Name: 壊死性腸炎新規ヒト上皮 Enteroid モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 学ぶヒトエンテロイド培養法とLPS誘導炎症モデル。壊死性腸炎の病態解明と治療薬スクリーニングに有用な新生児組織由来の三次元上皮オルガノイド系を確立する方法です。

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この作品は、糖尿病、消化器・腎臓病グラント (K08DK106450) C.J.H. にアメリカの小児外科協会からジェイ Grosfeld 賞の健康研究所の国立研究所によって支えられました。

施設内審査委員会の承認が得られた (IRB #2013 15152) アンとロバート H. Lurie こどもホスピタル オブ シカゴ、シカゴ、イリノイで腸切除術を受けた患者の組織サンプルのコレクションのため。すべてのプロトコルは、制度と国家のガイドラインおよび人類の福祉のための規則に準拠して行われました。書かれた情報に基づいた保護者の同意が求められ、すべてのケースでサンプル コレクションの前に得られます。
1. 試薬の準備
<ol><li>文化メディア ストック ソリューション全体の組織コレクションの準備: 1 L のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM)、110 mL の胎仔ウシ血清 (FBS) のペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%) の 11 mL1.1 ml フィルター滅菌インスリン (最終濃度 0.1%)4 ° C で原液を保存します。</li>
	<li>キレート バッファー #1 を準備: 文化、メディア (前述 1.1) 30 mL 0.5 M エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 600 μ L (最終濃度 10 mM)、300 μ L (終濃度 1%) ゲンタマイシンのアムホテリシン b (最終濃度 0.2%) 60 μ L。4 ° C で原液を保存します。</li>
	<li>キレート バッファー #2 の準備: 30 mL の培地 (1.1 で説明します) と、ゲンタマイシン (最終濃度 1%) の 0.5 M EDTA (最終濃度 5 mM)、300 μ l 300 μ Lアムホテリシン b (最終濃度 0.2%) 60 μ L。4 ° C で原液を保存します。</li>
	<li>人間の Minigut メディアの準備: 41.4 mL DMEM/F - 12、5 FBS (最後の 10%)、ペニシリン-ストレプトマイシン (最終濃度 1%)、L-グルタミン (最終濃度 1%)、ゲンタマイシン (最終濃度 1%)、アムホテリシン B (最終の 100 μ L の 500 μ L の 500 μ L の 500 μ L の濃度 0.2%)、1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane スルホン酸 (HEPES) 500 μ L (終濃度 10 mM) 500 μ L 100 x の N-2 を補足、50 x の 1 mL B-27 を補うビタミン A マイナス 50 mL の容量の。-20 ° C で原液を保存します。</li>
	<li>人間の Minigut メディア完了の準備: 10 mL ヒューマン メディア Minigut (で準備した 1.4)、100 μ g/mL Wnt3a の 10 μ L (終濃度 100 ng/mL)、100 μ g/mL 頭 (最終濃度 100 ng/mL) 1 mg/mL R Spondin の 10 μ L の 10 μ L (終濃度 1 μ g/mL)、500 μ G/ml 表皮成長因子 (EGF) (最終濃度 50 ng/mL)、1 の 10 μ L の 10 μ L M N-アセチルシステイン (最終濃度 1 mM)、10 μ L 500 μ m 10 mM Y-27632 (最終濃度 10 μ M)、10 μ L の A-83 (最終濃度 500 nM)、10 mM SB202190 (最後の 10 μ L濃度 10 μ M)、1 M ニコチンアミドの 100 μ L (終濃度 10 mM) と 100 μ M [ルー] 15 ガストリン 1 (最終濃度 10 nM) の 1 μ L。容量 10 mL。4 ° C で原液を保存します。 注:ソリューションは、48 時間以内に使用する必要があります。</li>
</ol>2. 地下室分離と全体の組織からめっき
<ol><li>
手術群のコレクションの時に、人間の小さい腸組織サンプルで冷たいダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) を配置します。便と血のクリアまで冷たい DPBS で供試体を洗います。地下室の分離のための準備ができるまで 4 ° C で試験片を RPMI 1640 媒体に格納します。 注:組織は、24 時間以上保存できません。<ol>
<li>試料を便と血を明確に確認してください。繊細な解剖はさみを使用すると、余分な脂肪や手術クリップ/いる針を取り等。供試体の重量を量る。 注:作品約 0.75 2.5 g を目指してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
試料を 0.5 cm に切るし、キレート バッファー #1 の 30 mL (1.2 の手順で準備) として配置します。
	<ol>
<li>4 ° C で 15 分間低速で振る</li>
		<li>100 μ m の細胞のストレーナーをティッシュをフィルター処理して破棄を通過。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(手順 1.3 の準備)、キレート バッファー #2 の 30 mL に組織を追加します。
	<ol>
<li>4 ° C で 15 分間低速で振る</li>
		<li>100 μ m セル ストレーナー ティッシュをフィルター処理して破棄を通過。</li>
	</ol>
</li>
	<li>基底膜マトリックス 2.8 の手順で使用するため氷の上の 500 の mL を解凍します。</li>
	<li>
10 mL を 50 mL の円錐管に冷たい DMEM に組織を追加し、10 の手によって積極的に振る s。
	<ol>
<li>100 μ m セル ストレーナー フィルター (ラベル #1) 流れを収集しています。チューブ #1 氷の上を保ちます。</li>
		<li>別の 50 mL の円錐管に冷たい DMEM の別の 10 mL に組織を追加し、10 の手によって積極的に振る s。</li>
		<li>100 μ m セル ストレーナー フィルター (ラベル #2) 流れを収集しています。</li>
		<li>追加で 2 回流れる (ラベルの付いたチューブ #1-4) と 4 つの円錐管までを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フィルター チューブ #1 溶液 100 μ m セル ストレーナーと転送を通過する流れを 15 mL コニカル チューブ (ラベル #1)。#2 - 4 を繰り返します。
	<ol>
<li>4 ° C で 15 分間 200 × gで遠心する 15 mL チューブ #1-4</li>
	</ol>
</li>
	<li>
層流フードのチューブ #1-4 から上澄みを除去し、破棄します。つまり、一部の上澄みを残していて、ペレットのすぐ上の組織のクラウドを中断することを避けてください。
	<ol>
<li>ゆっくりとピペッティングで混ぜて一緒にペレット #1-4 管の培養上清中の残り物。</li>
		<li>チューブ #1-4 から 1 つの単一の 2 mL の円錐管に混合物を転送します。</li>
		<li>4 ° C で 20 分 200 x gで円錐形の管を遠心分離します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
上澄みを除去し、再基底膜マトリックスを 500 μ l 添加の餌を中断します。 注:すべての回で氷の上基底膜マトリックスを維持し、すぐに次のステップの作業します。この製品は、室温で非常に迅速に重合します。<ol>
<li>24 ウェル プレートには井戸の中心に試料/地階膜マトリックス懸濁液 50 μ L を適用します。これはドーム型が表示されます。 注:チルド ピペット チップの使用は、重合を最小限に抑え、サスペンションのスムーズな転送に役立ちます。</li>
		<li>10 の総井戸を埋めるため 9 回を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 ° C で重合させる 30 分間 5% CO2インキュベーターで 24 ウェル プレートを配置します。</li>
	<li>人間 Minigut メディアいる完了手順 1.5 で準備) 500 μ L を各ウェルに追加します。2 日おきに置き換えます。</li>
	<li>新進は可視化、5 ~ 10 日後 enteroids を収集します。手順 4 と 5 についてはコレクションを参照してください。</li>
</ol>3. 実験 NEC の誘導
<ol><li>0 日目に人間 Minigut メディアいる完了手順 1.5 で準備) 各ウェル内の 500 μ L に 5 mg/mL のリポ多糖 (LPS) の 10 μ L を追加します。コレクションまで 2 日おきに置き換えます。</li>
</ol>4. パラフィン埋め込むことのための準備
<ol><li>
メディアを慎重に取り外します。
	<ol>
<li>1 mL の PBS を追加し、そっと上下しないように注意して、enteroids の溶解と基底膜マトリックスを溶解するピペットします。</li>
		<li>PBS/enteroid 混合物を遠心分離機 < 300 x gペレットし、PBS を削除する 5 分間。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 時間室温で修正する 4% パラホルムアルデヒドを追加します。</li>
	<li>
遠心分離機 < 300 x gペレット、し、PBS を削除する 5 分間。
	<ol>
<li>1 mL の PBS で軽く洗って、遠心分離機 < 300 x gペレット、し、PBS を削除する 5 分間。</li>
		<li>4.3.1 のステップを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
円錐管に必要な量を配置し、3 10 分の 65 ° C で乾燥風呂インキュベーターで液体になるまで地球温暖化ゲル (約 300 μ L) を処理するティッシュの十分な量を溶かします。
	<ol>
<li>ペレットにゲルを処理組織を加え、軽く混ぜます。</li>
		<li>観察小さなクローンのリングを配置します。</li>
		<li>ピペットの組織観察の上にマウントされているクローンのリングにゲルと enteroid の混合物を処理します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 h の 4 ° C で凝固するゲルと enteroid の混合物を処理組織を許可します。
	<ol>
<li>パラフィン包埋に備えて 70% エタノールに固化した混合物とクローンのリングが水没します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 RNA および蛋白質の抽出のための Enteroid コレクション
<ol><li>軽く各ウェルから人間 Minigut メディア完全削除します。</li>
	<li>
1 mL の PBS を追加し、そっと上下に基底膜マトリックスを溶解するピペットします。Enteroids を分離しないように注意します。
	<ol>
<li>滅菌 2 mL の円錐管に PBS/enteroid 混合物を配置します。</li>
		<li>遠心分離機 < 300 x gペレットへ 5 分。</li>
		<li>Enteroids を削除しないように注意して、PBS を慎重に取り外します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5.2 の一歩シリーズをさらに 2 回繰り返します。</li>
	<li>蛋白質や RNA の抽出の準備ができるまで-80 ° C で凍結します。</li>
	<li>老舗 qRT PCR および西部にしみが付くことのテクニックを使用して enteroids の遺伝子発現および蛋白質の分離を実行します。</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
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<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li>
<li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+%28NEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li>
<li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li>
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<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).</li>
<li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li>
<li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

Ex vivo ひと腸 enteroid モデルこの小説は、壊死性腸炎 (NEC) の腸粘膜バリアー障害の研究のための有用な方法として機能します。ここで紹介する enteroid 処理方法は、夫妻ミスティ良い、マイケル ・ Helmrath、ジェイソン ヴェルトハイムの10、11,12の前の仕事から合わせられました。
詳細全体を取り巻く組織の採取と地下室の分離のタイミングは、このプロトコルの重要なステップです。組織を手術切除の時にすぐに収集され、組織は研究室に到着するとすぐに地下室分離処理する必要があります。我々 はこのモデルのより小さい 3 ヶの患者から組織を選択しました。遅延処理は、全体組織の採取後 24 h 内で発生することが必要な場合。さらに、人体組織サンプルの品質は、地下室の分離の収量を大きく影響します。健康的な小腸基礎となる病理学と若い患者 (< 生後 2 か月) 最高の結果が得られる...

人間 enteroids、ex vivo 3次元培養システム人間の腸組織サンプルの腸陰窩から分離された幹細胞から生成されます。この画期的モデル マウス1小腸の陰窩に Lgr5 幹細胞の発見に続く 2007 のハンス Clevers らの先駆者だった。自分の仕事は元の確立のための基礎を築いた重要な遺伝的または生理学的な変更2継代できる複数のセル型の vivo 腸管上皮文化。この発見以来 enteroids は、通常の消化生理学や再生医療2ホスト病原体の相互作用、炎症性腸疾患などの腸疾患の病態生理を研究する新たなモデルとして使用されています。
使用例として enteroids の消化管病態生理学の研究のための生体モデル代替技術いくつか利点があります。過去数十年の動物モデルと不死化腸癌由来細胞株は、腸の生理3,4,5を勉強する使用されています。単一細胞培養は、それにより細胞のクロストークとタンパク質発現、シグナル伝達、病原体による疾患6セグメント特異性に欠けている細胞の種類通常の腸の粘膜上皮に存在の多様性を表していません。Enteroids の幹細胞は、上皮細胞など上皮細胞、パネート細胞、杯細胞、enteroendocrine 細胞より3主要なに分化します。彼らは極性を展示、上皮の輸送機能を遂行し、腸管特異性6できます。Enteroids は、ひと腸管上皮の種類の細胞を要約することができます、のでこの認識された癌細胞ベースのシステムの制限を克服するためが。時間をかけて細胞の誘導体、subcloned と進化蛋白発現および局在3の大きい多様性を展示します。それどころか、enteroids は重要な遺伝的または生理学的な変更2継代することができます。NEC のための多数の動物モデルが存在する種の間高い変数傷害および治療上の介在への応答可能性があります。これらの制限の結果として動物モデルから派生した治療は、時間の 90% を失敗する毒性または有効性3の違いによる人間の臨床試験でテストしたとき。複雑な消化管病態、したがってより多くのよりよい理解につながる Enteroids これらの欠陥を克服することが有望なの前臨床モデルとして成功し、コスト効果の高い治療技術革新。また、enteroid から生成される組織の時代は生物学的に重要な7最近の証拠があります。Enteroids は NEC の患者に生理学的な関連性を堅持、新生児の組織から生成されるので、これは我々 のモデルのための特に重要な詳細です。
ヒトの病気のモデルとして enteroids のユーティリティは展開し、重度と普及条件に治療法を見つけることを期待して続けます。壊死性腸炎 (NEC) は腸管壊死によって特徴付けられる新生児の壊滅的な腸疾患と腸の壁、敗血症、および死8の穿孔につながり。NEC の複雑で多因子性病態、原因、病気の正確なメカニズムはまだ解明されていない完全に;ただし、腸管透過性亢進は、明らかに病気プロセス8に関与しています。与え、NEC および潜在的な治療薬の研究は、特に子供たちは人間の倫理的挑戦的な人間の新生児のティッシュを使用して NEC の生物学的に関連する enteroid モデルを利用するため非常に重要です。これまで、enteroids では、NEC における限られた役割があります。このプロトコルでは、壊死性腸炎研究用生体モデル ex 小説として人間の腸組織サンプルから派生した enteroids の使用について説明します。

<table><tbody><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>A-83</td><td>R&D Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント マイナス ビタミン A</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>基底膜マトリックス (マトリゲル)</td><td>コーニング</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MT-16-405-CV</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'S モディファイド イーグル ミディアム (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコThermoFisher</td><td></td> <td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子 (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gemini Bio-Pro</td><td>100-125</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td></td><td>Sigma G5013-1G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-グルタミン)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ</td><td>I9278-5mL</td><td></td></tr><tr><td>[leu] 15-ガストリン 1</td><td>シグマ</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖 (LPS)</td><td>シグマ</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-2 サプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸 (HEPES)</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>シグマ</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td>シグマ</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>ノギン</td><td>R&D Systems INC</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-5X10PAK</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin</td><td>PEPROTECH INC</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュプロセッシングゲル(ヒストゲル)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R&Dシステムズ社</td><td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>シグマ</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

壊死性腸炎新規ヒト上皮 enteroid モデル

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

壊死性腸炎 (NEC) は、新生児の壊滅的な病気です。反発、障害、細胞死の増加は高められた腸の透磁率につながる人間の腸上皮の複数の病態生理学的変化によって特徴付けられます。NEC の多数の動物モデル、種の間高い変数傷害および治療上の介在への応答可能性があります。さらに、疾患の病態やヒト、特に子供たちに直接新規の治療薬を研究する倫理的挑戦です。したがって、人間のティッシュを使用して NEC の新たなモデルを開発する非常に望ましいです。Enteroids は、腸管上皮細胞由来三次元 organoids です。彼らは、複雑な生理学的な相互作用、細胞シグナリング、およびホスト病原体の防御の研究に最適です。本稿で述べるプロトコルその文化人間 enteroids 腸切除を受けた患者からの腸管幹細胞の隔離の後。ひと腸管上皮のさまざまなセルの種類のネイティブへの分化を促す成長因子を含んでいる媒体で陰窩細胞を培養しています。これらの細胞は、細胞外の基底膜を模倣、足場として機能する蛋白質の合成、コラーゲン ミックスで栽培されています。その結果、enteroids は、頂基底極性を開発します。メディアのリポ多糖 (LPS) の共同管理は、enteroids、組織学的、遺伝的につながるとタンパク質発現変化人間 NEC で見られるそれらに類似の炎症反応を引き起こします。人間のティッシュを使用して NEC の実験モデルとして、この病気の治療法を識別する薬と治療の人間の試験の前にテストのためのより正確なプラットフォームがあります。

めっき直後後新鮮単離腸陰窩は細長い棒として表示されます。時間以内に、円形の外観 (図 1、) で、enteroid になります。次の数日間、enteroids を図 1bに見られるように球を形成して開始します。新進は、5-10 日 (図 1c) の発生が、enteroid コレクションは、その時に発生します。
成長している enteroids も集中ルーメン、頂の境界線および基底のドメイン (図 2) を含む極性を展示いたします。Enteroids はまた、堅牢なアクチン細胞骨格 (<strong class="xf...

Enteroids 人間の病気の研究に新たなモデルとして浮上しています。プロトコルでは、新生児の組織から生成された enteroids のリポ多糖 (LPS) 治療を使用して人間の壊死性腸炎の enteroid モデルをシミュレートする方法について説明します。収集した enteroids は、人間の壊死性腸炎で見られるそれらと同類の炎症性変化を示しています。

壊死性腸炎新規ヒト上皮 Enteroid モデル

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

腸管は、腸上皮細胞に由来する3次元オルガノイドである。これらは、複雑な生理学的相互作用、細胞シグナル伝達、および宿主病原体防御の研究に理想的である。私たちのプロトコルは、腸切除を受けている患者から腸幹細胞を分離した後、ヒトエンタノイドを培養する方法を説明しています。私たちの培養培地におけるリポ多糖の共投与は、ヒト壊死性腸炎に見られるものと同様の組織学的、遺伝的、およびタンパク質発現変化をもたらす腸内の炎症反応を引き起こす。壊死性腸炎および潜在的な治療剤の研究は、ヒトの被験者、特に小児において倫理的に困難であることを考えると、この新しい、生物学的に関連するヒト新生児組織を用いた壊死性腸炎の腸内膜モデルを利用することが非常に望ましい。この技術の主な利点は、エンテロイドがヒト腸上皮の複数の細胞タイプを再現することができ、動物モデルおよび細胞ベースのシステムの認識された限界を克服することができるということです。手順のデモンストレーションを手伝うクリスティ・ブオンパネ、外科居住者、キャリー・ユアン、私たちの研究室の研究室の技術者です。手術室での採取時に、ヒトの小腸組織サンプルを冷たいDPBSに入れる。血液や便が透明になるまで、冷たいDPBSで検体を洗います。検体は、解読の準備ができるまで、摂氏4度でRPMI 1640培地に保管してください。続行する準備ができたら、標本が便と血液が透明であることをもう一度確認してください。繊細な解剖ハサミを使用して、余分な脂肪や外科用クリップやステープルを取り除きます。標本に重みを付け、約0.75〜2.5グラムの部分を目指します。次に、組織を0.5センチメートルに切り、30ミリリットルのキレートバッファー番号1を含むチューブに入れます。摂氏4度で15分低速で振ります。その後、100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して組織を濾過し、流れを通して廃棄する。30ミリリットルのキレートバッファー番号2を含むチューブに濾過した組織を加えます。摂氏4度で15分低速で振ります。100マイクロメートルのフィルターを通してティッシュをフィルターし、流れを通して捨てる。この後、氷上で500マイクロリットルの基質膜マトリックスを解凍し、後で使用します。50ミリリットル円錐形チューブに冷たいDMEMの10ミリリットルにいくつかの組織を追加し、10秒間手で精力的に振ります。100マイクロメートルの細胞のストレーナを通してこの懸濁液をフィルターし、流れを通して集める。このチューブを氷の上に置いておきなさい。別の50ミリリットルの円錐管に別の10ミリリットルの冷たいDMEMにいくつかの組織を追加し、10秒間手で精力的に振ります。100マイクロメートルの細胞のストレーナを通してこの懸濁液をフィルターし、流れを通して集める。ラベルが付いた1から4までの流れを含む4つの円錐形の管があるまで、このプロセスをさらに2回繰り返します。次いで、チューブ1の溶液を100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して濾過し、流れを15ミリリットルの円錐管に移す。チューブ2~4本に対してこのプロセスを繰り返します。15ミリリットルのチューブをGの200倍、摂氏4度で15分間遠心分離します。層流フード内で、各チューブから上清を取り除き、廃棄します。それは後ろにいくつかの上澄を残すことを意味する場合でも、ペレットの上に組織の雲を破壊しないように。各チューブにピペットを上下にゆっくりとしてペレットを残りの上清と混合する。各チューブから混合物を200倍Gで1つの2ミリリットル円錐形チューブと遠心分離機に移し、摂氏4度で20分間移動します。この後、上清を取り除き、解凍前の基底膜マトリックスの500マイクロリットルでペレットを再懸濁します。冷やしたピペットチップを使用して、この懸濁液の50マイクロリットルを24ウェルプレートのウェルの中央に塗布します。このサンプルはドーム型に見えるはずです。この申請プロセスを9回繰り返して、合計10の井戸を埋めます。24ウェルプレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターに30分間移し、重合を可能にします。その後、各井戸に完了した人間のミニグットメディアの500マイクロリットルを追加します。同じ条件でインキュベートを続け、2日ごとにこの培地を交換してください。まず、ゼロ日にプレートの各ウェルに完了する人間のミニグットメディアの500マイクロリットルに1ミリリットル当たり5ミリグラムの濃度でLPSの10マイクロリットルを追加します。摂氏37度で5%の二酸化炭素でインキュベートを続け、回収まで2日ごとに補充された培地を交換してください。パラフィン埋め込みの準備をするには、まず培地をそっと取り出し、PBSを1ミリリットル加え、ピペットを上下に軽くピペットして基部膜マトリックスを溶解させ、エンタフィドを溶かしないように注意します。遠心分離機をGの300倍未満で5分間ペレットしてから、PBSを取り除いた。4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で固定するために1時間チューブを脇に置きます。遠心分離機はGの300倍未満の速度で5分間ペレットし、パラホルムアルデヒドを取り除いた。PBSと遠心分離機を1ミリリットルで1ミリリットルG未満の速度で5分間やさしく洗います。その後、PBSを削除します。PBSでこの洗浄プロセスを1回繰り返します。所望の量の組織処理ゲルを円錐形のチューブに入れ、液体になるまで摂氏65度の乾燥浴インキュベーターで3〜10分間温めます。その後、溶かした組織加工ゲルをペレットに加え、軽く混ぜます。小さなクローニングリングをカバースリップに入れる。組織処理ゲルをピペットし、カバースリップに取り付けられたクローニングリングにエンタロイド混合物を入れます。組織加工ゲルと腸骨混合物を摂氏4度で1時間固めます。次いで、凝固混合物を含むクローニングリングを70%エタノールに沈め、パラフィン埋め込みの準備を行う。めっき直後に、孤立したばかりの腸内窩は細長い棒として現れる。数時間のうちに、エンタイドは丸い外観になります。次の数日間、エンテロイドは球体の形成を開始します。芽出しは、enteroidコレクションが発生する場合、5〜10日の間に発生する必要があります。成長するエンタイドはまた、中央の内腔、尖路境界、および底面ドメインを含む極性を示す。エンタロイドはまた、堅牢なアクチン細胞骨格によって表される構造的完全性を示す。培養で数日後、LBS治療腸内は、より多くのアポトーシスを経験し、対照群よりも低い収率を有する。NECのマウスモデルにおけるヒトNECに見られるように、コントロールと比較してLPS処理エンタノイドに受容体4のような通行料の発現が増加していることが判明した。また、遺伝子発現およびタンパク質の分離を行うことができる、よく確立されたqRT-PCRおよびウェスタンブロッティング技術を用いてRNAおよびタンパク質抽出のためにエンタノイドを収集することもできる。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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ここでは、単離、同定、およびマウス胸腺上皮細胞（のTEC）を精製するための効率的な方法を記載する。プロトコルは、通常のT細胞の発生、胸腺機能不全、およびT細胞再構成のための胸腺機能の研究のために利用することができる。...

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