Name: Lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞を分離すること (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶLck:eGFPゼブラフィッシュを用いた悪性・非悪性B細胞の分離法。T細胞とB細胞の発達や急性リンパ性白血病の研究に応用でき、小児がんの適応免疫機構解明に貢献します。

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私たちはゼブラフィッシュのケアのためのミーガン マローン-ペレスと OUHSC の流れの cytometry コアに感謝したいと思います。この作業は、車輪、科学の進歩と技術 (HRP-067)、NIH/日の出 INBRE パイロット プロジェクト賞 (P20 GM103447) オクラホマ センター現代希望からの補助金によって支えられました。大会では、E.L. & テルマ ゲイロードの寄附で小児血液腫瘍学の子供の病院財団が保持しています。

ゼブラフィッシュを含むすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) オクラホマ大学健康科学センターによって承認されました。
1. 遺伝子組換えlck:eGFP 魚から非悪性 B および T リンパ球を分離します。
<ol><li>魚システム水で 0.02 %tricaine (MS-222) を使用して魚を麻酔します。</li>
	<li>ゼブラフィッシュと他の魚類14の鰓腔の背内側面に位置する蛍光 thymi の 2-6 ヶ月魚を確認します。(470/40 励起波長と 525/50 排出フィルター) GFP を検出する落射蛍光顕微鏡を使用します。</li>
	<li>ロズウェル パーク記念研究所メディア (RPMI) 含む 1% 胎仔ウシ血清および 1% ペニシリン ・ ストレプトマイシン (並べ替えメディア) x フィルター滅菌 1 の 50 mL を事前に準備します。未使用並べ替えメディアは、2 ヶ月の 4 ° C で保存できます。</li>
	<li>0.2% を含むビーカーに置くことで、魚を安楽死させる氷浸漬法による Tricaine、約 5 分間続きます。弁蓋部 (ギル) の動きの停止によって死を確認します。</li>
	<li>ペトリ皿に euthanized の魚そして GFP+ thymi14と15の腎臓骨髄および脾臓を解剖する明視野顕微鏡設定を解剖する蛍光顕微鏡を使用して興味のリンパ器官を解剖します。3 歳 6 ヶ月の魚を使用してここに示す結果が得られました。リンパ球の比率と絶対数は、年齢、遺伝子型 (さらに詳細の説明を参照) によって異なります。</li>
	<li>メディアの並べ替え冷 500 μ L を含む 1.5 mL チューブに切り裂かれた器官を配置します。</li>
	<li>杵マイクロ チューブ ホモジナイザーを使って氷の上組織をホモジナイズしてください。</li>
	<li>単一細胞懸濁液を生成する 35 μ m のメッシュ フィルターを均質化組織を通過します。解析まで氷の上細胞を保ちます。</li>
</ol>2. 二重遺伝子組換えrag2:hMYC; lck:eGFP ゼブラフィッシュから悪性リンパ球を分離すること
<ol><li>
Rag2:hMYC; 2-4 ヶ月で始まり、画面の顕微鏡異常な GFP パターンのlck:eGFP魚。 注: B 細胞が GFPlo lck:eGFPバック グラウンドで B オール; を認識する練習が必要ですのでT 細胞が GFPこんにちはT すべては明らかです。その結果、 rag2:hMYC、 lck:eGFPデュアル形質転換線は 2 つの表現型: 鮮やかな蛍光 T-すべて、通常、胸腺から起こり、体とぼんやり蛍光 B-すべてに拡張します。<ol>
<li>画面 (200 ms、2.4 x 利得) 明るい T オール (図 1 a) と「高い危険度」を識別するために「低露出」設定を使用して魚の蛍光顕微鏡を用いた 1.5 s (3.4 x 利得) dim B オール (図 1 a) を識別します。WT コントロールと前白血病魚 GFP 胸腺 (図 1 b) にのみ局在があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>麻酔し、手順 1.1-1.2 で魚を確認します。</li>
	<li>シンプルな 3 つのカテゴリを用いた GFP 蛍光の範囲に基づいて魚を分類します。 注:レベル 1: 蛍光のみ限られたローカル広がりと胸腺腫瘍として表示されます。 レベル 2: 胸腺、含むを超えて表示される蛍光 < 体の 50%。 レベル 3: 蛍光体の 50% を超えて拡張します。</li>
	<li>癌なしでそれらからすべての魚を分けます。一度毎月新しいすべての開発の前白血病魚 (すなわち、GFP+腫瘍なし魚) を監視します。~ 9 ヶ月、すべてのrag2:hMYC、 lck:eGFP魚開発 T オール B は、すべて、またはその両方。</li>
	<li>T または B すべてのセル分離、レベル 3 の魚を選択 (すべて含む > 体の 50%)、以上 2 × 106の降伏をすべてのセルおよび通常多く。</li>
	<li>1.4 の手順のように魚を安楽死させます。 注:すべてのセルを取得する方法が 2 つあります: 全身均一化と腹膜洗浄技術16。メソッドが異なる細胞の選別、収集の絶対数としたがって、FACS の量時間必要とコスト (さらに詳細の説明を参照)。</li>
	<li>いずれかのメソッドの最初ペトリ皿で euthanized の魚を配置し、胸腺の領域を含む頭かみそりの刃を使用して、削除します。これは、必要な場合は組織染色用別々 に処理できます。</li>
	<li>
腹腔洗浄法
	<ol>
<li>P1000 ピペットを使用して、冷間細胞と 5 mL チューブ内のメディアを収集した、メディアのソート 500 μ L で魚の腹腔内を洗います。</li>
		<li>新鮮なピペット チップを使用して、冷たい並べ替えメディアの追加 200-300 μ L を体内に注入します。そして、ピペットの先端を使用して、体内の細胞を押し出すに魚体に穏やかな圧力を適用します。このメディアを収集し、5 mL チューブを追加します。</li>
		<li>2.8.2 手順 2-3 回繰り返します。氷の上のメディアの並べ替えに集められたセルをしてください。</li>
		<li>35 μ m メッシュが流れ cytometry/FACS の前にフィルター処理、解析まで氷の上細胞を保つ細胞懸濁液をフィルター処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
体全体の均質化
	<ol>
<li>魚の頭を削除すると、メディアの並べ替えの 200 μ L を含む 1.5 mL チューブに体を配置します。</li>
		<li>杵マイクロ チューブ ホモジナイザーを使用して体をホモジナイズしてください。</li>
		<li>冷たいメディアの並べ替えの追加 300 μ L を追加します。35 μ m のメッシュ フィルターは、細胞懸濁液をフィルターします。組織破片のみがフィルターに残っているまで、フィルターを介してすべてのセルを洗浄を必要に応じて並べ替えメディアを追加します。解析まで氷の上細胞を保ちます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 正常または悪性 B リンパ球の解析
<ol><li>フローサイトメトリーによる解析および/または製造元のガイドによると FACS パラメーターを設定します。</li>
	<li>
最初サンプルを特徴付けるイベントの数を取得します。1 x 104並べ替え並べ替え手順についてはその後特定のゲートを判断する前に 5 × 104イベントを分析します。
	<ol>
<li>ゲートを決定: 前方散乱 (FSC) および細胞残骸 (図 2 a-c)17を除く側散布 (SSC) パラメーターを使用してリンパ球と前駆細胞のゲートを定義します。FSC と SSC それぞれセル径と粒度に対応します。 注:GFP-、GFPloと GFPこんにちはセルの異なる 10--100-折るべきそれらの GFP の蛍光強度の面でこれらの集団は簡単です (図 2-5) の分離を行います。生きている死者の差別は、この時点で propidium ヨウ素 (PI) または 7 aminoactinomycin D (7 AAAD) 性染色を使用して評価できます。PI で以前実験を行い, 通常 > FACS GFP+細胞の 95% の生存率。</li>
		<li>FACS 機のパラメーターに従って細胞ダブレットを除外します。</li>
		<li>リンパや前駆体ゲート内で数と GFP+細胞の割合を決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フィコエ リスリン (PE) と GFP の強度を使用して、GFPlo GFPこんにちはセル対対 GFP-のゲートを定義します。 注:B 細胞は薄暗い GFP 蛍光を展示し、T 細胞は、 lck:eGFPラインの明るい GFP を表示します。多くのリンパ性器官または腫瘍のサンプル両方 GFP+の人口が含まれます。B 系列細胞/B-すべては GFPloと T 系列細胞/T-すべては、GFPこんにちは。区別する GFP-、GFPlo、GFPこんにちは細胞、ゲートを定義して、これらの集団を分けて集め (図 2 a-C図 3A-C図 4 a 図5 a)。</li>
	<li>メディアの並べ替えの 2 mL を含む異なる 15 mL ポリプロピレン チューブにまたはそれ以上の分析 (例えば、RNA、DNA または蛋白質の抽出、同種移植、等) の適切なバッファーを含む異なる 1.5 mL チューブに直接各細胞集団を並べ替えます。</li>
	<li>さらに分析前に氷の上精製した細胞を保ちます。</li>
</ol>

<ol><li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li>
<li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage%2C+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li>
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<li>Schorpp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+functions+of+Ikaros+in+vertebrate+lymphocyte+development%3A+genetic+evidence+for+distinct+larval+and+adult+phases+of+T+cell+development+and+two+lineages+of+B+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish.</a> Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li>
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<li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC%3A+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li>
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<li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li>
<li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li>
</ol>

著者は利害の衝突を宣言しません。

開発、B 系列ラベル3,4 D. 学モデルにこれを追加するlck:eGFP遺伝子導入ゼブラフィッシュから B 細胞を分離するためのプロトコルを提供しています。幾分意外にも、GFPlo B 細胞のこの行の識別は、2004 年にその説明から見過ごされている行った。一般的に、lckは T 細胞に固有の6と見なされますが、最近の研究が見つかりました予期しないlck式ナチュラル キラーによって、骨髄性細胞、B 細胞18,19に示すように同様。ゼブラフィッシュ B 細胞が GFPlo中古 B、世間知らずと成長した B の我々 の発見と一致して人間の細胞はまた、 LCK11,</su...

ゼブラフィッシュでは、遺伝的手法を用いた研究の脊椎動物の開発を促進する遺伝的操作性, 高産卵、光透光性および急速な発展などの強力な属性を提供しています。魚類と哺乳類の造血の共有の機能と共に、これらの利点によりD. 学成人期にわたって幼生の初期の外観から、リンパ球産生やリンパ球機能の in vivo 解析に最適。哺乳類と共有されている保存されている遺伝的プロセスに依存して血ゼブラフィッシュの開発と適応免疫システムにこれらを拡張します。さらに、リンパ球の開発を支配する分子メカニズムは、ゼブラフィッシュと哺乳類1間著しく保存されます。
過去 2 年間、トランスジェニックD. 学そのラベルの特定血液系統とこれらの系統の欠損突然変異系統は、2,3,4,5を作成されています。Lck:eGFP形質転換線、これらの 1 つはドライブ GFP 式6にゼブラフィッシュ リンパ球の蛋白質チロシンのキナーゼ (lck) プロモーターを使用します。T 系列の前駆体と成熟した T リンパ球が強く表現される遺伝子は胸腺 T 細胞性と T - 細胞の生体内浄化 ex 追跡 FACS7を生体内でことができます。以前は、我々 は前方遺伝 ENU 変異画面でこのラインを使用 T すべてになりやすい生殖細胞系列変異を識別するために、T 細胞の発癌8,9にリンク アデノーマを取得した遺伝的イベントを研究します。
最近、当研究室は、 lck:eGFPゼブラフィッシュの有用性をさらに拡張。二重遺伝子rag2:hMYC (人間 MYC)、 lck:eGFP + 学T オール10を開発する知られているで、私たちはことを発見した B 系統すべてはまた11を発生します。GFP 発現による鮮やかな蛍光を発する、このモデルで T オールとは異なり B すべてがぼんやりと発光 GFP レベルが低いため魚 B オール蛍光顕微鏡による T すべてとのそれらから肉眼的に区別するを許可します。また、この GFP 発現は GFPlo B 全細胞の分離から GFPこんにちはFACS11を使用してすべての T 細胞に許可します。また、低lck式にはLCK11,12の人間 B オールもエクスプレス低レベルとして、ゼブラフィッシュ、B オールに一意ではありません。同様に、 d. 学マウス、および人間の細胞の B 系統もlckの低レベルを表現/LckLCK、未熟な B 細胞の持つ最高の式11,13/。セルごとにlckeGFPゼブラフィッシュまたは誘導体の線に B 系細胞は、T リンパ球、くらい GFP 1-10% を表現します。これら GFPlo表現特性pax5、 cd79b、 blnk、 btk, ighm、 ighz、その他、B 細胞の Mrna を細胞、骨髄、胸腺、脾臓、または周辺から精製することができます。血11。したがって、両方 B- と T-系列細胞にすることができますおよび分離されたlckeGFPゼブラフィッシュからrag2hMYC、 lckeGFP動物、B と T、すべて細胞同様の場合11。
ここでは、我々 はlck:eGFPゼブラフィッシュとrag2hMYC; の非悪性または悪性 B 細胞から非悪性 B 細胞を FACS 浄化効率を私達のプロトコルを提示します。lck:eGFP魚、ソースのさまざまな組織を使用して。必要な場合、そのような細胞を FACS 分離せずフローサイトメトリーによる定量化同様にことができます。低lck式の発見-その結果、GFP の発現が低い -b 細胞のlckeGFPゼブラフィッシュの実験的な可能性の新たな扉を開きますin vivo B 細胞発達研究のよう。したがって、2004 年に最初に報告されたこの形質転換線は、活用するゼブラフィッシュ適応免疫に関する新鮮な洞察を収集することを目指す新しい生活です。

<table><tbody><tr><td>35 &マイクロ;mメッシュ</td><td>Sefar フィルター技術</td><td>7050-1220-000-13</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ポリスチレン丸底チューブ 細胞ストレーナーキャップ付き</td><td>ファルコン コーニング ブランド</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐管</td><td>VWR 国際</td><td>525-0448</td><td></td></tr><tr><td>AZ APO 100 蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Qi1MC カメラ</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチル3-アミノ安息香酸メタンセスルホン酸;MS-222</td><td>Sigma</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>FACSJazz</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine Serum</td><td>Thermo Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lck:eGFP</td><td></td><td></td><td>See Langeneu et al., 2004</td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td>Version 4.13</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Σ</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>乳棒 マイクロチューブ ホモジナイザー</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>64788-20</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック トランスファー pippetes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rag2:hMYC-ER</td><td></td><td></td><td>グティエレス他、2011</td></tr><tr><td>RPMI Media 1640 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr> を参照してください</tbody></table>。

lck:egfpゼブラフィッシュから悪性と非悪性 b 細胞を分離すること

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

ゼブラフィッシュ (動脈分布) は、リンパ球の開発を研究する強力なモデルです。哺乳類のようなD. 形態学は、B および T リンパ球を含む適応免疫システムを所有しています。ゼブラフィッシュ リンパ球産生の研究は困難D. 学セル表面のマーカーを認識する抗体一般に利用できないため、複雑に B 系列を含む異なるリンパ球集団の分離と性状セルです。系統特異蛍光式と形質転換線は、このような課題を回避するために使用します。遺伝子組換えlck:eGFPラインD. 学T 細胞の開発、研究に使用されている、モデル T 細胞の開発と急性リンパ性白血病 (T オール) にも利用されています。Lck:eGFP魚は、T 系列の分析に広く使用されている、B 細胞を研究するために使用されてしていません。最近、低レベルとはいえ多くのゼブラフィッシュ B 細胞がまたlckを表現我々 発見。その結果、 lck:eGFP B 細胞同様に GFP の低レベルを表現します。この発見に基づき、今回lck:eGFPゼブラフィッシュから B 系細胞を浄化するためのプロトコルを開発しました。本手法は、 lck:eGFP魚や二重遺伝子組換えrag2:hMYC; などの関連行から B 細胞を浄化する蛍光活性化細胞選別機 (FACS) を利用する方法をについて説明しますlck:eGFP魚。これらの行は、B 細胞、特に未熟な B 細胞、低ですが検出可能なレベルで特急 GFP は高い GFP を発現する T 細胞と区別されるべきそれらを許可します。B 細胞は骨髄、胸腺、脾臓、血液や他の組織から分離することができます。このプロトコルは、浄化D. 学B 細胞、B 細胞、B リンパ球の悪性腫瘍のようなトピックに焦点を当てた研究を可能にする新しい方法を提供します。

フローサイトメトリー分析して GFPloおよび GFPこんにちは細胞胸腺、骨髄、腎臓、 lck:eGFPトランスジェニックゼブラフィッシュの脾臓から分離する FACS を使いました。1 歳 3 か月の魚の分析では、胸腺に大抵 GFP+のリンパ球が含まれているを明らかにしました。GFP+細胞主、2 部フェリー編ら17に記載されたリンパ門に限られていた。2 つの異なる GFP+集団、GFPloと GFPこんにちは胸腺で観察できます。GFPlo細胞がより少なく豊富、胸腺リンパ球 (表 1) ~ 40% を表す間、GFPこんにちはリンパは 〜 60% の高い割合を表されます。哺乳類とは異なり魚造血骨髄は、骨内ではなく、腎臓内にローカライズされます。GFP (<str...

Lck:eGFP遺伝子導入ゼブラフィッシュの T リンパ球、高い GFP を表現・ T 細胞の開発と急性リンパ性白血病の研究に使用されています。この行より低いレベルでlckを表現研究 B 細胞に使用できます。このプロトコルでは、 lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞の浄化について説明します。

Lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞を分離すること

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

我々は最近、LCK GFPゼブラフィッシュの多くのB細胞がGFPの低レベルを発現することを発見した。これにより、この行は、B細胞だけでなく、T細胞を研究するための有用なツールになります.この技術の主な利点は、LCK GFPゼブラフィッシュからB細胞とT細胞を研究したり、癌を持つ魚からB-ALL細胞とT-ALL細胞を研究できることです。これらの方法は、ゼブラフィッシュにおけるB細胞の発達およびB-ALL研究を可能にする。これは適応免疫システムを理解することに関連しており、小児がんによく見られる悪性腫瘍です。あなたが良い胸腺と骨髄サンプルを得ることができるまで、数回あなたの技術を洗練する前に、これらの解剖をしたことがない場合.視覚的なデモンストレーションは、視聴者が魚の蛍光とB-ALLを認識し、その分離のためにB細胞とT細胞を識別するための正しい設定を選択するのに役立ちます。魚系水中の0.02%Tricaineで麻酔した後、エピフルエンス顕微鏡のGFPフィルターを使用して、枝腔の後内側の側面で2〜6ヶ月のシブラフィッシュの蛍光チミを調べます。胸腺を見つけると、ペトリ皿に安楽死させた魚を配置し、蛍光顕微鏡を使用してGFP陽性のチミを除去する。そして、腎臓の骨髄と脾臓を収穫するための明視野顕微鏡設定。採取した各臓器を、500マイクロリットルの冷たい選別媒体を含む1.5ミリリットルのチューブに入れ、氷上の組織を均質化するために害虫マイクロチューブホモジナイザーを使用します。次に、35マイクロメートルのメッシュフィルターを介して均質化された組織をひずみ、単一の細胞懸濁液を生成し、細胞を氷の上に置く。2〜4ヶ月から、蛍光顕微鏡を使用して二重トランスジェニックrag2:hMYC LCK EGFP魚を低暴露設定でスクリーニングし、明るいT細胞急性リンパ芽球性白血病またはT-ALLおよび高暴露設定を同定して薄暗いB-ALL動物を同定します。野生型制御および白血病前魚は、GFPが胸腺にのみ局在している。簡単な3つのカテゴリシステムを使用して、GFP蛍光の程度に基づいて魚を分類します。レベル1の魚は、限られた局所的な広がりだけで胸腺腫瘍として蛍光シグナルを示す。レベル2の魚は、体の50%未満を含む胸腺を越えて蛍光シグナルを示す。そして、レベル3の魚は、体の50%を超えて伸びる蛍光シグナルを実証します。魚をがんのない魚とALLで分離します。そして、新しいALLの開発のために毎月1回GFP陽性腫瘍のない白血病前の魚を監視します。TまたはB-ALL細胞分離のために、カミソリの刃を使用して、安楽死させたレベル3匹の魚の頭と胸腺領域を取り除き、体をシャーレに入れます。P-1000ピペットを使用して、魚の腹膜腔を500マイクロリットルの冷たい選別媒体で洗浄し、5ミリリットルのチューブに細胞と培地を採取します。新鮮なピペットチップを使用すると、体腔に冷たい選別媒体の2〜3つの追加の200〜3マイクロリットルの量を注入し、ピペットの先端を使用して魚の体に穏やかな圧力を加え、体腔から5ミリリットルチューブに細胞を押し出します。次いで、35マイクロリットルのメッシュフィルターを介して細胞懸濁液をひずむ。そして、フローサイトメトリーによる分析まで細胞を氷の上に置きます。全身均質化のために魚の体を均質化し、チューブに冷たい選別媒体の追加300マイクロリットルを追加するために、害虫マイクロチューブホモジナイザーを使用してください。35マイクロメートルのメッシュフィルターを通して細胞懸濁液を濾過し、必要に応じて、組織の破片だけがフィルターに残るまで、追加の選別媒体でフィルターを洗浄する。次に、分析まで細胞を氷の上に置きます。分離細胞のフローサイトメトリック解析では、製造業者のガイドラインに従ってフローサイトメーターパラメータを設定します。リンパ球および前駆細胞ゲートを定義するための前方散乱および側面散乱パラメータを設定し、細胞の破片を除外するために10,000〜50,000のイベントを取得する。細胞ダブレットを除外し、リンパ球および/または前駆体ゲートを使用して、GFP陽性細胞の数と割合を決定します。フィコエリスリンとGFP強度を使用すると、GFP陰性対GFP低対GFP高細胞のゲートが定義されます。GFP低細胞とGFP高細胞を単離するためのゲートをどこに配置するのかを学ぶことは、純粋なBおよびT細胞集団を得るために重要です。2つの異なるGFP陽性集団、GFP低B細胞およびGFP高T細胞は、胸腺から得ることができる。生後3ヶ月のゼブラフィッシュの腎臓骨髄に存在するB細胞は、GFPの低レベルを発現する。しかしGFPの高細胞は乏しく、3ヶ月齢の骨髄にはTリンパ球のごく一部しか存在しない。同様に、脾臓サンプルはGFP高細胞よりも低いGFPの割合が高いことを示す。急性リンパ芽球性白血病をまだ発症していない二重トランスジェニック魚では、胸腺、骨髄および脾臓におけるGFP発現は、単一トランスジェニックなLCK EGFP魚で観察されるのと同様である。しかし、臓器1個あたりのリンパ球数は増加する。おそらく、RAG2プロモーターが活性である未熟なBおよびT細胞集団のMYC駆動型の拡張に起因する。6ヶ月までに蛍光癌を発症したBおよびT-ALLを有する二重トランスジェニック魚では、B-ALLはほとんどGFP低細胞を含む薄暗い蛍光癌である。対照的に、明るい蛍光魚は、GFP低B-ALLおよびGFP高T-ALL細胞の両方の単離されたT-ALLまたは混合集団のいずれかを収容することができる。実際、定量的ポリメラーゼ連鎖反応分析により評価されるように、GFP低細胞は高レベルのB細胞転写産物を発現する。そして、GFP高細胞は、より高いレベルのT細胞遺伝子、LCKおよびGFPマーカーを発現する。顕微鏡でB-ALLで魚を認識する方法を学ぶことが重要です。そしてGFP低母集団とGFP高集団を分離するためのフローサイトメトリーゲートを適切に定義する方法。この手順に従うと、PCR、シーケンシング、血液または生体内移植実験のために、GFP低細胞およびGFP高細胞からDNA、RNA、またはタンパク質を分離することができます。LCK GFB魚がT細胞に加えて蛍光B細胞を持っていることを知ったら、同じ動物の両方の細胞タイプを研究してBとT-ALLを評価することができました。

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ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

本稿では、神経芽細胞腫のゼブラフィッシュモデル、特に自発的に転移を発症する MYCN および LMO1の過剰発現を伴うトランスジェニックゼブラフィッシュ系統における腫瘍転移をリアルタイムで発生、特徴付け、および追跡する方法を紹介する。...

神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル

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ゼブラフィッシュTol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ

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細胞増殖染色を用いたゼブラフィッシュT細胞急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞の同定 

学ぶLck:eGFPゼブラフィッシュを用いた悪性・非悪性B細胞の分離法。T細胞とB細胞の発達や急性リンパ性白血病の研究に応用でき、小児がんの適応免疫機構解明に貢献します。

Lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞を分離すること

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