Name: 人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: 学ぶ 強化型イースト1ハイブリッドスクリーニング法で、特定のDNA配列に結合する転写因子を同定する方法です。1回の実験で1,000以上の転写因子をスクリーニングでき、機能的ゲノミクス研究に有用です。

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この作品は、健康の国民の協会 [J.I.F.B. に R35-GM128625] によって支えられました。

1. 準備
<ol><li>
Sc −U アリルメ プレート (150 mm ペトリ皿) 注:これらのプレートは、DNA 餌酵母菌の成長のために使用されます。<ol>
<li>ドロップ アウト ミックス、イースト窒素ベース (YNB)、アデニン hemisulfate 920 mL の水、5.9 (メディアのリットル当たり 1 mL; 構成の表 2を参照してください約) 5 M NaOH で pH のアンモニウムの硫酸塩を溶解します。2 L フラスコに注ぎ、攪拌棒を追加します。</li>
		<li>2 番目の 2 L フラスコで 950 mL の水に寒天を追加 (オートクレーブで沸騰して寒天が発生するので攪拌棒を追加しないでください)。</li>
		<li>液体のサイクルで 15 psi で 40 分間オートクレーブします。</li>
		<li>すぐにフラスコを含む寒天培地に攪拌棒を含む最初のフラスコの中身を注ぐ。グルコースを追加撹拌プレートによく混合し、55 ° C の水浴中にクールします。</li>
		<li>ロイシンとトリプトファンをメディアに追加します。撹拌プレートによく混ぜ、150 mm 滅菌シャーレ (一皿 〜 80 mL) に注ぐ。室温で 3-5 日間の乾燥、ポリ袋でラップし、常温で 6 ヶ月保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
YAPD 長方形プレート 注:これらのプレートは、DNA 餌ひずみと配列のコレクションに TF と交尾のための芝生の成長のために使用されます。<ol>
<li>粉末 (組成は表 3を参照)、寒天を除いて 2 L フラスコに水 950 mL に溶解し、攪拌棒を追加します。</li>
		<li>2 番目の 2 L フラスコで 950 mL の水に寒天を追加 (オートクレーブで沸騰して寒天が発生するので攪拌棒を追加しないでください)。</li>
		<li>液体のサイクルで 15 psi で 40 分間オートクレーブします。</li>
		<li>すぐにフラスコを含む寒天培地に攪拌棒を含む最初のフラスコの中身を注ぐ。</li>
		<li>グルコースを追加撹拌プレートと 55 ° C にクール ミックス長方形の板にメディアを注ぐ (材料の表を参照してください; プレートごと 〜 70 mL) 蠕動ポンプ (5 mL/秒) と 6 mm のチューブを使用して。常温で 1 日乾燥、ポリ袋でラップし、6 ヶ月、冷蔵室で保存します。 注: 推奨メディア ボリュームは、プレートごと 70 mL は、プレートごとの 50-80 mL を使用できます。注いで板の 1 時を考慮する 3 つの重要な問題) 寒天メディア プレート全体で同じ厚さになるよう、平準化する (プレート注ぐため平準化されたテーブルまたはサーフェスを使用して、7 つ以上のプレートのスタックに注がないこと)、2) 寒天中の気泡のないことを保証するメディア (泡をポップする滅菌針を使用して)、および 3) 1 日のみのプレートを乾燥し、酵母を固定での失敗を避けるためにビニール袋にプレートをラップします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sc −Trp と Sc −U −Trp 長方形プレート 注:これらのプレートは、TF 配列コレクション (Sc −Trp) の成長のためと交尾 (Sc −U −Trp) 後の二倍体酵母の選択に使用されます。<ol>
<li>ドロップ アウト ミックス、YNB、アデニン hemisulfate、水・ NaOH 5 M (メディアの 1 リットル当たり約 1 mL) で 5.9 pH 920 mL に硫酸アンモニウムを解散 (組成は表 4を参照)。2 L フラスコに注ぎ、攪拌棒を追加します。</li>
		<li>2 番目の 2 L フラスコで 950 mL の水に寒天を追加 (オートクレーブで沸騰して寒天が発生するので攪拌棒を追加しないでください)。</li>
		<li>液体のサイクルで 15 psi で 40 分間オートクレーブします。</li>
		<li>すぐにフラスコを含む寒天培地に攪拌棒を含む最初のフラスコの中身を注ぐ。グルコースを追加撹拌プレートによく混合し、55 ° C に冷却</li>
		<li>ロイシン、ヒスチジン、およびウラシル (Sc −U −Trp プレートのウラシルの省略) を追加します。</li>
		<li>撹拌プレートによく混ぜ、長方形プレート (プレートごと 〜 70 mL) に注ぐ蠕動ポンプ (5 mL/秒) と 6 mm のチューブを使用しています。室温で 1 日乾燥、ビニール袋でプレートをラップし、3 ヶ月の冷蔵室で保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sc −U アリルメ −Trp + 3AT + X gal 長方形プレート 注:これらのプレートは eY1H の試金のための読み出しプレートとして使用されます。<ol>
<li>ドロップ アウト ミックス、YNB、アデニン hemisulfate、850 mL の水に硫酸アンモニウムを解散 (構成の表 5を参照)。PH ではないか。2 L フラスコに注ぎ、攪拌棒を追加します。</li>
		<li>2 番目の 2 L フラスコで 850 mL の水に寒天を追加 (オートクレーブで沸騰して寒天が発生するので攪拌棒を追加しないでください)。</li>
		<li>液体のサイクルで 15 psi で 40 分間オートクレーブします。</li>
		<li>900 mL の水、Na2HPO4∙7H2O の 70 g、34.5 g NaH2PO4∙H2O. ミックス粉末を溶解し、5 M NaOH を使用して 7.0 に pH を合わせなさい攪拌棒を使用してを組み合わせることにより府塩 (1 L) × 10 を準備します。1 L とオートクレーブにもたらすための水を追加します。</li>
		<li>42.5 mL ジメチル ホルムアミドを含む 50 mL プラスチック チューブに X gal パウダー 3.5 g を追加して X gal ソリューションを準備します。簡単に解散するジメチル ホルムアミドに X gal 粉末を追加 (これは 30 分かかります)。(使用不透明な 50 ml のチューブやアルミホイルでカバー) 暗闇の中で原液を維持します。-20 ° C にてストア</li>
		<li>すぐにフラスコを含む寒天培地に攪拌棒を含む最初のフラスコの中身を注ぐ。ブドウ糖を追加 BU 塩 (構成の表 5を参照)、x 10 撹拌プレートによくミックス 55 ° C に冷却し、</li>
		<li>ロイシン、3AT と X gal (構成の表 5を参照) を追加します。</li>
		<li>撹拌プレートによく混ぜ、長方形プレート (プレートごと 〜 70 mL) に注ぐ蠕動ポンプ (5 mL/秒) と 6 mm のチューブを使用しています。室温で 1 日乾燥ビニール袋、ラップやアルミホイルで覆われた冷蔵室で保存 (3AT と X gal が光に敏感) まで 1 ヶ月。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. TF 配列のスポッティング
<ol><li>
TF 獲物配列を融解
	<ol>
<li>雪解けの氷に TF 獲物配列を持つ酵母グリセロール ストック プレート。 注:以前に発行された10,12,13,18として TF 獲物配列を生成できます。</li>
		<li>次のステップの前に 1-3 分以内で 12 チャンネル ピペットを使用して酵母を再懸濁します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
長方形板の Sc −Trp に酵母をスポッティング
	<ol>
<li>HDA ロボット (材料の表を参照)、選択 96 ウェルプレート ソース、ターゲット、および 96 長期ピンパッドと 96 の寒天。 注:Pin パッドは、再利用可能なない、破棄する必要があります。</li>
		<li>96 ウェル プレートあたりの 2 つのコピーを作成する多くの複製プログラムを選択します。ごみ箱を使用しない、またはフリーズされた在庫のバックの汚染を避けるためにオプションを再訪します。</li>
		<li>酵母を混ぜてソースに、上下に旋回するためのオプションを選択します。</li>
		<li>斑点を付けられた配列をバッグし、インキュベート寒天側を 30 ° C で 2-3 日。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sc −Trp 長方形板で 384 のコロニーの配列を生成します。
	<ol>
<li>ロボットのソース、ターゲットとして寒天培地 384 と 96 の短い pin パッドとして 96 寒天を選択します。</li>
		<li>1:4 配列のプログラムを選択します。この方法で (別の TF をそれぞれ含む) 4 96 コロニー プレートは 1 384 植民地板に統合されます。ごみ箱を使用しない、または異なるプレートの間の汚染を防止するためのオプションを再訪します。</li>
		<li>バッグ プレートとインキュベートする斑点を付けられた 384 コロニー アレイ寒天側を 30 ° C で 2 日間。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sc −Trp 長方形板で 1,536 コロニーの配列を生成します。 注:これは各 TF 獲物の 4 つの植民地を含む配列になります。<ol>
<li>ロボットのソース、ターゲットとして 1,536 寒天 384 短い pin パッドと 384 寒天を選択します。</li>
		<li>1:4 の試金の単一のソース プログラムを選択します。目標は、quadruplicates を取得する 4 つのコロニーに各コロニーをコピーします。ごみ箱を使用し、4 回各植民地のコピーを行うとオプションを再訪します。</li>
		<li>バッグ プレートとインキュベートする斑点を付けられた 1536 コロニー アレイ寒天側を 30 ° C で 3 日間。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sc −Trp 長方形板で 1,536 コロニー配列を増幅
	<ol>
<li>ロボットのソース、ターゲットとして 1,536 寒天、1,536 短い pin パッドとして 1,536 寒天を選択します。</li>
		<li>3-4 のコピーを複製する複製の多くのプログラムを選択します。ごみ箱を使用してオプションを再訪、交差汚染を避けるために配列の異なるプレートへの切り替え時にパッドを捨てます。</li>
		<li>バッグ プレートと手順 (下記参照) を交配に使用する 3 日間の 30 ° c を斑点を付けられた 1536 コロニー アレイ寒天側を孵化させなさい。その後、スクリーニングの新しいラウンドの 7 日後に再び常温、コピー版を維持します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. eY1H 画面
<ol><li>
交配のため DNA 餌ひずみの芝生を準備します。
	<ol>
<li>Sc −U アリルメ プレートに DNA 餌株酵母を発見し、30 ° C で 3 日間の成長</li>
		<li>各プレートは、12-16 異なる系統を収まるように、生殖不能のつまようじを使用して Sc −U アリルメ プレート 15 cm に酵母を連勝します。1 日 30 ° c. で孵化させなさい</li>
		<li>各プレートは、4 の異なる系統を収まるように、生殖不能のつまようじを使用して Sc −U アリルメ プレート 15 cm に酵母を連勝します。30 ° C で 1 日間インキュベートします。</li>
		<li>ない任意の寒天をこすりし、1.5 管 500 μ L の滅菌水に追加に確かめる生殖不能のつまようじを使用して酵母をこすり。</li>
		<li>YAPD 長方形板に 10-15 滅菌ガラス ビーズを追加します。プレートの上に酵母液を追加し、徹底的に酵母をすべてのプレートを介して広がるように 1 分のすべての方向に振る。</li>
		<li>すぐに板を反転し、ビーズが蓋に行くようにするをタップします。削除し、ビーズをリサイクルします。</li>
		<li>プレートの袋し、30 ° C で 1-2 日間ダウン寒天側をインキュベート交配の手順に進みます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
酵母 DNA 餌と TF 配列の系統の交配
	<ol>
<li>YAPD 長方形プレートにロボットと TF の配列を転送します。ソースとターゲット、1,536 短い pin パッドと 1,536 寒天プレートを選択します。多くの複製プログラムを選択します。配列にある各 TF のプレートは、(配列の枚数) に応じて 3-4 YAPD プレートに転送する使用できます。交配用 TF 配列板は生後 2-3 日をする必要がありますが、もっと交配としては効率的かもしれません。</li>
		<li>DNA の餌ひずみの芝生をすでにロボットと TF 配列を含む YAPD プレートに転送します。ソースとターゲット、1,536 短い pin パッドと 1,536 寒天プレートを選択します。多くの複製プログラムを選択します。~0.6 mm の半径を持つソースにランダムなオフセットを使用して、同じ場所から酵母の服用を避けるし、酵母菌との間の接触を容易にターゲット上でミックスします。ソースとターゲットとして 3.2.1 のステップで発見 TF 配列を含む YAPD プレートとして DNA 餌系統 (セクション 3.1) を含む芝生を使用します。</li>
		<li>バッグ プレートとインキュベート寒天側を 30 ° C で 1 日。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
二倍体酵母の選択
	<ol>
<li>YAPD プレートから嵌合酵母を転送すると、ロボットと Sc −U −Trp プレート。ソースとターゲット、1,536 短い pin パッドと 1,536 寒天プレートを選択します。複製プログラムを選択します。ソースとターゲットをミックスします。</li>
		<li>バッグ プレートとインキュベート寒天側を 30 ° C で 2-3 日 (長い潜伏は高いバック グラウンド レポーターの活動につながる)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
転送読み出しプレート
	<ol>
<li>Sc −U −Trp プレートから読み出し長方形板 Sc −U アリルメ −Trp + 5 mM 3AT 0.4 mM X gal のロボットを使用してに二倍体酵母を転送します。ソースとターゲット、1,536 短い pin パッドと 1,536 寒天を選択します。複製プログラムを選択します。</li>
		<li>バッグ プレートとインキュベート寒天側を 30 ° C で 7 日前まで。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
読み出しプレートのイメージング
	<ol>
<li>DNA の餌の高いバック グラウンド レポーターの活動と、2、3、および 4 の日に写真を撮る。そうしないと、4 と 7 日間で写真を撮る。肯定的な相互作用イースト コロニーの成長とブルーの色によって識別され、手動で決定することができます。 またはイメージ解析ソフトウェアを使用して決定できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

ここで大きく説明ロボット eY1H 交尾スクリーニング アプローチは、以前のライブラリ スクリーニングと比較して興味や変換に基づく配列スクリーニング アプローチの DNA 領域にバインド TFs のセットを識別するためにスループットを向上します。アッセイは、TF ごとにテストしたすべての 4 つの植民地のために積極的、相互作用の 90% は同じ酵母 DNA 餌ひずみ10の独立した画面で再テストの相互作用の 90% が検出された再現性の高い eY1H によって検出された TF DNA 相互作用さらに、,12,19しますさらに重要なのは、eY1H によって検出された TF DNA の相互作用は人間レポーターの試金12,20、ひと初代細胞 (未発表結果)、およびc. の elegansノックアウト動物をテストしたときの 40...

バイオメディカル分野で中心的な問題は、各人間の遺伝子を調整するメカニズムを決定します。転写は遺伝子発現を制御する最初のステップと対象の各遺伝子は、転写因子 (TFs) の規制を受けます。人間はエンコードのことを考える > 1,500 TFs1、2、各遺伝子の発現を制御する TFs の完全なセットを識別する開かれた挑戦に残る。
TF DNA の相互作用をマップする 2 種類の方法を使用できます: TF 中心と DNA の方法3 (図 1 a)。TF を中心とした方法でまたは DNA 結合特異性を決定するゲノム DNA 領域にバインドするための関心の TF がプローブされます。これらのメソッドには、クロマチン免疫沈降 (チップ) 続いて高スループット シーケンス、タンパク質結合マイクロ アレイと SELEX4,5,6が含まれます。DNA を中心とした方法では、DNA 配列に結合する TFs のセットを決定する興味の DNA シーケンスがプローブされます。このようなメソッドの中で最も広く応用イースト 1 ハイブリッド (Y1H) 試金、TFs と DNA の相互作用の地域、レポーター遺伝子7,8,9を使用して酵母核の環境でテスト済みです。
Y1H アッセイを含む 2 つのコンポーネント: 'DNA-餌' (例えば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等) と ' TF-犠牲、' レポーター遺伝子活性化9,10 (図 1 b) を上映することができます。DNA の餌は上流のクローン作成 2 つのレポーターの遺伝子 (LacZおよびHIS3) および両方の DNA bait::reporter 構造、chromatinized 'DNA 餌系統 ' を生成する酵母ゲノムに統合されて。TF DNA の相互作用のために採取する DNA 餌ひずみに TF 獲物、Gal4 TF、酵母の活性化ドメイン (AD) 融合した TF を表現するプラスミッドで符号化を導入します。TF 獲物は餌 DNA シーケンスにバインドされた場合 TF 獲物で存在の広告は、この両方のレポーターの遺伝子の活性化に します。その結果、肯定的な相互作用を持つ細胞をプレート 3-アミノ-1,2,4-トリアゾール (3 AT)、競争の阻害剤を克服し同様、ヒスチジンに欠けている成長のための選択および X gal の存在下で青いコロニーとして視覚化できます。強力な酵母 Gal4 AD を使用すると、Y1H のアッセイは、リプレッサーと同様に、転写活性化因子の相互作用を検出できます。さらに、TF-犠牲が強い酵母プロモーター (ADH1) から出されることを考えるは、TFs 低内因性発現レベルが、チップ11,12の検出に挑戦しているのも相互作用を検出できます。
Y1H アッセイを行うため最も公開プロトコル選択、ピッキング、コロニーおよび相互作用の TF を識別するために配列することによって続いてプールの TF 獲物ライブラリを変換することによって酵母 DNA 餌に TF-犠牲を導入することに基づいています。個々 の変換8,9のクローンを作成します。これらは、時間のかかるプロトコル、研究員あたりテストすることができます DNA シーケンスの数を制限することです。呼ばれる、Y1H のアッセイの最近の改善強化 Y1H (eY1H) が DNA 餌酵母酵母のコレクションにそれぞれ異なる表現をチームメイトに高密度配列 (HDA の) ロボット プラットフォームを用いたスクリーニングのスループットを大幅に増加TF 獲物10,13 (図 1)。これらの画面は、唯一の 3 つのプレートを使用して 4 連で最も人間 TFs をテストするを許可する 1,536 コロニー形式を採用しています。さらに、TF DNA の相互作用は一対にテスト、ことを考えるこのアプローチ (2 つの非翻訳一塩変形) など DNA 餌とは別の TFs の間の相互作用を比較することができますまたは TF バリエーション11,12。 ,14。
EY1H の試金を使用して、最大の人間と DNA を中心とした TF DNA 相互作用ネットワークに日の線虫を線引きが。特に、246 人間発生エンハンサーと 283 の TFs122,230 相互作用を同定しました。さらに、109 単一のヌクレオチド非コード バリエーション発達奇形、がん、神経疾患などの遺伝病に関連付けられている変更した TF バインディングを明らかにする eY1H のアッセイを採用しました。もっと最近、2,576 c. の elegans遺伝子プロモーターと 366 の TFs1121,714 相互作用で構成されるネットワークを記述する eY1H を使用しました。このネットワークはc. の elegans TFs の数十の機能的役割を明らかにするため尽力しました。
DNA の餌の汚れを生成、バック グラウンド レポーターの活動のレベルを評価するプロトコルがされている15,16,17は別途報告します。ここでは、1,086 人間 TFs の配列に対して任意の人間ゲノム DNA の領域を画面に使用することができます eY1H パイプラインについて述べる。一度酵母 DNA 餌ひずみが生成され、対応するプレートの上に TF 獲物配列を発見、プロトコル全体は 2 週間 (表 1) で実行できます。もっと重要なは、単一の研究者は同時に 60 餌 DNA シーケンスを選別できるようにプロトコルを並列化できます。プロトコルを示すためには、我々 は CCL15 と IL17F の 2 つのサイトカイン遺伝子のプロモーターを上映しました。さらに、eY1H 試金およびそれらの解決方法を実行する場合に発生する可能性のある問題の種類を説明するために失敗した画面からの結果を示す.

<table><tbody><tr><td>3-アミノ-1,2,4-トリアゾール (3AT) ~95% TLC</td><td>シグマ</td><td>A8056-100G</td><td>HIS3遺伝子の製品のための競合阻害剤</td></tr><tr><td>アデニン硫酸塩(半硫酸塩)、二水和物</td><td>米国生物製剤</td><td>A0865</td><td>適切な酵母成長に必要</td></tr><tr><td>寒天高ゲル強度-細菌学グレード</td><td>米国国際化学</td><td>AGHGUP</td><td>酵母成長のための栄養培地</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>合成酵母培地中の窒素源</td></tr><tr><td>D+ グルコース 無水</td><td>US Biologicals</td><td>G3050</td><td>酵母の成長に必要</td></tr><tr><td>ドロップアウトミックス マイナス His、Leu、Tryp、Uracil、アデニンリッチ w/o 酵母窒素ベース</td><td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>酵母成長エッジに必要な合成完全培地</td></tr><tr><td>マルチパラメータpHメーター</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2020-01</td><td>選択的な媒体のpHを測定するには</td></tr><tr><td>フラットつまようじ 750カラット</td><td>ダイヤモンド</td><td></td><td>ペトリディッシュに酵母を縞</td></tr>模様にする <tr><td>ガラスビーズ</td><td>ウォルター・スターン</td><td>100C</td><td>芝生を作るときに酵母をスプリークするには</td></tr><tr><td>グリセロール&ge;99%</td><td>ミリポアシグマ</td><td>G9012-1L</td><td>冷凍酵母ストックを作るために必要ですL</td></tr><tr><td>-ヒスチジン</td><td>米国生物製剤</td><td>H5100</td><td>選択培地での酵母成長選択用</td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>米国生物製剤</td><td>L2020-05</td><td>選択培地での酵母成長選択用</td></tr><tr><td>L-トリプトファン</td><td>シグマ</td><td>T-0254</td><td>選択培地Nでの酵母成長選択用</td></tr><tr><td>、N-ジメチルホルムアミド</td><td>シグマ</td><td>319937-1L</td><td>X-gal溶液を作るために</td></tr><tr><td>オムニペンスエリート</td><td>ウィートン</td><td>W375030-A</td><td>シンガープレートにメディアの正確な量を分配するため</td></tr><tr><td>ペプトン、細菌学</td><td>アメリカ国際化学</td><td>PEBAUP</td><td>酵母の成長に必要なタンパク質源</td></tr><tr><td>シャーレ、150 mm x15 mm</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>酵母の餌を成長させるためスクリーニング</td></tr><tr><td>PlusPlates</td><td>シンガーインスツルメンツ</td><td>PLU-003</td><td>シンガーロボットで使用する長方形の寒天プレートを作るには</td></tr><tr><td>精密低温BOD冷蔵インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>PR205745R</td><td>酵母プレートを恒温でインキュベートするには</td></tr><tr><td>RePads 1,536 ショート</td><td>シンガーインスツルメンツ</td><td>REP-005</td><td>TF-preyアレイを移し替え、酵母を交配し、酵母を二倍体選択および読み出しプレートに移すには</td></tr><tr><td>RePads 384 short</td><td>Singer</td><td>Instruments REP-004</td><td>TF-preyアレイを384から1,536コロニーフォーマットに移すには</td></tr><tr><td>RePads 96 long</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-001</td><td>TF-preyアレイをグリセロールストックから寒天プレートに移すには</td></tr><tr><td>RePads 96 short</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>TF-preyアレイを96から384コロニーフォーマットに転送するには</td></tr><tr><td>Singer HDA RoToRロボット</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>酵母をハイスループットで転送するため</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(ペレット/認定ACS)</td><td>フィッシャーS318-1</td><td></td><td>選択的な培地のpHを調整するため</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性七水和物</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー</td><td>sc-203402C</td><td>X-gal&nbspのLacZレポーター活性に必要;</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202342B</td><td>X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>ウラシル</td><td>シグマ</td><td>U0750-100G</td><td>選択的な媒体</td></tr><tr><td>X-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-ベータ-Dgalactopyranoside)</td><td>の酵母</td>成長選択のために金バイオテクノロジー <td>X4281C100</td><td>&beta;-ガラクトシダーゼはタンパク質とDNAの相互作用を検出するために無色のX-galブルーに変わります</td></tr><tr><td>酵母抽出</td>物<td>米国生物製剤Y2010</td><td></td>酵母<td>の成長</td></tr><tr><td>と繁殖のための栄養培地酵母窒素ベース(粉末)w / o AA、炭水化物、w / o AS&nbsp;</td><td>米国の生物製剤</td><td>Y2030</td>は<td>、活発な酵母の成長に必要</td></tr></tbody></table>

人間の dna 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

各人間の遺伝子を調節する転写因子 (TFs) のセットを識別するは、多数の実験と計算のアプローチの統合を必要とする困難な作業です。このような 1 つの方法は、酵母 1 ハイブリッド (Y1H) 試金、TFs と DNA の相互作用の領域、レポーター遺伝子を用いた酵母核の環境でテストします。Y1H アッセイを含む 2 つのコンポーネント: 'DNA-餌' (例えば.、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー等) と ' TF-犠牲、' レポーター遺伝子の活性化のため上映することができます。Y1H 画面を実行する最も公開されたプロトコルは DNA 餌酵母に TF 獲物ライブラリまたは配列の変換に基づいています。ここでは、パイプラインについて述べる、強化された Y1H と呼ばれる (eY1H) 試金、TF 獲物系統高密度配列を使用して配列コレクションを持つ DNA 餌株を交配による TF DNA の相互作用を尋問するところ、1,536 のスクリーニングができる (HDA) ロボットプラット フォームコロニーの形式です。これにより、スループットが劇的に増加 (60 DNA 餌系列 > 1,000 TFs 研究員あたり 2 週間はかかる) と再現性。画面とそれらの解決方法の中に発生する問題の例と同様、1,086 人間 TFs の配列に対してヒトプロモーター配列をテストすることによって期待される結果の種類を示しています。

EY1H 試金から結果の分析と 3 つの主な要因を考慮すべき: DNA 餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動、TF DNA の相互作用、および肯定的なコロニーの数に対応するレポーターの活動の強さ。DNA の餌ひずみのバック グラウンド レポーターの活動 (すなわち、autoactivity) は、全体的な成長と TF 獲物がない場合でも、読み出しプレートの酵母コロニーの色を指します。理想的には、非 autoactive 系統表示背景白または茶色色、肯定的な相互作用のための植民地とされている大きくて青い。Autoactive DNA 餌系統はヒスチジンと X gal の存在下で DNA 餌8酵母転写活性化因子の結合に関連している可能性が高い板のすべてのコロニーのための青の色に欠けているメディアで酵母の増殖を示します。検出された TF DNA の相互作用に対応する記者活動 (すなわち、コロニーのサイズ) と青色の強度の強度親和性、酵母で TF の発現レベル、サイトとの距離をバインドの数などの多くのパラメーターに依存します。ある酵母の最小プロモーター レポーター遺伝子と DNA 餌ひず...

強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーニング興味の人間 DNA 領域にバインドできる転写因子 (TFs) を識別するためにプロトコルを紹介します。このメソッドのバインディングを問い合わせたりすることができます高速スクリーニング パイプラインを使用して > 単一の実験で 1,000 TFs。

人間の DNA 配列に結合する転写因子を識別するために強化されたイースト 1 ハイブリッド スクリーン

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

強化された酵母ワンハイブリッドアッセイの目的は、目的のDNA配列に結合する転写因子のセットを特定することです。この技術の利点は、強化された酵母ワンハイブリッドアッセイが1回の実験で1000以上の転写因子を評価できることである。逆に、クロマチン免疫沈降は一度に1つの転写因子のみを評価する。この方法は、遺伝子プロモーターおよびエンハンサーに結合する転写因子のレパートリーを同定し、非コード変異体に結合する転写因子を同定するための機能的ゲノミクスのための重要なツールを構成する。この手順のデモンストレーションは、私の研究室のポスドクです。氷の上にTF獲物配列で酵母グリセロールストックプレートを解凍します。12チャネルピペットを使用して酵母を再懸濁し、1〜3分以内に次のステップに進みます。酵母をScマイナストリプトファン長方形プレートにスポットするには、高密度アレイロボットを使用してマルチウェル96プレートをソースとして、96枚の寒天プレートをターゲットに、96個のロングピンパッドを選択します。ピンパッドは再利用可能ではなく、廃棄する必要があります。96ウェルプレートごとに2つのコピーを作成するには、スポット多プログラムを選択します。冷凍在庫の逆汚染を避けるために、リサイクルまたは再訪オプションを使用しないでください。また、酵母を混合するためにソースで上下に旋回するオプションを選択します。プレートを配置する場所とタイミングの指示に従い、ロボットが酵母をScマイナストリプトファンの長方形プレートに見つけることができます。斑点のあるアレイを袋に入れ、摂氏30度で寒天側を2〜3日間インキュベートします。Scからトリプトファンの長方形プレートを引いた384コロニーアレイを生成するには、ソースとして96寒天プレート、ターゲットとして384寒天プレート、および96の短いピンパッドを選択します。次に、1:4 配列の単一ソース・プログラムを選択します。このようにして、4つの96コロニープレートが1つの384コロニープレートに統合されます。異なるプレート間の汚染を避けるために、リサイクルまたは再訪オプションを使用しないでください。プレートを袋に入れ、斑点のある384コロニーアレイ寒天側を摂氏30度で2日間インキュベートします。Scからトリプトファンの長方形のプレートを引いた1536コロニーアレイを生成するには、ソースとして384寒天プレート、ターゲットとして1536寒天プレート、および384の短いピンパッドを選択します。次に、1:4アッセイ単一ソースプログラムを選択します。目標は、4倍を得るために4つのコロニーに各コロニーをコピーすることです。リサイクルと再訪のオプションは、コロニーごとに4回コピーする必要があります。ロボットの指示に従い、ロボットがプレートに酵母を見つけてから、発見された1536コロニーアレイ寒天側を30°Cで30°Cで30°Cでインキュベートします。Scからトリプトファンの長方形のプレートを引いた1536コロニーアレイを増幅するには、ソースとして1536寒天プレート、ターゲットとして1536寒天プレート、および1536短いピンパッドを選択します。3 ~ 4 個のコピーをレプリケートするには、[多を複製] プログラムを選択します。リサイクルと再訪のオプションを使用しますが、クロスコンタミネーションを避けるためにアレイの別のプレートに切り替えるときにパッドを投げ出します。ロボットがScからトリプトファンの長方形のプレートを引いた1536コロニーアレイを増幅することを可能にする。最後に、プレートを袋に入れ、斑点のある1536コロニーアレイ寒天側を摂氏30度で30日間インキュベートし、交配ステップに使用します。交配のためのDNAベイト株芝生を準備するには、ScマイナスウラシルとヒスチジンプレートにDNA酵母餌株を見つけ、摂氏30度で3日間成長させます。各プレートが12〜16種類の異なる株に収まるように、滅菌爪楊枝を使用して15センチメートルScマイナスウラシルとヒスチジンプレートに酵母をストリーク。1日30度でプレートをインキュベートします。翌日、各プレートが4つの異なる株に収まるように、滅菌爪楊枝を使用して15センチメートルScマイナスウラシルとヒスチジンプレートに酵母をストリーク。30°Cで1日プレートをインキュベートします。インキュベーションに続いて、無菌爪楊枝を使用して酵母を削り取り、寒天を削らないようにします。500マイクロリットルの無菌水で1.5ミリリットルのチューブに酵母を加えます。YAPDの長方形の板に10から15の無菌ガラスビーズおよび酵母懸濁液を加える。酵母がプレート全体に広がるように、すべての方向に1分間徹底的に振ります。すぐにプレートを反転し、ビーズが蓋に行くようにタップします。ビーズを取り外してリサイクルします。プレートを袋に入れ、寒天側を摂氏30度で1〜2日間インキュベートします。次に、交配ステップに進みます。酵母DNAベイトとTFアレイ株を交尾するには、TFアレイをロボットと一緒にYAPD長方形プレートに移します。ソースとターゲットとして1536寒天プレート、および1536短いピンパッドを選択します。[多回複製] プログラムを選択します。4つのソースプレートとリサイクルと再訪のオプションを選択します。各TFアレイプレートは、3〜4 YAPDプレートを転送するために使用することができます。交配に使用されるTFアレイプレートは2〜3日前でなければなりませんが、交配が非効率的である可能性があるため、それ以上はできません。DNA餌株の芝生を既にTFアレイを含むYAPDプレートに移す場合は、ソースとして1536寒天プレートを選択し、ターゲットと1536短いピンパッドを選択します。[多回複製] プログラムを選択します。同じ場所から酵母を取らないように半径約0.6ミリメートルのソースでランダムなオフセットを使用し、酵母株間の接触を容易にするためにターゲット上のミックスを選択します。DNA餌株を含む芝生をソースとして使用し、プレートを袋詰めして寒天側を摂氏30度で1日インキュベートする前に、斑点のあるTFアレイを含むYAPDプレートをターゲットとして使用します。二倍酵母の選択のために、ソースとターゲットとして1536寒天プレートを選択し、1536短いピンパッドを選択します。[レプリケート]プログラムを選択します。[ソースとターゲットでミックス]を選択します。ロボットがYAPDプレートからScマイナスウラシルとトリプトファンプレートに交尾酵母を移してから、プレートを袋詰めし、寒天側を摂氏30度で2〜3日間インキュベートします。次に、ソースとして1536寒天プレートとターゲットと1536短いピンパッドを選択します。[レプリケート]プログラムを選択します。ロボットを使用して、Scからウラシルとトリプトファンプレートから読み出し長方形の3-ATおよびX-gal含有プレートにディプロイド酵母を移します。プレートを袋に入れ、寒天側を摂氏30度で最大7日間インキュベートします。バックグラウンドレポーター活性の高いDNA餌株については、2日目、3日目、4日目に写真を撮ります。それ以外の場合は、4 日目と 7 日目に写真を撮ります。TFアレイプレートを室温に保ち、7日後に再びコピーして新しいスクリーニングを行います。強化された酵母ワンハイブリッドアッセイを用いて得ることができる結果の種類を例示するために、CCL15およびIL17F遺伝子のプロモーター領域を、1086個のヒトTFの配列に対してスクリーニングした。CCL15プロモーターは、非自己活性DNA餌の一例であり、そこでは、弱いものであっても、相互作用を容易に検出することができる。IL17Fプロモーターは、一部の相互作用を検出できる不均一なバックグラウンドレポーター活性を有する自己活性DNA餌の一例であり、いくつかのTFについては、レポーター活性がバックグラウンドよりも高いかどうかは不明である。強化された酵母ワンハイブリッドアッセイを行う際に発生する可能性のあるいくつかの問題があります。この場合、コロニーが小さすぎて、転送に失敗しました。典型的には、TFの約95%の捕食コロニーが正常な成長を示す。この例では、プレートの一部に酵母の増殖はない。この問題は、一般的に、1536ピンパッドがDNAベイト株芝生、TFアレイ、または交配プレート内の酵母と接触しなかった場合の交配ステップの障害に関連する。これら 2 つの例では、相互作用は検出されません。この問題は、レポーター遺伝子の意図しない不活性化突然変異、特にLacZ、または相互作用を隠す自己活性が高すぎるかに関連していることが多い。この場合、プレートは、細菌汚染にしばしば関連するランダムな青色の斑点を提示する。考慮すべき最も重要なことは、適切なプレートの準備です。すべてのコンポーネントが追加され、その後のすべての手順がこれに依存するので、寒天の高さが均一であることを確認します。ほとんどの試薬は危険ではありませんが、サンプルやプレートの汚染を避けるために常に手袋を着用することが重要です。DNA結合アッセイと同様に、レポーターアッセイ、転写因子のノックダウン、ノックアウトなどの機能アッセイを使用して同定された相互作用を検証し、その後に標的遺伝子の発現を測定することが重要です。この方法により、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子を調節する転写因子と、非コード性疾患関連変異体に対する代替結合を有する転写因子を同定することができた。

enhanced-yeast-one-hybrid-screens-to-identify-transcription-factor

Research

JoVE Journal

Genetics

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