Ca^{2 +}の効果の評価のためのスクリーニング アッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応

私たちのアッセイは、ヒト精子細胞機能に及ぼす影響について化合物をテストするために使用することができます。具体的には、これらの方法は、ヒト精子細胞におけるカルシウムシグナル伝達およびアクロソーム反応に及ぼす影響について、多数の化合物を迅速かつ容易にスクリーニングするために使用することができる。この方法の視覚的なデモンストレーションにより、他のユーザーが自分のラボで同様の実験を簡単に設定できるようになります。

まず、生の精液サンプル1ミリリットル当たり1本の50ミリリットルチューブを45度の角度でチューブラックに入れ、各チューブに37°Cのヒトチューブ流体またはHTF陽性媒体の4ミリリットルを加えます。次に、各チューブの底に液化精液剤サンプル1ミリリットルを慎重にピペットし、チューブを摂氏37度で1時間置きます。インキュベーションの終わりに、45度の角度で保持された修正されたピペットチップを使用して、HTF陽性培地を含むモチル精子細胞の上端分を新しい15ミリリットルプラスチックチューブにできるだけ穏やかに移動させる。

採取した精子細胞を数えるために、20マイクロリットルのアリコートを、予想濃度に従って2ミリリットルの丸底のS100バッファーで10、20、30、50、または90の因子に希釈する。1分間に700回転で10秒間希釈された精子細胞を渦液。次に、SP1カセットをサンプルに浸し、白いプランジャーを完全に落ち込ませて、サンプルのアリコートをカセットに吸引します。

次に、画像サイトメータートレイにカセットを入れ、適用された希釈因子に従ってPI染色されたヒト精子細胞アッセイを実行する。遊離細胞内カルシウム濃度の変化を測定するには、精子サンプルを1回上下に穏やかにピペットし、フルオロフォア染色精子細胞の50マイクロリットルを384マイクロウェルプレートの1列の24ウェルにアリコートする自動リピーターピペットを使用する。マイクロウェルプレートを蛍光プレートリーダーに摂氏30度に置き、フルオロフォアに適したプロトコルを選択します。

精子細胞の列のウェルを選択し、20%の目標値にゲインを調整し、測定を開始します。ベースラインサイクルを10サイクル後、実験を一時停止し、マイクロウェルプレートでドロワーを排出します。12チャンネルピペットを使用して、化合物の調製された溶液と目的のコントロールの25マイクロリットルを列の12の重複した井戸に素早く追加し、すぐにプレートをリーダーに返し、できるだけ早く測定を継続します。

化合物またはコントロールの添加に応じて蛍光の変化は、器具によってキャプチャされます。アクロソーム反応解析のために、適当な蛍光色素、化合物または対照物を用いて容量を持つ精子細胞をインキュベートした後、ピペッティングによりサンプルを混合し、各試験試料の50マイクロリットルを100マイクロリットルの固定化溶液に加える。サンプルを再度混合し、チャンバーあたり約30マイクロリットルのサンプルで、サンプルごとに1つのA2スライドのチャンバーをロードします。

次に、最初にロードしたスライドを画像サイトメーターのトレイに置きます。フレキシサイトプロトコルを選択し、実行を押します。ここで代表的な結果は、4つの化合物の効果を試験した実験から、実証された中スループットカルシウムシグナル伝達アッセイを用いた正のプロゲステロン制御および負バッファ制御が観察できる。

本グラフでは、プロゲステロンの連続希釈濃度によって誘導される細胞内遊離カルシウム濃度のピークパーセント変化に由来するプロゲステロンの用量応答曲線が示されている。これらのデータは、培地スループット・アクロソーム反応アッセイにおける容量化ヒト精子細胞におけるアクロソーム反応の誘導に対する1つの陰性または2つの陽性対照のうちの1つの効果を示す。誘導信号のピークを逃さないようにするためには、複製ウェルに化学物質を素早く添加し、その後すぐに測定を継続することが重要です。

蛍光色素と色素の種類を変更することで、当社のアッセイを簡単に修正して、さまざまな科学的な質問に答えることができます。これらのアッセイは、ヒト精子機能に及ぼす影響について、化合物の大規模なグループをテストするために、いくつかの研究で既に使用されています。