Name: プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶ単一分子レベルでのプロテイン標識均一性の定量化法。蛍光標識と単一分子計数技術を用いて、従来のバルク測定では捉えられないタンパク質集団の不均一性を直接観察し、将来の診断法開発への応用可能性を示します。

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著者らは、実験の支援やアドバイスを大野雅恵と西村和哉をありがとうございます。この作品は、さきがけ (JPMJPR15F7)、日本科学技術振興機構、若い科学者 (A) (24687022)、挑戦的萌芽研究 (26650055)、革新的な領域 (23115005) 会科学研究費補助金に支えられ医療・創薬研究の推進学と武田科学財団持田記念財団からの補助金によって。S. l. は、理化学研究所国際プログラムに関連付ける (IPA) プログラムからのサポートを認めています。

1. セル準備
<ol><li>37 ° C で 10 cm 皿に HeLa 細胞を養う 5% 未満ダルベッコの CO2のイーグル培地 10% 牛胎児血清を含む、変更されました。</li>
	<li>70% の confluency、次の ATCC 手順17に達したら、指数関数的に成長のセルを収集します。<ol>
<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (pH 7.4) x 1 の 5 mL の細胞をすすいでください。PBS を削除します。</li>
		<li>0.1% トリプシン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 1 つの mL を追加します。37 ° C で 5 分間加温します。</li>
		<li>顕微鏡による細胞解離の進行を監視します。</li>
		<li>細胞は円形になるし、皿から切断されて、成長培地 4 mL を追加し、ピペッティングにより細胞の集積を破る。</li>
		<li>細胞カウンターを使用してセルの数をカウントします。</li>
		<li>150 x gで 10 分間遠心管中で遠心分離機します。メディアを削除し、5 ml の 1x PBS (pH 7.4) の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
		<li>1.2.6 のステップを繰り返します。1 × PBS (pH 7.4) 106セル/mL ステップ 1.2.5 でカウント数を使用しての最終濃度に細胞を再懸濁します。 注: 細胞懸濁液は、数ヶ月間、避けようと-80 ° C で保存されますを使用できます。フリーズ/フリーズ解除の繰り返しは避けてください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞の換散および蛍光標識
<ol><li>10 mL の溶解バッファーを作る (1%、1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 0.1 M ホウ酸トゥイーン 20)。12 2 M NaOH を使用して pH を調整します。 注意: 濃水酸化ナトリウムは腐食性です。このソリューションを準備するときは、適切な手袋、メガネを着用します。 注: 最大 1 週間室温で溶解バッファーを格納できます。</li>
	<li>溶解バッファーを 1 M ジチオトレイトール (DTT) の 1 μ l と 4 のミックス 100 μ L の 50 %3 [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio μ L]-1-propanesulfonate (チャップス)。</li>
	<li>ステップ 2.2 から混合 lysing バッファーを持つ細胞培養 (約 1,000 セル) のミックス 1 μ L。泡を避けるためにゆっくりとピペッティングによるソリューションを均質化します。穏やかな攪拌を 5 分間室温で暗闇の中で孵化させなさい。ゆっくりとピペッティングによるソリューションを再均質化します。</li>
	<li>2 μ g/mL 色素 Cy3 NHS エステルの 1 μ L を追加します。泡を避けるためにゆっくりとピペッティングによるソリューションを均質化します。穏やかな攪拌と室温で暗闇の中で 5 分間インキュベートします。 注意: このバッファーの高い pH は高い反応性につながるタンパク質のリジン残基の中和を引き起こします。</li>
	<li>2 μ g/mL 色素 Cy3 NHS エステルの 1 μ L 添加を繰り返します。泡を避けるためにゆっくりとピペッティングによるソリューションを均質化します。穏やかな攪拌と室温で暗闇の中で 10 分間インキュベートします。 注: これは、Cy3 NHS エステル色素の一部は加水分解、反応バッファーの高 pH が非アクティブに NHS エステル色素添加がラベル付けの効率を増やすことができます繰り返し。</li>
	<li>4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) 0.8 M の 100 μ L の追加によって ph 7.2 調整-NaOH pH 7.2 反応を抑制します。泡を避けるためにゆっくりとピペッティングによるソリューションを均質化します。</li>
	<li>19 mg/mL ビオチン-(ポリエチレング リコール (PEG))2の 20 μ L を追加-アミン及び 20 mg/mL 1 の 5 μ L-エチル - 3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC)。泡を避けるためにゆっくりとピペッティングによるソリューションを均質化します。穏やかな攪拌と室温で暗闇の中で 1 時間インキュベートします。 メモ: このビオチン化ステップ固定密度と蛋白質種の顕微鏡観察でタンパク質分子を修正する必要が。</li>
	<li>未反応ラベリング試薬を削除し、限外濾過カラムを用いた 10 kDa カットオフ、製造元の指示に従ってサンプルを集中します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。サンプルは数週の間-80 ° C で保存できます。</li>
</ol>3. プロテオームの分離・回収
<ol><li>SDS のサンプルバッファー (200 mM トリス塩酸 pH 6.8, 4 %sds、4% のグリセロールと 0.4% ブロモフェノール ブルー) x 4 を追加します。 注: 染料の損傷を避けるためには、蛋白質のサンプルは標準の SDS-PAGE で加熱しないと室温で保管する必要があります。</li>
	<li>蛋白質のサンプルの 20% アクリルアミド ゲルを使用して分子ラダー標準 SDS ページを実行します。サンプルの移行移行までの定電圧 (160 V) でゲルでフロントだけゲルで終了します。</li>
	<li>タンパク質バンド (図 3) の場所を識別するためにゲルをイメージします。</li>
	<li>バンドの場所に基づいて、鋭い刃を使用して興味の蛋白を含むゲル部分をカットします。16、23、55、および 120 kDa のピーク、19-25、25-32、32-42、42-54、54-69、69-97、97-136、136-226 kDa の領域は、図 3に示すため。</li>
	<li>製造元の指示に従って、6-8 kDa の孔径の electroelution でダイアライザーを使用して蛋白質を抽出します。 注: 抽出されたサンプルは-80 ° C で数週間保存できます。</li>
</ol>4. 顕微鏡 coverslip の準備
<ol><li>各サンプルのアビジン バッファー (5 mM HEPES NaOH pH 7.2, 10 ng/mL アビジンと 2 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA)) の 200 μ L を準備します。</li>
	<li>22 × 22 mm と 0.15 mm 厚の coverslips を準備します。空気をきれいにし、表面をアクティブにする 1 分クリーナー プラズマを用いたプラズマ coverslips を公開します。</li>
	<li>アビジン バッファー 1,000 rpm で 30 秒続く、500 rpm で 5 秒間スピン塗布装置を使用してスピン コーティング 200 μ l アビジンと coverslips のコート。Coverslips 乾燥させる、室温で 15 分間を、インキュベートします。</li>
	<li>蛋白質のサンプルの coverslips を準備します。<ol>
<li>5 mM HEPES NaOH ph 7.2 (3.5) から蛋白質のサンプル 100 倍に希釈します。</li>
		<li>(ステップ 4.3) からアビジン coverslip の中心に表面の希釈サンプルの場所 100 μ L。</li>
		<li>暗闇のなか 15 分間室温でインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>肯定的な制御を準備します。<ol>
<li>場所 100 μ L 10 ng/mL の精製 (ステップ 4.3) から 5 mM HEPES NaOH pH 7.2 アビディンのセンターでコーティングされた coverslip で蛍光ビオチンです。</li>
		<li>暗闇のなか 15 分間室温でインキュベートします。 注意: この肯定的な制御 coverslip 提供アビジンの密度バインディング スポット、LO を計算するものです。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ネガティブ コントロールを準備します。<ol>
<li>スピンコート、プラズマ洗浄を 5 mM HEPES NaOH と 2 mg/mL BSA (アビジン) なしの 200 μ l coverslip。</li>
		<li>乾燥するために室温で 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>5 mM HEPES NaOH ph 7.2 10 ng/mL 精製蛍光ビオチン 100 μ L を追加します。</li>
		<li>暗闇のなか 15 分間室温でインキュベートします。 注: このネガティブ コントロール coverslip 蛍光ビオチンにアビジンなし coverslip の非特異的結合の量を提供します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピペットの先端とカバーガラスの真ん中をタッチしないようにカバーガラスの端で 200 μ L の純水で各 coverslip をすすいでください。この洗浄を 3 回繰り返します。 注: 上、水を吸引後水必要がありますすぐに戻され完全に乾くことを防ぐために coverslip。</li>
	<li>空気プラズマ coverslips ステップ 4.2 のように同じ数を公開します。</li>
	<li>乾燥を防ぐためのステップ 4.7 からサンプル バインド coverslip のきれいにされた coverslip を配置します。</li>
</ol>5. 単一分子蛍光顕微鏡による観察
<ol><li>広視野またはエバネッ セント フィールド蛍光顕微鏡を起動します。 注意: 直接または散乱レーザー放射は目が発生したり、皮膚障害。適切な保護メガネを着用し、レーザー光路を保護します。 注: 顕微鏡のセットアップ私たちの以前の文書16を参照してください。簡単に言えば、ハイパワー 488 nm レーザー励起、高開口数の対物レンズと高感度カメラ搭載ワイド フィールドまたはエバネッ セント フィールド蛍光顕微鏡は、この測定に使用できます。さらに、自動測定、コンピューター制御 XY 並進サンプル ステージ、レーザー励起の機械的なシャッター、オート フォーカスのシステムをインストールする推奨。</li>
	<li>顕微鏡、coverslip を設定し、フォーカスを見つけます。</li>
	<li>少なくとも 100 のイメージを取得するタイル スキャンを実行します。 注: レーザー照射は、退色を最小限に抑えるため、カメラで画像を記録するときだけサンプルにさらされる機械式シャッターの制御する必要があります。多くのサンプルがある場合自動測定顕微鏡デバイスを制御するコンピュータ プログラムを使用をお勧めします。60 倍対物レンズを使用する場合、各画像は通常 100-500 単一分子スポットを含まれます。</li>
</ol>6. 画像解析と情報抽出
<ol><li>イメージにレーザー照射パターンのムラがある場合は、イメージの18はそれを修正する処理を実行します。<ol>
<li>設定ステップ 5.3 と同じカメラを使用して均一に広がり色素で構成される coverslip のサンプルを測定することにより、参照イメージを取得します。</li>
		<li>オフセット イメージを取得するには、同じカメラ設定を使用していないレーザー励起による測定します。</li>
		<li>オフセット イメージの値を持つすべてのサンプル画像とその参照画像の各ピクセル値を減算します。</li>
		<li>控除参照イメージの値で減算サンプル画像の画素の値を分割します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>正しく取得した画像を収集し、画像の背景を削除します。<ol>
<li>手動で大きな蛍光凝集体を含む画像を削除します。</li>
		<li>画像の背景を削除するには、ローリング ボール法19 ImageJ20を使用して 50 ピクセルの球の半径を適用します。</li>
		<li>ImageJ を用いた画像のぼやけを減算することによって画像をシャープ (シャープ イメージ関数)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>検索して画像の単一分子スポットを分析します。<ol>
<li>円しきい値アルゴリズム21 ImageJ を用いた単一分子のスポットを識別します。</li>
		<li>スポット ImageJ (ROI マネージャー) を使用して蛋白質の集計を除外するよりも 20 ピクセル カメラやスポットの暗騒音を除外するよりも小さい 2 つのピクセルをフィルター処理します。</li>
		<li>各画像のスポットの数をカウントします。修正された画像 (6.1.4 ステップ)、分析照明を使用して合計すべてのスポットのピクセル内強度 ImageJ を用いたします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>次の数式を使用してラベリング占有 (LO) を計算します。 LO = (サンプル内のカウント数/肯定的な制御のカウント数) x 100</li>
	<li>単一のタンパク質分子 (n̄色素) にバインドされている蛍光色素の数の平均値を計算します。<ol>
<li>すべてのスポットの強度のヒストグラムを分析します。 メモ: ヒストグラムは通常いくつかのピークを持って、すべてのピークはタンパク質と結合する色素分子の個数が異なるを表します。まず、ヒストグラムの 2 番目と 3 番目のピークがそれぞれ 1、2、3 の分子に対応します。</li>
		<li>ヒストグラムから平均強度を計算します。またガウスのフィットを適用することによって最初のピークのピーク強度を計算します。</li>
		<li>N̄色素を計算する、ピーク強度と平均強度を割る。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者宣言次競合金融利益のため: 理研が SL の共同発明者として名前を保とこれらの結果を特許出願を提出します。

本稿では、SDS-PAGE (ステップ 3) を分離した後の分類された蛋白質種のセルのラベルの均質性を定量化するためのプロトコルについて説明します。分離法は、分離と23特別な装置を必要としながら高解像度の細胞蛋白質の分別を許可する液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動などの他の方法で置き換えることが。現在のプロトコルの NHS エステルを使用してラベリング法は、たとえばマレイミド エステルや抗体を使用して他の方法で置き換えることができます。
等質性分析を分類するための要件は、カップリング効率解析で想定されている簡単なランダムなプロセスから逸脱量ラベルに依存します。私たちの最近の研究16は、pH や洗剤などの反応条件によってランダムなプロセスから逸脱する蛋白質の NHS エステル分類を示されます。いくつかの条件がタンパク質に染料の協同的結合または不完全な可溶化や色素のため低親和性のための非反応性タンパク質の分画の存在による不均質を誘発を見ました。対照的に、その他の条件は、色素タンパク...

セルで表されるタンパク質分子の全体セットを定量化することを目的としたプロテオーム解析は、現在の生物学的および薬効がある研究の貴重なアプローチです。この分析は、よくタンパク質イオン1,2,3を介して生成されたスペクトルに基づく蛋白質種を識別する質量に依存します。プロテオーム解析の方法として、ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) を含む電気泳動、キャピラリー電気泳動、二次元 (2 D) ゲルの電気泳動。このメソッドは、非固有電気泳動分離と検出および各蛋白質種の定量化分析の細胞のすべてのタンパク質分子の蛍光標識に依存します。必要な非特異的タンパク質ラベリングを実現、1 つの戦略はブルーと可視ルビー4,5,6 などの静電場と疎水性相互作用によるタンパク質に結合することができます蛍光染料を使用するには.代替戦略 N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) エステルまたはマレイミド、第一級アミン、チオールなど一般的な残基をタンパク質に結合することができます共有、それぞれ7,を含む染料で共有結合性ラベリングを使用することです。8。
一方、蛍光検出の感度は、低豊富なタンパク質と細胞の小さな数字の分析に最適です。単一分子蛍光イメージングは個々 の蛍光染料と in vitro 試験および in vivo9,10、11,12、分類された蛋白質の検出を可能にする最も敏感な方法の一つです。 13,14,15。このイメージング法の電気泳動を用いたプロテオーム解析への応用は、個々 の蛍光標識したタンパク質をカウントすることにより高感度・定量的アッセイを有効にする予定です。ただし、不明のままかどうか蛍光染料と分類は十分なすべての蛋白質分子の間で、種のタンパク質 (図 1) は、この均質性の影響について。単純なバルク溶液測定を使用して、'結合効率'8または 『 効率をラベリング 』 と呼ばれるタンパク質に蛍光染料のモル比を取得できますが、このプロパティ間ラベルの均質性に関する情報は提供しません蛋白質分子。
ここでは、セル (図 2)16のすべての蛋白質種のラベリングの均質性を調査するための試金のためのプロトコルについて述べる。この試金の 2 つの手順では、蛋白質の浄化およびイメージング。最初のステップで、細胞のすべてのタンパク質を蛍光に分類し、ビオチン化、個別に電気泳動を使用して得られる electroelution が続きます。2 番目の手順では、単一分子イメージングに基づく抽出サンプル中の個々 のタンパク質分子の蛍光特性が評価されます。このデータからタンパク質の割合が少なくとも 1 つ付いたようカウント分析の重要なパラメーターを染める、これラベリング占有 (LO)16と呼んで、蛍光染料の平均数は単一のタンパク質分子にバインド (n̄色素)、特徴付けることができます。プロトコルでは、NHS エステル系シアニン 3 (Cy3) 染料と HeLa 細胞のプロテオームの分類のための最適化されたプロシージャは、例として提示し、希望する研究の目標によると他のラベルの手順で変更できます。

<table><tbody><tr><td>22x22x0.15 mm カバーガラス</td><td>VWR</td><td>470019-004</td><td></td></tr><tr><td>488 nm アルゴン レーザー</td><td>Coherent</td><td>Innova 70C</td><td></td></tr><tr><td>488 nm ダイクロイック ミラー</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03</td><td></td></tr><tr><td>488 nm 発光フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF02-520/28</td><td></td></tr><tr><td>560 nm ダイクロイック フィルター</td><td>Semrock</td><td>Di02-R561</td><td></td></tr><tr><td>560 nm 発光フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF02-617/73</td><td></td></tr><tr><td>560 nm ファイバーレーザー</td><td>MBP Communications</td><td>F-04306-2</td><td></td></tr><tr><td>60x 油浸レンズ</td><td>Olympus</td><td>PLAPON 60x</td><td></td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Nacalai-tesque</td><td>03553-64</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン-PEG-アミン</td><td>Thermo Scientific</td><td>21346</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 Alexa Fluor 488</td><td>Nanocs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸塩</td><td>Nacalai-tesque</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ-Aldrich</td><td>A9547</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>同人堂</td><td>C008-10</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 NHSエステル染料</td><td>GEヘルスケア</td><td>PA13101</td><td></td></tr><tr><td>透析器&nbsp; - Dチューブ、6-8 kDa</td>メル<td>クMillipore</td><td>71507-M</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>シグマ-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ナカライテスク</td><td>14112-94</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>ナカライテスク</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EMCCDカメラ</td><td>Andor</td><td>IiXon 897</td><td></td></tr><tr><td>エピ蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>ゲルビューア</td><td>GEヘルスケア</td><td>ImageQuant LAS 4000</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン、ストレプトマイシン、アンホテレシンミックス</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ディーナー 電子</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>和光</td><td>NC0792960</td><td></td></tr><tr><td>サイズ 浄化カラム 10K</td><td>メルク ミリポア</td><td>UFC5010</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

細胞のプロテオームは細胞内蛋白質のすべての種が非具体的蛍光染料と分類され、次の彼らの分離器によって斑点を付けられる電気泳動法の試金を使用して頻繁に特徴付けられます。単一分子蛍光イメージングは、個々 の蛍光分子を可視化するための能力を超高感度タンパク質検出を提供できます。ただし、この強力なイメージング法の電気泳動の試金への応用はプロテオームの間でそれぞれの蛋白質種の蛍光標識の均一性を特徴付ける方法の欠乏によって妨げられます。ここでは、単一分子蛍光イメージング法に基づくプロテオームのラベリングの均質性を評価する方法を開発しました。HeLa 細胞サンプル、我々 は '占有ラベル' と呼ばれる少なくとも 1 つの色素の付いたタンパク質の割合を使用して私たちの測定 (LO)、決定された範囲に 50% から 90%、サポートする単一分子イメージングの応用の可能性が高いから高感度・高精度のプロテオーム解析。

図 4は、正と負のコントロールと同様に、HeLa 細胞の lysate からの蛋白質の分子量の異なる分数の raw 画像データを表します。蛋白質のサンプルとポジティブの両方は、画像ごとの 100-500 の展示スポットを制御、ネガティブ コントロールはどれもまたは coverslip の表面に十分に染料の非特異的結合が阻害するようにプロトコルを示すいくつかのスポットを表示します。蛋白質のサンプルと肯定的な制御のためのスポット強度ヒストグラムは、それぞれタンパク質のアビジン四量体構造22アミンへの染料の確率のバインディングを表す複数のピークを紹介します。すべてのスポットを示した連続レーザー励起、(図 5 a, B) の単一分子レベルでの観察を強調表示点滅と段階的フォトブリーチを行なった。
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ここでは、単一分子レベルの複雑な蛋白質のサンプルのそれぞれのタンパク質種のラベリングの均質性を評価するためのプロトコルを提案する.

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

この方法は、液体サンプル中の定量タンパク質量を、カウント用の単一分子プロセスで較正する方法を示す。具体的には、タンパク質集団が各分子レベルで蛍光標識できる方法を示すことができる。これまでの方法では、蛍光分子とタンパク質分子のモル比を分析するためにバルク測定を行っていましたが、タンパク質集団が実際にどのように標識されているかを明らかにすることはできません。我々の方法は、単一分子レベルで直接それを行うことができます。我々の方法は、超高感度かつ高度な分子濃度アッセイに拡張することができ、将来の診断方法につながり、検体中の病原性分子の効率的な発見を可能にする。我々の方法は、蛍光抗体を用いた単一タンパク質種分析、および電気泳動またはクロマトグラフィーによって分離されたすべてのタンパク質に対する非特異的標識を用いた複数種の分析に適用することができる。この技術の最も重要なポイントは、データの再現性を得るです。複数のサンプルを測定する場合は、できるだけ同じ実験条件を維持することをお勧めします。この手法の視覚的なデモンストレーションは、各実験ステップを安定して再現可能にする方法を提供します。また、顕微鏡カバーリップのスピンコーティングや洗浄など、生化学プロトコルの珍しいステップも示します。この手順を開始するには、テキスト プロトコルで説明されているように、ライジング バッファーと 1%Tween-20 を準備します。水酸化ナトリウムを使用して、pHを12に調整します。1マイクロリットルのモルDDTと50%CHAPSの4マイクロリットルを1マイクロリットルと100マイクロリットルのライジングバッファーを混合します。調製した細胞培養液の1マイクロリットルを加え、気泡を避けるためにゆっくりとピペット処理することによって溶液を均質化する。穏やかな攪拌で5分間室温で暗闇の中でインキュベート。次に、溶液をゆっくり上下にピペット化して再均質化する。Cy3 NHSエステル染料のマイクログラムを1マイクログラム追加し、気泡を避けるためにピペットを遅くすることによって溶液を均質化します。穏やかな攪拌で10分間室温で暗闇の中でインキュベート。同じ量の染料を加え、サンプルを1回インキュベートして、このプロセスを繰り返します。0.8モルHEPES-水酸化ナトリウムの100マイクロリットルを加え、溶液のpHを7.2に調整し、反応を焼き付けます。溶液を均質化するためにゆっくりとピペットを上下に。次に、20マイクロリットルのビオチン-2アミンと5マイクロリットルのEDCを加えます。ゆっくりと上下にピペットを使用して溶液を均質化します。穏やかな攪拌で1時間室温で暗闇の中でインキュベート。この後、10キロダルトンカットオフの限外濾過カラムを使用して、未反応の標識試薬を除去し、サンプルを濃縮します。タンパク質サンプルと分子ラダーに対して標準SDS-PAGEを実行した後、ゲルを画像化してタンパク質バンドの位置を特定します。鋭利な刃を使用して、バンドの位置に基づいて目的のタンパク質画分を含むゲル部分を切り取ります。まず、22ミリメートル×22ミリメートルで、厚さ0.15ミリメートルのカバーリップを設定します。プラズマクリーナーを使用して、カバースリップを空気プラズマに1分間露出させ、表面をきれいにして活性化させます。次に、スピンコーターを使用して、200マイクロリットルのアバディンバッファーを500RPMで5秒間スピンコートし、続いて1000RPMで30秒を続けます。室温で15分間カバーリップをインキュベートし、空気を乾燥させます。タンパク質サンプルのカバーリップを調製するには、希釈したタンパク質サンプルを使用します。希釈したサンプルの100マイクロリットルを、アバディンコーティングされたカバーリップの中央に置きます。室温で暗闇の中で15分間インキュベートします。陽性対照を調製するために、精製蛍光ビオチン100マイクロリットルを、アバディンコーティングカバースリップの中央にpH 7.2の5マイクロモルHEPES-水酸化ナトリウムに入れる。室温で暗闇の中で15分間インキュベートします。負のコントロールを調製するために、スピンコートプラズマは、5つのHEPES-水酸化ナトリウムを200マイクロリットル、BSAの1ミリリットルあたり2ミリグラムのアバディンを使用せずにカバーリップを行った。pH 7.2で5マイクロモルHEPES-水酸化ナトリウムに100マイクロリットルを精製蛍光ビオチンを加えます。暗闇の中で室温で15分間インキュベートします。この後、各カバースリップを200マイクロリットルの蒸留水でリンスし、ピペットチップでカバースリップの真ん中に触れないようにします。この洗浄を3回繰り返します。その後、同数の新しいカバーリップを空気プラズマに1分間露出させます。乾燥を避けるために、各サンプルバウンドカバースリップの上にクリーニングカバースリップを置きます。広視野またはエバネッセントフィールド蛍光顕微鏡を起動します。顕微鏡にカバースリップをセットし、焦点を見つけます。次に、タイルスキャンを実行して、少なくとも100個の画像を取得します。本研究では、細胞内の標識タンパク質種ごとに標識均質性をSDS-PAGEで分離した後に定量化した。HeLa細胞ライセートのタンパク質の異なる分子量画分、ならびに陽性および陰性の対照の生画像データがここに見られる。タンパク質サンプルと陽性対照の両方が画像あたり100〜500のスポットの間を示すが、陰性対照は非常に少数からなしを示す。これは、このプロセスがカバースリップ表面への染料の非特異的結合を十分に阻害することを示す。タンパク質サンプルおよび陽性対照のスポット強度ヒストグラムは、タンパク質およびアバジン四量体構造における一次アミンへの色素の確率的結合をそれぞれ表す複数のピークを提示する。すべてのスポットは、連続的なレーザー励起で点滅と段階的な光漂白を示し、単一分子レベルでの観察を強調した。次に、ラベリング占有率(LO)は、陽性対照におけるすべてのタンパク質サンプルのスポット数の比率から計算されます。HeLa細胞のライセートサンプルから測定したLOは、分子量の小さい分率では50%から、分子量が高い分率では90%の範囲です。分離せずに全体のプロテオームサンプルのLOは72%と見られる試薬を使用し、特にカバーリップの調製中に、任意のほこりを避けるために重要です。この手順に従って、一定の体積での単一分子計数分析を行い、各タンパク質の濃度を定量化することができます。例えば、任意の生製品、またはゲルおよび毛細管電気泳動産物に対する分析を行うことができる。この技術は、分子医学、有機化学、およびオミックス分析に単一分子蛍光イメージングを利用するための道を開きます。集中力と数字の間の概念をつなぎます。水酸化ナトリウムは腐食性であり、それを取り扱う際には適切な保護を着用する必要があります。また、高出力レーザー放射は目の損傷を引き起こす可能性があるため、保護ゴーグルが着用される場合があります。

proteome-wide-quantification-labeling-homogeneity-at-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能である...

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。...

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

血漿中のプロテオミクスとグライコミクスの精製、およびLC-MS/MS定量を組み合わせたハイスループットプロトコルが開発されました。N-結合型グリコシル化モチーフの脱アミド化解析は、脱グリコシル化部位に特異的でした。糖鎖ヒドラジドタグ法による標識では、フィルターを用いたN型糖鎖分離と個別性標準化を組み合わせることで、N型糖鎖の正確な定量が達成されました。...

定量的グライコミクスおよびプロテオミクス複合精製戦略

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス...

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

本稿では、蛍光標識 DNA プローブ、エシェリヒア属大腸菌の in situハイブリダイゼーション (smFISH) 実験単一分子蛍光用と個々 のメッセンジャー RNA (mRNA) の成績証明書を表示する方法について説明します。smFISH は、同時検出、ローカリゼーション、および固定の個々 の細胞における mRNA...

単一分子蛍光In Situハイブリダイゼーション実験のため個々 の大腸菌細胞の転写物を自動ラベリング手法

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

タンパク質抽出、定量、沈殿、消化、標識、プロテオミクス施設への提出、データ分析の各ステップの詳細情報を含む最適化されたタンデム質量タグ(TMT)標識プロトコルを提示します。...

プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

記載されたプロトコルは、ラベルベースとラベルフリー定量の2つのアプローチを用いて、組織サンプルの最適化された定量プロテオミクス分析を提供します。ラベルベースのアプローチは、より正確なタンパク質定量の利点を有する一方で、ラベルフリーアプローチはより費用対効果が高く、コホートの何百ものサンプルを分析するために使用されます。...

組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー

ここでは、質量分析ベースのプロテオミクスによる感染時の宿主と病原体の相互作用をプロファイルするプロトコルを提示する。このプロトコルは、標識のない定量を使用して、1回の実験で、宿主(例えばマクロファージ)と病原体(例えば...

発見駆動型宿主間相互作用のためのラベルフリー定量プロテオミクスワークフロー

ここでは、さまざまな細胞タイプの細胞表面プロテオームの特性評価のためのプロテオミクスワークフローについて説明します。このワークフローには、細胞表面タンパク質の濃縮、その後のサンプル調製、LC-MS/MSプラットフォームを使用した分析、および専用ソフトウェアによるデータ解析が含まれます。...

細胞表面プロテオームのラベルフリー定量のための「Cell Surface Capture」ワークフロー

学ぶ単一分子レベルでのプロテイン標識均一性の定量化法。蛍光標識と単一分子計数技術を用いて、従来のバルク測定では捉えられないタンパク質集団の不均一性を直接観察し、将来の診断法開発への応用可能性を示します。

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

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