この研究は、オーデンセ大学病院のGood Clinical Practice(GCP)ユニットによって監視されたヘルシンキ宣言に従って実施された。ADRC調製は、オーデンセ大学病院におけるヒト組織および細胞の取り扱いのための認可組織施設(デンマーク保健医薬品局、認可番号29035)において実施された。
1. 患者・参加者の募集
<ol><li>治験に参加するには、以下の包含基準を満たす患者を募集する。<ol>
<li>18歳以上で、RPの前に性的に活動的であり、性感染症(ヒト免疫不全ウイルス感染、梅毒、肝炎など)に感染していない患者を募集する。</li>
		<li>前立腺癌のために行われたRPの後に勃起不全に苦しんでいることを確認してください。 注:この研究では、患者はRPの5〜18ヶ月後に研究に登録され、手術方法(オープン/ロボットアシストまたは神経温存/非神経温存)に関係なく含まれていました。</li>
		<li>前立腺特異抗原(PSA)の価値がRP後の臨床フォローアップで検出不可能でなければならないことを確認してください。</li>
		<li>患者がRPの前に性的に活動的であり、RP後も性的に活動的であり続けたいという願望を表明していることを確認する。ホスホジエステラーゼ5型阻害剤(PDE5阻害剤)またはプロスタグランジンE1の合成類似体(PGE1)による薬理学的介入が、参加する前に試行され、不十分であるとみなされることを確認する。</li>
		<li>さらに、患者が腹部または大腿部に十分な皮下脂肪を有することを確認する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>RP中に麻酔下で重篤な事象があった場合、または抗凝固剤で治療された場合は、患者を試験から除外する。</li>
</ol>2. 脂肪吸引
注:脂肪吸引は、皮下領域から脂肪または脂肪細胞を除去する操作である。プロトコルのこの部分は標準的な脂肪吸引として行われ、手順は手術室で滅菌条件下で行われる。手順の下で使用されるすべての器具は無菌でなければならず、外科医はスクラブ、滅菌手術用ガウン、滅菌手袋、手術用マスクおよび帽子を着用しなければならない。
<ol><li>患者を麻酔する。<ol>
<li>処置中に患者が全身麻酔下にあることを確認し、この部分は麻酔科医によって行われる。</li>
		<li>腹部および陰嚢の皮膚をクロルヘキシジン0.5%で消毒する(クロレキシジン精神、96%エタノール薬用ジグルコン酸クロルヘキシジン77%W / W = 83% v / v)。外科的マーカーを使用して、脂肪吸引が行われる予定であった腹部上の領域を描画する。領域は通常、交感神経と臍の間の領域になります。</li>
	</ol></li>
	<li>メスで腹部の皮膚に幅6mmの切開を2回行う(数11)。切開部を脂肪吸引の上方から左右対称に配置する。<ol>
<li>ワセリンなどの潤滑剤を少し切開部に置き、脂肪吸引中に浸潤カニューレが切開部に容易に出入りすることを確認します。</li>
	</ol></li>
	<li>皮膚の切開部を通してサイズ14G浸潤カニューレを導入する。修正されたクライン溶液を皮膚表面に平行なマークされた領域に皮下に注入する。標的組織が腫れて固くなる、または腫瘍になるほど多くの溶液を注入する。 注:改変されたクライン溶液は、1,000mL乳酸リンゲルおよび1mgのアドレナリン(エピネフリン(1:1,000,000))の溶液からなる。局所麻酔を溶液に当てはめないでください, それはADRCに悪影響を及ぼす可能性があるため、.<ol>
<li>脂肪組織に1:1の比率に対応する量の改変クライン溶液を注入する。</li>
		<li>アドレナリンの効果を最大化し、採取された脂肪組織の血液量を減らすために10分間待つ。</li>
	</ol></li>
	<li>ジェット注入脂肪吸引を用いて標準的な脂肪吸引を行い、200〜300mLの脂肪組織を採取する。注入チューブとノズルが一体化された中空の鈍いカニューレを使用してください。カニューレを脂肪吸引用の吸引装置に取り付けます。 注:連続的な扇形の水注入は、脂肪組織を緩めて断片化し、カニューレの開口部から容易に吸引することができる。<ol>
<li>腹部の切開部を通して鈍い先端を持つ3mmシリンジを導入する</li>
	</ol></li>
	<li>脂肪組織をリポコレクタに集めて、脂肪吸引液を無菌環境で保存する。脂肪吸引液は水相から分離し始めます。</li>
	<li>50 mLの滅菌シリンジを使用して、リポコレクターから脂肪吸引液を吸い上げます。<ol>
<li>シリンジに吸い込まれる水の量を最小限に抑え、シリンジの先端にあるプラグをねじ込んで脂肪組織を滅菌に保ちます。</li>
	</ol></li>
	<li>先端が下向きの注射器を滅菌ビニール袋に入れ、水相からの脂肪吸引液の分離を開始する。先端を下向きにしたまま袋を滅菌容器に入れ、分離を続けます。<ol>
<li>輸送中の無菌環境を確保するために、容器を滅菌ドレープで覆います。 注:単離に使用された機械のユーザーマニュアルによると、脂肪吸引液はADRCの単離前に最大4時間保存することができますが、常にすぐに処理します。</li>
	</ol></li>
	<li>外科医が好む縫合材料で皮膚切開部を閉じる。腹部の周囲に圧迫衣服、腹部結合剤を置き、術後の浮腫を軽減します。</li>
	<li>5μgのアドレナリンを含む20mLのブピバカイン5mg / mLを注射することによって陰茎ブロックを作る。<ol>
<li>20 mLの注射器を使用し、長さ1 1/4インチの23 G針で塗布します。</li>
		<li>5mLのブピバカインをサブクティスの各象限に塗布する。</li>
		<li>ブピバカインを2つの部位に注入し、一方を腹側に置き、他方を背側に配置する。針を横方向に右に向ける皮下組織にその長さの全体にわたって針を導入し、針が引っ込められるように麻酔を注入する。針を左に向けて注射を繰り返します。 注:患者は、麻酔科医によって全身麻酔から目覚めさせることができるようになった。</li>
	</ol></li>
</ol>3. ADRCの分離
メモ: ADRC の絶縁プロセスは、デバイスの次のユーザーマニュアルに詳しく説明されているように実行されます ( 材料表を参照)。ADRCの精製中に脂肪吸引液がいかなる汚染物質にも曝されないようにするために、この手順を滅菌条件下で実施することが重要である。ADRCの単離にかかる時間は、脂肪吸引液の量に依存するが、ここで説明するように半自動装置を使用して、全体の手順は約2.5時間かかる。
<ol><li>すべての消耗品と酵素を、滅菌使い捨て手術用タオルで覆われたテーブルに無菌的に置きます。 注:手順キットには、1人の患者からADRCを単離するために必要なすべての消耗品と酵素が含まれています。これに加えて、3つの37-39°C、1リットルの乳酸リンガーの注入バッグは、滅菌衣類、手袋、タオル、消毒用のエタノールとともに利用可能でなければなりません。消耗品と酵素のすべてのロット番号と、システムに接続されている場合は、授乳リンガーの温度を書き留めます。<ol>
<li>エタノールでデバイスを拭き取り、製造元の指示に従ってください</li>
		<li>消耗品セットをデバイスにロードし、乳酸リンガーの袋をシステムに接続します。</li>
		<li>脂肪吸引液を添加する前に、一連の半自動試験(システムチェックおよびリーク試験)を行う。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3.1のステップが行われている間、脂肪吸引液を50mLチューブに入れたままにします。これにより、脂肪が液相から分離することができます。脂肪組織の総量(mL単位)を書き留め、これを使用して、負荷された脂肪の量がデバイスの容量の範囲にあることを確認します。</li>
	<li>デバイスからプロンプトが表示されたら、ティッシュをロードします。機械は余分な水分を排出し、乳酸リンガーで洗浄する前に負荷された脂肪組織の量の重量を量ります。<ol>
<li>組織を洗浄し、再び排水したら、機械の要求に応じて、新しい輸液バッグを37-39°Cの乳酸リンガーで接続します。</li>
		<li>コラゲナーゼとプロテアーゼを含む市販の酵素を5mLの乳酸リンゲルブレンドで再構成します(酵素のバイアル1本で最大270mLの脂肪量で十分です)。</li>
		<li>脂肪組織を含むキャニスターに注入する酵素の量 (組織重量に基づく) が装置に表示されていることを確認します。一旦注入されると、攪拌下で行われる酵素消化は約20分間持続する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>組織消化後、攪拌機を停止し、含有量が2つの相に分離されていることを確認します:上部脂質含有、黄色相、およびADRCを含む下部ピンク層。後者の層を消耗品セットの細胞処理チャンバ(装置内蔵遠心分離機に入る)に排水させ、脂質層を残します。</li>
	<li>ADRCを細胞処理チャンバ内で複数回の遠心分離中に濃縮させます。次に、乳酸リンガーで再構成された10mLのイントラバス(DNaseを含み、最終的なADRC懸濁液中の凝集を避けるのに役立ちます)を加えます。酵素反応は10分間続き、その後ADRCを洗浄する。 メモ:この手順は完全に自動で行われ、プロセスが完了すると機械が通知します。</li>
	<li>ADRC の単離が完了したら、細胞を 5 mL のリンゲル乳酸塩に再懸濁します。溶液を5mLシリンジに吸引する。</li>
	<li>ADRCを含む5 mLシリンジに3ウェイ活栓メスルアーロックを取り付け、4 mLのADRCを別の5 mL滅菌シリンジに吸引します。</li>
	<li>最後の1 mLを1 mLシリンジに移します。この1mLをADRCの特性評価(例:細胞数、細胞生存率、フローサイトメトリーによる表面マーカーの分析、ADRC分化能)に使用します。</li>
	<li>滅菌ドレープに詰める前に、4mLのADRCを入れた5mLシリンジに25G針を刺します。受信者への注入に ADRC を使用します。この場合、ADRCの溶液は平均して840万〜3270万個の細胞を含む。</li>
</ol>4. コーパス・カベルノサムへのADRCの移植
注:これは滅菌手順です。すべての器具は滅菌でなければならず、幹細胞を含む溶液をコーパスキャベルノサムに注入する人は滅菌手袋を着用しなければならない。患者はこの手順中に目を覚ましており、自分の幹細胞を受け取ります。ADRCは、注射前に細胞を計数することなく注入される。
<ol><li>ADRCsの溶液を均質に保つには、シリンジをコーパスカベルノサムに注入するまで静かに傾けます。</li>
	<li>ペニスの上に絞りドレープを置きます。シリコン容器ループを使用して陰茎の根元に止血帯を置きます。ループを締め、鉗子湾曲したピーンで固定します。止血帯をペニスからの血流を止めるのに十分なほどタイトにします。</li>
	<li>注射部位(コーパスカベルノサムの側方部位)で陰茎の皮膚を消毒するために、2つの消毒スワップを使用する。ADRCsを含む溶液1mLを、右側のコーパスキャベルノサムに直角に2つの異なる場所で注入し、その後左側コーパスカベルノサムでこのステップを繰り返す。注入されたADRCの総量は4mLである。</li>
	<li>30分待ってから止血帯を取り外します。</li>
	<li>ADRCsの注射後2時間の観察後に患者を退院させ、患者が麻酔後に良好に回復したことを確認する。</li>
</ol>5. 術後ケア
<ol><li>血腫の発症を防ぐために、最初の1週間以内に血圧を上昇させることができる身体的パフォーマンスを行わないように患者に推奨する。</li>
	<li>手術後最初の14日間は24時間、日中は14日間腹部バインダーを着用することを患者に推奨する。</li>
	<li>経口アセトアミノフェン(例えば、パラセタモール;1,000mg、1日4回)および経口抗炎症剤(例えば、イブプロフェン;400mgを1日3回)で術後疼痛を治療する。</li>
</ol>

<ol><li>Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+paracrine+actions+and+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell paracrine actions and tissue regeneration.</a> Regenerative Medicine. 5 (1), 121-143 (2010).</li>
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</ol>

著者のSøren P. Sheikhは、デンマークのコペンハーゲンにあるBlue Cell TherapeuticsのCEOです。

ADRCを単離するための提示された手順は、ED療法にのみ使用されることに限定されず、他の複数の形態の治療および実験において使用することができる。私たちの試験は、自家製の新しく単離されたADRCが安全に使用でき、治療が12ヶ月のフォローアップで十分に許容できることを示しました。
この手順を使用する前に、いくつかの考慮事項があります。この手順の欠点は、脂肪吸引中に患者が全身麻酔下でなければならないことである。脂肪吸引は局所麻酔下で行うことが可能であるが、以前の試験では、局所麻酔薬とアドレナリンの組み合わせが線維芽細胞の細胞増殖に悪影響を及ぼす可能性があることが示されている20。全身麻酔下にあるリスクは一般的に低いが、否定的な結果は依然として見られる。このリスクは、患者が治療のために選択されるときに考慮されなければならない。脂肪吸引は外科的処置であり、したがって、常に合併症のリスクを伴います。他のすべての外科的処置と同様に、術後出血のリスクがあり、血腫の形成および感染のリスクがある。私たちの患者の中には、腹部皮膚の感受性が一時的に低下したと報告した人もいます。脂肪吸引の即時の合併症は出血である。大量の組織が除去されると、患者は全身合併症を起こす危険性があることが知られている。この手順における脂肪吸引は比較的小さく、したがって危険因子とは見なされなかった。
細胞の注射に対する合併症は、一過性の発赤、圧痛、および血腫として報告される。
ADRC の絶縁に使用されるデバイスは、システムが CE 承認を受けているために選択されました。デンマークでは、ADRCがヒトへの注射に使用される場合、当局は幹細胞による治療を薬物検査試験として分類しているため、CE承認機器を使用することが義務付けられています。
この装置には、手順全体が標準化され、高度に分類された実験室を必要とせずに閉鎖された滅菌環境で実行されるなどの利点があります。したがって、汚染のリスクが低減されます。これにより、手順が均一で再現性があり、最終製品の品質が毎回常に同じであることが保証されます(ただし、入力組織の品質にも依存します)。デバイス上での絶縁は簡単で、特別な教育を受けたオペレータを必要としません。
この装置の1つの制限は、機械への最小入力が100gの排水された脂肪吸引液であることである。脂肪吸引は細胞処理が開始される前に(そして私たちの場合はORではなく別の場所で)完全に完了するので、これは50mLシリンジの大まかな測定値を使用して少なくとも125mLである脂肪吸引液の量を必要とする。そうしないと、機械が進行するのに十分な材料がなくなる危険性があります。また、上限(最大入力は425 mL)を使用すると、非常に長い絶縁手順になります。
脂肪組織と骨髄の両方からの成体幹細胞は、胚性幹細胞のように自己複製と分化の能力を持っているようです。造血幹細胞に対するADRCの利点の1つは、骨髄21,22と比較して組織体積当たり100〜500倍高い収量であり、したがって、ADRCは培養する必要がない。さらに、造血幹細胞は、脂肪組織よりも患者から採取するのがより困難で痛みを伴う。多くの状況では、脂肪組織は手術後の単なる廃棄物です。幹細胞を培養して血管新生に適したより高い収率を与えることは可能ですが、新たに単離されたADRCは培養物よりも高い血管新生能能を有し得る23。

幹細胞は異なる細胞型に分化する能力を有し、損傷組織における治癒過程を促進すると考えられているパラクリン因子を分泌する1,2,3,4。したがって、それらは可能な治癒的治療を表すことができるので、再生医療の分野では魅力的です。
根治的前立腺切除術(RP)は、低/中リスクの限局性前立腺癌および平均余命が10年>患者のための黄金の治癒的治療法です。手術の目的は癌の根絶ですが、いくつかの副作用があります。前立腺切除後の失禁の有病率は2〜60%の範囲であり、勃起不全(ED)は患者の20〜90%によって経験される5。神経温存技術は、一部の患者では選択肢です(グリーソンスコア<7、嚢外疾患のリスクが低い)5。この技術は勃起の原因となる神経を免れますが、これは可能ですが、多くの患者は依然として術後にEDを報告しています。
RP後の陰茎リハビリテーションの治療選択肢は、主にPDE-5阻害剤による治療、注射または点滴療法および真空ポンプからなる。陰茎リハビリテーションに使用される医薬は薬理学的に異なるが、その作用機序には脳梁中の平滑筋細胞の弛緩が含まれる。しかし、多くの患者は治療の失敗を経験し、性交を可能にする薬の効果を達成することはありません6。
RPの後に発生するEDは、構造的に不可逆的な変化によるものと考えられる7。これらの変化は海綿状組織において起こり、平滑筋および内皮細胞のアポトーシスおよび線維症を含む。勃起の中央部を担う静脈閉塞機構は、その変化によって損なわれ、陰茎7の充填性および硬度が悪化する。
患者の多くは、自分が経験するEDが生活の質に悪影響を及ぼすと報告しています8。彼らは手術後に性的活動をあきらめる準備ができていないので、陰茎リハビリテーションのための他の利用可能な治療法が失敗したとき、EDの治癒療法は魅力的です。
ヒトに対する動物および小規模第1相試験を含む以前の試験において、幹細胞は、ED2、9、10、11、12の代替治療として有望な結果を示している。結果は、ADRCを使用することが安全であり、仙骨海綿体2、9、10、11、12への単回注射後に勃起機能が有意に改善されることを示している。脂肪由来再生細胞(ADRC)は、複数のホルモン、神経栄養因子および他の成長因子、サイトカイン、およびおそらくマイクロRNAの遊離を通じて、パラクリン機構による組織再生をサポートすると考えられている13。さらに、ADRCは、内皮および血管筋細胞、軟骨細胞、骨細胞およびニューロンを含むいくつかの成熟細胞型に分化することができる14、15。これらの特性は、幹細胞をEDの恒久的な新しい治療法の開発に興味深いものにします。
幹細胞はいくつかのグループに分けられ、基本的には初期胚由来のもの(胚性幹細胞)と成体組織由来のもの(成体幹細胞)である。成体幹細胞には、多能性であり、骨髄、脂肪組織、臍帯血、胎盤および歯髄中に見出すことができる間葉系幹細胞(MSC)が含まれる17。
脂肪組織由来の幹細胞は、骨髄由来の幹細胞とは異なり、アクセスが容易である。骨髄から幹細胞を採取することは、脂肪吸引と比較して危険で痛みを伴う手順です。骨髄から採取できる細胞の数は限られていますが、患者の脂肪組織のデポだけが採取できる細胞数の制限を設定します。したがって、満足のいく量を得るために細胞を培養する必要なしに脂肪組織から大量の幹細胞を単離することが可能である。脂肪由来再生細胞は、しばしば間質血管画分(SFV)とも呼ばれ、MSC、内皮細胞、周皮細胞、免疫細胞および前駆細胞を含む多くの細胞型から構成される18。これらはすべて、再生プロセスにおいて役割を果たす可能性があります。
本研究の目的は、コーパス海綿への注射後に採取したばかりの脂肪組織から単離された4mLの自家ADRCを用いて、RP後のEDに対する幹細胞の影響を調べることである。

<table><tbody><tr><td>脂肪吸引</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腹部バインダー</td><td>デール</td><td></td><td>患者のサイズ依存</td></tr>粘着<tr><td>性OPタオル</td><td>M&ouml;lnlycke Health Care</td><td>906677</td><td>90x75 cm</td></tr><tr><td>アドレナリン 1 mg/ml</td><td>Amgros I/s</td><td>74 44 23</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>基本的な OP 用品</td><td>M&ouml;lnlycke Health Care</td><td>97010873-07</td><td></td></tr>炭素<tr><td>鋼ブレード11</td>ス<td>ワンモートン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロルヒキシジンエタノール</td><td>Faarborgファーマ</td><td>5%着色</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てセットリポコレクター3</td><td>ヒューマンメッド</td><td>670200</td><td></td></tr><tr><td>延長ホース</td><td>押出し5.8</td><td></td><td>/ 8.3 mm、Ch 25、3,5 M長い</td></tr><tr><td>視線ぼろきれ</td><td>バリア</td><td>175201</td><td>30×45センチメートル</td></tr><tr><td>ジェロネット</td><td>・スミス・アンド・ネフュー・メディカル・リミテッド</td><td>90509225</td><td>10 x 10 cm</td></tr><tr><td>マーカイン 5 mg/ml + アドレナリン 5 ミリグラム</td><td>アストラゼネカ</td><td></td><td>20 mL</td></tr><tr><td>メソルブ包帯</td><td>M&ouml;lnlycke Health Care</td><td>677001</td><td>10x13 cm</td></tr><tr><td>Microlance</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td>18 G + 23 G</td></tr><tr><td>Monocryl 縫合糸</td><td>Ethicon</td><td></td><td>04:00</td></tr><tr><td>リンガーラクタット</td><td>Fresinus Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌手袋</td><td>Gammex</td><td>330052065</td><td></td></tr><tr><td>手術用ガウン</td><td>M&ouml;lnlycke Health Care</td><td>690103-01</td><td></td></tr><tr><td>サージカルマーカー</td><td>リチャード・アラン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サージカルマスク</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>Codan Medical</td><td>6,28,402</td><td>50/60 ml カテーテル先端</td></tr><tr>シ<td>リンジ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>700016181</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>WAL- カニューレ用アプリケーター 25/30 cm</td><td>Human Med</td><td>REF 500001</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADRCのIsolation of ADRC's</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 303172</td><td></td></tr><tr><td>3 way stopcock</td><td>One Med</td><td>REF 10554-01</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive OP-towel</td><td>M&ouml;lnlycke Health Care AB</td><td>REF 906677</td><td>90x75 cm</td></tr><tr><td>Cytori Celution 800IV device</td><td>Cytori</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desinfection swaps</td><td>Mediq Danmark</td><td>3340010</td><td></td></tr><tr><td>Microlance</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>25G (0,5*25 mm)</td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td>Abena</td><td></td><td>パウダーフリー</td></tr><tr><td>OR ドレープシート、2 層</td><td>Lohmann &Rauscher</td><td>REF 33005</td><td></td></tr><tr><td>Ringers Lactate</td><td>Fresinus Kabi</td><td>06756 (DK)</td><td></td></tr><tr><td>滅菌手袋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌ガウン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytori Celution 800IV用補足キット</td><td>Cytori</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termometer</td> Thomas <td>Scientific</td><td></td>トレー<td>サブル</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ADRCの<Injection/strong></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apertureドレープ</td><td>One Med</td><td>REF1565-01</td><td>75*90 cm</td></tr><tr><td>消毒交換</td><td>Mediq Danmark</td><td>3340010</td><td></td></tr><tr><td>Pean</td><td>Leibinger</td><td>32-01257</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Vessel Loop</td><td>Purple Surgical</td><td>REF PS3203</td><td></td></tr><tr><td>滅菌手袋</td><td>Sempermed</td><td></td><td>またはあなたのお気に入りを使用してください</td></tr></tbody></table>

根治的前立腺切除術後の勃起不全治療のための脂肪由来再生細胞の単離

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

幹細胞が再生医療の多くの研究分野で使用されているのは、これらの治療法が対症療法ではなく治癒的であり得ることが一因です。幹細胞は、異なる組織から得ることができ、単離のためのいくつかの方法が記載されている。脂肪由来再生細胞(ADRC)の単離のための提示された方法は、この方法が一般的な手順であり、したがって、勃起不全(ED)療法に限定されないため、多くの治療領域内で使用することができる。EDは、従来の治療ではうまく治療されないことが多いため、根治的前立腺切除術(RP)に対する一般的で重篤な副作用である。ADRCをEDの治療薬として使用することは、コーパス海綿体への細胞の単回注射後の最初の陽性結果のために大きな関心を集めている。ADRCの単離に使用される方法は、シンプルで自動化されたプロセスであり、再現性があり、均一な製品を保証します。さらに、プロセス全体が閉鎖系で行われるため、単離された製品の無菌性が保証されます。幹細胞はヒトの注射に使用されるため、汚染や感染のリスクを最小限に抑えることが重要です。全体の手順は2.5-3.5時間以内に行うことができ、組織をオフサイトに出荷する必要性を排除する分類された実験室を必要としない。しかしながら、単離装置が機能するための濾水した脂肪吸引液の最小量は100gであるため、この手順にはいくつかの制限がある。

提示された手順は、21人の患者19人を含む非盲検第1相臨床試験に使用されている。この試験の主要評価項目はヒトにおけるADRCの使用の安全性であり、副次評価項目はADRCの勃起機能への影響であった。
平均年齢60歳(範囲46~69歳)で、前立腺がんによるRP前は正常な勃起と活発な性生活を保った21人の男性が試験に含まれた。彼らは皆、RP後にEDに罹患し、陰茎リハビリテーションに利用できる薬からの回復の兆候はなかった。6人の男性がRPの副作用として失禁に苦しんだ。全ての男性は、提示された方法で単離されたADRCの単一の海綿内注射を受けた。
21人の男性全員を、注射後1、3、6および12ヶ月で外来診療所で4回の訪問で追跡調査した。性機能は、検証済みのアンケート(国際勃起機能指数-5(IIEF-5)および勃起硬さスコア(EHS)(付録として添付))で評価されました。
観測期間中、重大な事象は発生しなかった。8人の男性が注射部位で一過性の発赤および腫脹を報告し、3人が陰茎領域での反応を報告した。脂肪吸引に関連する8つの経験した可逆的な軽微な事象が、軽い腹部不快感および軽度の腹部血腫などとして報告された。1ヶ月のフォローアップで不快感を報告した患者はいなかった。大陸群の15人中8人(53%)は、勃起機能が12ヶ月の性交に十分であると報告した。6人の失禁男性のグループは、勃起機能の改善を示さなかった。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>大陸</td>
			<td>失禁</td>
		</tr>
<tr>
<td>含まれる患者</td>
			<td>15</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>顕著な効果</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:表は、大陸患者と失禁患者との間の治療の有意な効果の差を示す。

方法およびプロトコルの正確な開示は、幹細胞療法の大規模な取り込みにとって極めて重要である。ここでは、根治的前立腺切除術(RP)後の勃起不全(ED)の治療として単回海綿内注射に使用される脂肪由来再生細胞を単離するためのプロトコールを提示する。

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...

この単離技術は、脂肪幹細胞が根治的前立腺切除術後の患者の勃起機能の再生を助けることができるかどうかを調べるために使用することができる。この方法は、特定の疾患について限定されない。これは、脂肪幹細胞研究のすべての分野で使用することができます。単離された幹細胞は勃起不全を治療するために使用されるが、単離技術は一般的な手順であり、幹細胞は幹細胞研究内の他の分野で有用であり得る。腹部と陰嚢の皮膚を0.5%クロルヘキシジンで消毒することから始めます。外科的マーカーを使用して、脂肪吸引が行われる腹部上の領域、通常は合成と臍の間の領域を描画する。11個のメスで腹部の皮膚に幅6ミリメートルの切開を2回行う。切開部を脂肪吸引の上の描画領域から対称的および横方向に配置する。浸潤カニューレが脂肪吸引中に切開部に容易に出入りするように、切開部に少しの潤滑剤を置く。次に、皮膚の切開部を通してサイズ14ゲージの浸潤カニューレを導入する。修飾クライン溶液を皮下に注射し、皮膚表面に平行な顕著な領域に、標的組織が腫脹してしっかりまたは腫脹状態になるまで注入する。脂肪組織に1対1の比率で修飾クライン溶液の体積を注入する。アドレナリンの効果を最大化し、採取した脂肪組織中の血液の量を減らすために10分間待つ。標準的なジェット注入脂肪吸引を行い、200〜300ミリメートルの脂肪組織を採取する。統合された注入チューブとノズルで中空の鈍いカニューレを使用してください。カニューレを脂肪吸引用の吸引装置に取り付けます。腹部の切開部を通して鈍い先端を持つ3ミリメートルの注射器を導入し、脂肪組織をリポコレクターに集めて脂肪吸引液を滅菌環境で保存します。脂肪吸引液は水相から分離し始めます。50ミリリットルの滅菌シリンジを使用してLipoCollectorからリポ吸引液を吸い上げ、シリンジに吸い込まれる水の量を最小限に抑えます。シリンジの先端にプラグをねじ込み、脂肪組織を無菌に保ちます。滅菌ビニール袋に先端が下向きの注射器を置き、水相からの脂肪吸引液の分離を開始する。その後、袋を滅菌容器に入れます。輸送中の無菌環境を確保するために、容器を滅菌ドレープで覆います。外科医の好む縫合材料で皮膚切開部を閉じる。術後の浮腫を軽減するために腹部の周りに圧縮衣服を置きます。陰茎ブロックを作るには、ブピバカインを2つの部位に注射し、1つは腹側に置き、もう1つは背側に置きます。皮下組織に針全体を導入し、横方向に右を指し示し、針が引っ込められるように麻酔を注入する。注射を繰り返し、針を左に向けます。すべての消耗品と酵素を無菌の使い捨て手術用タオルで覆われたテーブルの上に無菌的に置きます。エタノールでデバイスを拭き取り、消耗品セットをロードします。次に、授乳中のリンガーの袋をシステムに接続します。脂肪吸引液を添加する前に、一連の半自動試験を行う。装置が調製されている間、脂肪を50ミリリットルのチューブに入れて脂肪を液相から分離させる。脂肪組織の総量に注意し、これを使用して、負荷された脂肪の総量がデバイスの容量の範囲内にあることを確認します。デバイスからプロンプトが表示されたら、ティッシュをロードします。機械は余分な液体を排出します。脂肪組織の量の重量を量り、授乳リンガーで洗ってください。組織を洗浄して排水したら、新しい輸液バッグを摂氏37〜39度の授乳リンガーで接続します。コラゲナーゼおよびプロテアーゼを含む市販の酵素ブレンドを5ミリリットルの乳酸リンガーで再構成する。脂肪組織を含むキャニスターに注入する酵素の量が装置に表示されていることを確認します。一度注射すると、酵素消化は約20分続きます。組織消化後、含有量が黄色相を含む上部脂質と脂肪由来再生細胞(ADRCs)を含む下部ピンク色層に分離されていることを確認する。ピンク色の層を消耗品セットの細胞処理チャンバに排出し、脂質層を残します。ADRC が複数回の遠心分離中に細胞処理チャンバ内で濃縮できるようにします。次いで、乳酸リンガーで再構成された10ミリリットルの塩基内を加える。酵素反応は10分間持続し、その後ADRCを洗浄する。ADRCの単離が完了したら、細胞を5ミリリットルのリンゲル乳酸塩に再懸濁し、溶液を5ミリリットルのシリンジに吸引する。シリンジに3ウェイ活栓メスルアーロックを取り付け、4ミリリットルのADRCを別の5ミリリットルの滅菌シリンジに吸引します。最後の1ミリリットルのADRCを1ミリリットルのシリンジに移します。このアリコートは、細胞数、細胞生存率、フローサイトメトリーによる表面マーカーの分析、ADRC分化能などのADRC特性評価分析に使用します。4ミリリットルのADRCが入った5ミリリットルのシリンジに25ゲージの針を置きます。その後、滅菌ドレープに詰めます。ADRCのこの溶液はレシピエントに注入され、平均して840万〜3270万個の細胞を含むべきである。ADRCの溶液がコーパスキャベルノサムに注入されるまでシリンジを静かに傾けることによって、ADRCの溶液が均質なままであることを確認してください。ペニスの上に絞りドレープを置きます。そして、シリコン容器ループを備えた陰茎の根元にある止血帯。ループを締め付け、鉗子で固定し、止血帯を陰茎からの血流を止めるのに十分なほどタイトにします。注射部位の陰茎の皮膚を消毒するために2つの消毒綿棒を使用してください。次いで、1ミリリットルのADRC溶液を、右側の2つの異なる場所で、真珠洞に直角に注入する。左のコーパスキャベルノサムでこのステップを繰り返し、4ミリリットルの総容量を注入する。この方法は、平均年齢が60歳で、根治的前立腺切除術の前に正常な勃起および活発な性生活を有する21人の男性に対するオープンラベル第1相臨床試験で試験された。男性のうち6人も失禁に苦しんでいました。すべての男性は、単離されたADRCの1回の海綿間注射を受け、注射後1、3、6および12ヶ月で外来診療所で4回の訪問を受けた。観測中に重大な事象は発生しなかった。8人の男性が注射部位で一過性の発赤と腫れを報告し、3人が陰茎領域での反応を報告した。8人の男性は、軽い腹部不快感や軽度の腹部血腫など、脂肪吸引に関連する可逆的な軽微な事象を経験した。1ヶ月のフォローアップで不快感を報告した患者はいなかった。彼らの性機能は、勃起機能5の国際指数と勃起硬度スコアで評価されました。大陸グループの15人の男性のうち8人は、彼らの勃起機能は12ヶ月で性交に十分であると報告しました。6人の失禁男性のグループは勃起機能の改善を示さなかったこのプロトコルを試みるとき、単離の手順中に使用される酵素は、手順が開始される2時間前に冷凍庫または冷蔵庫から取り出さなければならないことに留意してください。この技術の結果は、脂肪幹細胞の効果がより大きなスケールで探求されるRCTへの道を開いた。

isolation-adipose-derived-regenerative-cells-for-treatment-erectile

Research

JoVE Journal

Medicine

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