中枢神経系への鼻腔内siRNA送達中におけるマウスの配置のための位置決め装置
2019年8月15日
ここでは、脳標的ペプチドsiRNA製剤の鼻腔内投与に対するマウスの適切な配置を可能にするマウス位置決め装置を用いて、中枢神経系における有効な遺伝子サイレンシングを可能にするプロトコルを提示する。
このプロトコルは、マウスCNSへの生体分子の鼻腔内送達のための測位装置の使用を詳述する。この装置の使用は、マウスの取り扱いと治療時間を大幅に削減し、技術の効率と再現性を向上させます。この手順を開始するには、手術面を維持するためにペダル反射によりマウスの麻酔レベルを評価する。
次に、適切な距離と高さで位置決め装置を配置し、必要なすべての試薬に便利にアクセスできるようにします。その後、動物の目に軟膏を塗布します。1本のマウスに椅子ベルトを付け、マウスの前肢が不快な状態でリラックスした位置にある間、自然なサポートを提供します。
残りのマウスについても手順を繰り返します。各マウスを指定された椅子の上にそっと置き、椅子の背部支持に平行に、椅子の座席に90度で置きます。動物は押したり押したりすることなく、頭の下と前方の位置に自然に横たわるましょう。
すべてのマウスが縛られたら、すぐに鼻腔内接種を開始する。鼻腔内送達を行うために、マイクロピペットに2マイクロリットルのRVG9R siRNA複合体溶液をロードする。ピペットを支配的な手で握り、もう一方の手で支えて、siRNAを投与しながら制御不能な動きを避けます。
マウスが直接それを吸い込むことができるように、1つの鼻孔の近くに約2マイクロリットルの液滴を置きます。小さな落としが簡単に形成されない場合は、ピペットチップを新しいものに交換し、操作を繰り返します。マウスの頭を人差し指で5秒間軽く押し下げ、吸い込んで位置を維持します。
肺への薬物の排出を防ぐためには、マウスが吸入している間、人差し指でマウスの頭を5秒間押し下げるのが重要です。最初のマウスの第2のナレに時間接種するために、この後3〜4分クロックするストップウォッチを開始します。この時間間隔は、マウスが最初の用量の吸入を完了し、正常な呼吸を回復するために必要です。
第1マウス上の代替ナレスの接種の間の3〜4分間の間隔で、装置上に配置された残りの3匹のマウスのそれぞれに1つのナレの鼻内接種を完了する。ストップウォッチが鳴ったら、最初のマウスの2番目の鼻孔を接種し、上記のように他のマウスについても手順を繰り返します。4匹のマウスすべてに対して20~30マイクロリットルが送達されるまで手順を繰り返します。
接種手順全体を完了するには約30〜45分かかります。動物を指定ケージに戻します。彼らは胸骨の不用さを維持するために十分な意識を取り戻すまで、マウスを放置しないでください.
遺伝子サイレンシングを評価するために、RNA精製キットを用いて様々な脳領域からRNAを抽出し、cDNA合成キットを用いてcDNAに逆転写し、プライマーペアでqPCRを行います。Alexa Fluor 488で標識されたRVG9Rペプチドの大部分の脳送達は、ここで説明したマウスポジショニング装置を用いて最初に試験した。接種後48時間で、様々な器官を切除してA488蛍光を測定した。
陰性対照のいずれの器官にも何も検出されなかった。一方、RVG9R接種群の脳内で強い蛍光A488シグナルが検出された。また、マウス配置位置を、有効性に対するサイン位置法および覚醒方法と比較した。
結果は、マウスの頭を下にして前方に配置することで、脳組織全体のRVG9R A488の浸透と堆積が改善されたことを示した。脳へのsiRNA送達をさらに確認するために、完全脳スキャンは、Cy5標識siRNAに複合体化したRVG9Rの単回鼻腔内投与後に行われた。PBSまたはRVM9Rとは対照的に、RVG9Rとの複合体化は、嗅球、皮質、海馬、視床、視床下部、脳中脳、小脳を含む主要な脳領域におけるsiRNAの強力な蓄積をもたらした。
位置決め装置は、マウスCNSへの薬物または分子の送達に使用することができる。アプリケーションは、治療薬のテストだけでなく、CNSの細胞機構を調べることに及ぶ。この位置付け装置は、西ナイルウイルス疾患の治療におけるsiRNAの効力を実証し、他のCNS疾患の治療法を探求するために研究者によって使用されてきた。
概要
本プロトコルでは、脳標的ペプチド-siRNA製剤の経鼻投与に用いるマウス固定装置について説明します。これにより、中枢神経系における効果的な遺伝子サイレンシングが可能になります。本手法は、マウスのハンドリングを最小限に抑えつつ、効率性と再現性を向上させます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 遺伝子治療
- 生体分子デリバリー
背景
- 鼻腔内投与は、中枢神経系（CNS）を標的とした治療において有望な経路です。
- 再現性のある結果を得るためには、効率的な投与手技が極めて重要です。
- マウスの固定位置は、薬物投与の有効性に影響を及ぼす可能性があります。
- siRNAによる遺伝子サイレンシングは、神経科学研究において有用なツールです。
研究の目的
- マウスの中枢神経系（CNS）へsiRNAを効果的に経鼻投与するためのプロトコルを確立する。
- マウスの固定位置が薬剤投与効率に与える影響を評価する。
- 遺伝子治療への応用におけるポジショニングデバイスの有用性を実証する。
使用した手法
- 固定前のマウスにおける麻酔レベルの評価。
- 固定装置を用いてマウスをリラックスした状態で固定。
- siRNA複合体溶液の経鼻接種。
- 遺伝子サイレンシング効率を評価するためのRNA抽出およびqPCR。
主な結果
- 接種後の脳領域において、顕著な遺伝子サイレンシングが観察された。
- ポジショニングデバイスを使用することで、他の手法と比較してsiRNAの送達効率が向上した。
- 処理したマウスの脳内で強い蛍光が検出され、送達が成功したことが示された。
- 頭部を下に向けたポジショニングにより、siRNA製剤の浸透性と沈着性が改善した。
結論
- このマウス固定デバイスは、中枢神経系（CNS）への薬剤投与に有効です。
- 本手法は、さまざまな治療および研究の文脈に適用可能です。
- 今後の研究により、CNS疾患の治療における本手法の活用を検討できます。
よくある質問
業界における重要性
CNS（中枢神経系）標的治療薬の効率的な経鼻投与は、前臨床神経科学および遺伝子治療の開発における重要なボトルネックとなっています。本ポジショニングデバイスは、siRNA、ペプチド、ナノ粒子などのバイオ分子をマウス脳へ標準化されたハイスループットな手法で投与することを可能にし、標的結合研究における再現性の向上とばらつきの低減を実現します。頭部を一定に前下方へ向けた状態で保持することで、CNSへの取り込みに関する予測精度を高め、経鼻治療候補薬のトランスレーショナルリサーチにおけるリスクを軽減します。
バイオ製薬R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： RVG9R-siRNA複合体などのCNS活性化合物を再現性高く投与することで、治療仮説の精密な検証を可能にする。
- 運用の価値： 投与における操作者依存のばらつきを低減し、信頼性の高いターゲットエンゲージメントおよび経路変調の評価をサポートする。
- 予測の信頼性： 治療群間における遺伝子サイレンシングやタンパク質ノックダウンなどのバイオマーカー読み取りの一貫性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 中枢神経系（CNS）への均一な化合物投与を保証することで、下流のスクリーニングに適した標準化された生物学的系を構築します。
- 運用的価値： 動物のポジショニングを制御し、ハンドリングストレスを低減させることで、アッセイの再現性を向上させます。
- プラットフォームの再利用性： siRNA、ナノ粒子、抗体など、CNS送達のための多様なモダリティの評価を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 科学的価値：神経変性またはウイルス感染モデルに関与する主要な脳領域への一貫した投与を可能にすることで、疾患との関連性を維持します。
- 運用上の価値：1セッションあたり最大8匹のマウスを並行して処理することで、治療候補物質の迅速な試験を可能にします。
- リスク調整後の進展：中枢神経系（CNS）への曝露およびターゲット調節データの信頼性を向上させることで、go/no-go判断をサポートします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このデバイスは、初期のターゲット検証からリード最適化に至るまでの探索ワークフローに組み込まれ、IND申請に向けた研究に先立つ信頼性の高いCNSデリバリー評価を支援します。
- 探索生物学： siRNAまたはペプチド治療薬の一貫した投与を可能にし、in vivoでのターゲット調節を検証することで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 経鼻投与時における動物の固定位置を標準化することで、アッセイの準備効率と再現性を向上させます。
- 分析： 蛍光、qPCR、またはバイオマーカーの読み取りにより、治療群間でのCNSへの取り込みを定量的に比較することを可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： 用量設定試験や有効性試験で用いられるCNS送達指標の信頼性を向上させ、探索段階から前臨床段階への継続性を繋ぎます。
- エンタープライズでの再利用： 複数のプロジェクトや治療領域にわたって、CNSを標的とした複数のモダリティを評価するための再利用可能なプラットフォームとして機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 手技のばらつきを抑えることで、中枢神経系（CNS）への送達およびターゲットへの結合における予測の信頼性を向上させます。
- 運用上の価値： スループットと標準化を改善し、実作業時間および技術者への依存度を低減します。
- 戦略的価値： CNS送達アッセイにおけるデータの質を高め、偽陰性を減らすことで、より適切なGo/No-go判断を支援します。
- ポートフォリオへの影響： 再現性のあるCNS取り込みデータに基づき、経鼻投与治療候補薬のリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の留意点
- 快適さと正しいポジショニングを確保するため、麻酔評価および適切な動物の固定に関するトレーニングが必要です。
- 一貫した液滴形成を行うため、マイクロピペットや滅菌チップなどの経鼻投与用器具へのアクセスが必要です。
- 頭部を前下方に向けた均一なポジショニングおよび左右の鼻孔への接種間隔を確保するため、チーム内での標準化が必要です。
- 調整可能なチェアの高さおよび傾斜機能を用い、マウスの系統やサイズに応じて調整する必要があります。
- 正確な経鼻投与を必要とする処置に限定されており、静脈内投与や経口投与ルートには適していません。
