Name: Ca2 +の効果の評価のためのスクリーニング アッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-01T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: 学ぶ中スループットアッセイを用いたヒト精子のカルシウムシグナリングとアクロソーム反応の評価法。蛍光色素とイメージサイトメトリーで化合物の精子機能への影響を効率的にスクリーニングできます。

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著者は、ティモ ・ Strünker の彼の実験室で彼らの滞在中に AR と DLE の監督のためのラボを認めたいと思います。さらに、部門の成長と再生、コペンハーゲン大学病院 Rigshospitalet のこれらの 2 つの試金の設定に協力の方々 に感謝したいと思います。この作業は、技術革新基金デンマーク (許可番号 005-2010-3 および 14-2013-4) からの助成金によって支えられました。

著者が明らかに何もありません。

中スループット Ca2 +シグナリング アッセイは単一マイクロウェルから蛍光の測定に基づいて約 250,000 の精子細胞を含みます。取込んだ信号もすべて細胞精子の平均です。アッセイにより空間情報について具体的には、精子細胞 [Ca2 +]私は変更されず、[Ca2 +]iの変更になります場所、または異種の応答は精子細胞の大きさの割合で間個々 のセル。このような情報を取得するには、単一セルの解像度の実験 (例えば、前述の50,52) を用いなければなりません。技術のもう一つの欠点は、秒、時間の分解能です。50 μ L 精子サンプルが十分に混合されたとき 25 にもかかわらずウェル プレートに引き出し蛍光プレート リーダーの内部に戻って後、測定を開始する最初のソリューションの μ L が追加されます。高い時間分解能を得るためには、他のテクニックを採用する必要があります (例えば、停止の流れ/蛍光定量<sup clas...

ここで説明した 2 つの試金の目的は Ca2 +の効果を検討する-シグナル伝達と先体反応ひと精子での示されている、これらを用いたいくつかの出版物の複数の化合物の試金の1,2、 3,4,5,6,7。Ca2 +-シグナル伝達と精子先体反応が正常に重要なひと精子細胞の機能と男性の生殖能力。
ヒトの精子細胞の全体的な目標は、卵を受精することです。正常にし、自然卵を受精させることができるには、精子細胞の機能は、女性の生殖器官の8,9を介して精子細胞の旅の間にしっかりと調整されなければなりません。精子細胞機能の多くが規制されるを介して細胞内 Ca2 +の濃度 [Ca2 +]私(例えば、精子性、走化性、並びにアクロゾーム反応)10。また、精子細胞は卵を肥やすことが可能なレンダリング、精子受精能獲得と呼ばれる成熟プロセスは [Ca2 +] によって部分的に規制の私10です。Ca2 +-押し出し Ca2 +-ATPase ポンプ11を維持、およそ 20.000 折り Ca2 +-、休憩 [Ca2 +]私50 ~ 100 nM のと、人間の精子細胞膜上のグラデーション。Ca2 +ができるか細胞膜を通過 (例えば、Ca2 +の開口部を通って-チャンネル)、[Ca2 +]私の昇格に上昇を与える Ca2 +のかなりの流入が発生します。しかし、また精子細胞を運ぶ細胞内 Ca2 +-ストアは、Ca2 +を解放できると、したがって、また与える上昇 [Ca2 +]私12の昇格。興味深いことに、すべてチャネルを介する Ca2 +-人間の精子細胞の流入が精子細胞11でしか表現が医学: CatSper (猫 Sperm のイオン チャネル)、を介して発生する見つかったところ。ヒトの精子細胞医学: CatSper をアクティブに内因性リガンド プロゲステロンと異なるリガンドでサイト13,14,15を介してプロスタグランジンによる急速な Ca2 +の流入精子細胞。卵の近くの 2 つの主な情報源は、これらの内因性リガンドの高レベルを提供します。プロゲステロン16の高レベルを含む卵胞液であります。一緒に排卵、卵管17内流体と混合で卵成熟卵胞から卵胞液を発売します。その他の主なソースは卵丘細胞卵を囲む、高レベルのプロゲステロンとプロスタグランジンの解放です。プロゲステロン誘発性 Ca2 +-精子細胞の流入が卵9,18に向かって走化性を仲介する、精子運動19,20を制御し、精子を刺激するために示されています。反応21。これら個々 [Ca2 +]私のトリガー-8卵の受精の正しい時刻に正しい順序で調整した精子機能は欠かせません。これに伴い、最適なプロゲステロン誘発性 Ca2 +の流入は男性不妊治療22,23,24,25,26 を削減することができる発見されています。 ,27,28,29 ・機能医学: CatSper が男性の生殖能力26,30,31,32、不可欠 33,34,35,36。
精子細胞卵に到達と一連のイベントが発生する受精のための場所を取る必要があります: 1)、精子細胞必要が周囲の卵丘細胞層に浸透、2) 透明帯にバインド、3) exocytose 先コンテンツ、いわゆる精子先体反応37, 4) 透明帯と 5 貫通) 受精38を完了する卵膜と融合。手順を通過し、卵子を受精させることができる、精子細胞に精子11、精子細胞"decapacitating"の要因39を含む精液を残すし、女性の流体に泳ぐとして始まりまず受ける必要があります。重炭酸塩およびアルブミンの37の高レベルの生殖器。精子は、精子細胞の陰嚢、鞭毛と精子先体反応37の積極的な打撃と運動の形を受けることをレンダリングします。Hyperactivated 運動は、40の透明帯の浸透のため、先にこの浸透プロセス41を支援する様々 な加水分解酵素が含まれています。さらに、先体反応は精子細胞を精子卵融合42に必要な精子表面の特定の膜タンパク質を公開することによって、卵と融合させるが可能なレンダリングします。その結果、陰嚢と先体反応を受けるための能力は、正常な受精卵40,42のために必要な両方。マウス精子細胞43,44,45見られているものに反して精子そのまま唯一の人間の精子は透明帯46にバインドできます。人間の精子が透明帯にバインドされたとき彼らは41透明帯を貫通して卵38との融合のために必要な特定の膜タンパク質を公開する先体反応を受けなければなりません。ひと精子先体反応のタイミング、受精が発生するために重要です。
前述の通り、Ca2 +-重要な信号が正常な精子細胞機能8、それは、したがって、画面多数 Ca2 +の効果のための化合物のことができるの関心-ひと精子細胞におけるシグナル伝達します。同様に、適切なタイミングと場所で精子先体反応を受ける唯一の人間の精子は透明帯を貫通でき、受精卵46,47、だもする機能のための化合物をテストすることができるの関心ひと精子先体反応に影響を与えます。このため、2 つの培地スクリーニング アッセイが記載されて: 1) Ca2 +の影響の分析-人間の精子細胞と 2) ひと精子先体反応を誘導する能力のアッセイのシグナルします。
1 の試金は媒体スループット Ca2 +-アッセイをシグナリングします。この蛍光プレート リーダー ベースの技術は、複数の井戸で同時に時間の関数としての蛍光性の変更を監視します。Ca2 +-敏感な蛍光染料、蛍光色 4 は Ca2 +≒ 335 の Kd nM、AM (アセトキシメチルセファロスポリン) エステル フォームのセル側の透過を物。蛍光色 4 を使用すると、時間が経つと精子細胞に関心の化合物の添加後に [Ca2 +]iの変化を測定することが可能です。アッセイ 2011年13ティモ ・ Strünker の研究室で開発された、以来 Ca2 +の効果のための化合物の画面にいくつかの研究で使用されています-ひと精子1,2,3、シグナル伝達 4,5。同様のメソッドは、複数の薬物候補48を画面に使用されています。さらに、この試金はアクション1,2,3,4,の5用量-反応曲線1、薬理学的モードを評価するために有用なも 2,3,4、5、競争阻害1,2加法1,2、および相乗作用3興味の化合物。
2 の試金は媒体スループット精子先体反応アッセイです。この画像の cytometer ベース技術対策実行可能な量精子先体反応 3 つの蛍光染料を使用して、サンプルの精子細胞: propidium ヨウ化 (PI) エンドウ (FITC PSA) とヘキスト 33342 の FITC 結合レクチン。試金は Zoppino ら49によって似たような流れの cytometry ベースのメソッドから変更され、いくつか研究6,7で使用されています。Ca2 +は-シグナリング アッセイは、この先体反応アッセイは興味の化合物の相乗効果、加法性、阻害用量反応曲線を評価するためにも使えます。

<table><tbody><tr><td>0.2 &マイクロ;m 細孔フィルター</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>296-4545</td><td></td></tr><tr><td>1 L 測定シリンダー</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>3662-1000</td><td></td></tr><tr><td>1、4、2 mL プラスチックチューブ</td><td>Eppendorf, ドイツ</td><td>30120086 and 0030120094</td><td></td></tr><tr><td>12チャンネルピペット</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>4861000813</td><td></td></tr><tr><td>384 マルチウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One, ドイツ</td><td>781096</td><td></td></tr><tr><td>15 mL and 50 mL プラティックチューブ</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>0030122151 and 30122178</td><td></td></tr><tr><td>A2-slide</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>942-0001</td><td></td></tr><tr><td>自動リピーターピペット</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>4987000010</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clean 広口精液サンプル</td><td></td><td></td><td></td>用プラスチック容器</tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pisum sativum の FITC-結合レクチン (FITC-PSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Germany</td><td>L0770</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader</td><td>BMG Labtech, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース無水HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Hoechst-33342 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>910-3015</td><td></td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン(HSA)</td><td>Irvine Scientific</td><td>9988</td><td></td></tr> <tr><td>蒸留水</td><td></td><td></td><td></td>中に0.6 M NaHCO3および0.37%(v/v)ホルムアルデヒドを含むHTF+固定化溶液</tr>への添加<tr><td>インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na-乳酸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NC-3000 イメージサイトメーター</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>970-3003</td><td></td></tr><tr><td>ピペットとピッティングチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム (PI)</td><td>ChemoMetec, デンマーク</td><td>910-3002</td><td></td></tr> 50mLのプラスチックチューブを45°Cの角度<tr><td></td>で配置するための精製水<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ラック</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S100バッファー</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>910-0101</td><td></td></tr><tr><td>SP1-cassette</td><td>ChemoMetec, Denmark</td><td>941-0006</td><td></td></tr><tr><td>Volumetric flasks of appropriate sizes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ca2 +の効果の評価のためのスクリーニング アッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2 +-信号が正常な精子細胞機能と男性の生殖能力に不可欠であります。同様に、先体反応は、透明帯を貫通し、卵子を受精させる精子細胞の機能に不可欠です。ですので、テスト混合物 (例えば、環境化学物質、薬剤の候補者) の Ca2 +の影響についての関心-ひと精子シグナリングと先体反応ひと精子細胞の機能の潜在的有害作用を調べるかまたは避妊薬としての可能な役割を調査。2 つの媒体スループット アッセイの説明ここでは、: 1) 蛍光を用いた Ca2 +への影響評価の測定-ヒトの精子と 2) ひと精子先体反応の評価イメージ フローサイトメトリーによるアッセイのシグナルします。これらのアッセイは、多数の Ca2 +に対する効果のための化合物をスクリーニングするため使用ことができます-ひと精子シグナリングと先体反応。個々 の化合物の非常に特定の用量-反応曲線を生成する 2 つ以上の化合物の潜在的な加法性/相乗効果を決定し、競争の抑制を介してアクションの薬理学的特性を研究する、アッセイを使用ことができますさらに、医学: CatSper 阻害剤で実験。

代表中 Ca2 +によるひと精子テスト陽性 (プロゲステロン) と負 (バッファー) コントロール [Ca2 +]i 4 化合物 (A、B、C、および D) の効果実験からの結果-シグナルアッセイは、図 4 aで見ることができます。図 4 bでプロゲステロンの用量応答曲線が現れ、ピーク ΔF/F0 (%) から派生しました。プロゲステロンの希釈した濃度によるデータ媒体スループット Ca2 +を使用して別の実験でテスト-アッセイをシグナリングします。Ca2 +からデータの分析-シグナリング アッセイは、ステップ 5 で説明します。容量制約をもつひと精子細胞ネガティブ コントロール (DMSO) または媒体スループット精子先体反応アッセイを 2 つ肯定的なコントロール (プロゲステロンおよびイオノマイシン) 使用で精子先体反応の...

ここでは、Ca2 +の効果の評価のための 2 つの媒体スループット アッセイ-ひと精子シグナリングと先体反応を示します。これらのアッセイは、迅速かつ容易に大量の Ca2 +に対する効果のための化合物をスクリーニングするため使用ことができます-ひと精子シグナリングと先体反応。

Ca2 +の効果の評価のためのスクリーニング アッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

私たちのアッセイは、ヒト精子細胞機能に及ぼす影響について化合物をテストするために使用することができます。具体的には、これらの方法は、ヒト精子細胞におけるカルシウムシグナル伝達およびアクロソーム反応に及ぼす影響について、多数の化合物を迅速かつ容易にスクリーニングするために使用することができる。この方法の視覚的なデモンストレーションにより、他のユーザーが自分のラボで同様の実験を簡単に設定できるようになります。まず、生の精液サンプル1ミリリットル当たり1本の50ミリリットルチューブを45度の角度でチューブラックに入れ、各チューブに37°Cのヒトチューブ流体またはHTF陽性媒体の4ミリリットルを加えます。次に、各チューブの底に液化精液剤サンプル1ミリリットルを慎重にピペットし、チューブを摂氏37度で1時間置きます。インキュベーションの終わりに、45度の角度で保持された修正されたピペットチップを使用して、HTF陽性培地を含むモチル精子細胞の上端分を新しい15ミリリットルプラスチックチューブにできるだけ穏やかに移動させる。採取した精子細胞を数えるために、20マイクロリットルのアリコートを、予想濃度に従って2ミリリットルの丸底のS100バッファーで10、20、30、50、または90の因子に希釈する。1分間に700回転で10秒間希釈された精子細胞を渦液。次に、SP1カセットをサンプルに浸し、白いプランジャーを完全に落ち込ませて、サンプルのアリコートをカセットに吸引します。次に、画像サイトメータートレイにカセットを入れ、適用された希釈因子に従ってPI染色されたヒト精子細胞アッセイを実行する。遊離細胞内カルシウム濃度の変化を測定するには、精子サンプルを1回上下に穏やかにピペットし、フルオロフォア染色精子細胞の50マイクロリットルを384マイクロウェルプレートの1列の24ウェルにアリコートする自動リピーターピペットを使用する。マイクロウェルプレートを蛍光プレートリーダーに摂氏30度に置き、フルオロフォアに適したプロトコルを選択します。精子細胞の列のウェルを選択し、20%の目標値にゲインを調整し、測定を開始します。ベースラインサイクルを10サイクル後、実験を一時停止し、マイクロウェルプレートでドロワーを排出します。12チャンネルピペットを使用して、化合物の調製された溶液と目的のコントロールの25マイクロリットルを列の12の重複した井戸に素早く追加し、すぐにプレートをリーダーに返し、できるだけ早く測定を継続します。化合物またはコントロールの添加に応じて蛍光の変化は、器具によってキャプチャされます。アクロソーム反応解析のために、適当な蛍光色素、化合物または対照物を用いて容量を持つ精子細胞をインキュベートした後、ピペッティングによりサンプルを混合し、各試験試料の50マイクロリットルを100マイクロリットルの固定化溶液に加える。サンプルを再度混合し、チャンバーあたり約30マイクロリットルのサンプルで、サンプルごとに1つのA2スライドのチャンバーをロードします。次に、最初にロードしたスライドを画像サイトメーターのトレイに置きます。フレキシサイトプロトコルを選択し、実行を押します。ここで代表的な結果は、4つの化合物の効果を試験した実験から、実証された中スループットカルシウムシグナル伝達アッセイを用いた正のプロゲステロン制御および負バッファ制御が観察できる。本グラフでは、プロゲステロンの連続希釈濃度によって誘導される細胞内遊離カルシウム濃度のピークパーセント変化に由来するプロゲステロンの用量応答曲線が示されている。これらのデータは、培地スループット・アクロソーム反応アッセイにおける容量化ヒト精子細胞におけるアクロソーム反応の誘導に対する1つの陰性または2つの陽性対照のうちの1つの効果を示す。誘導信号のピークを逃さないようにするためには、複製ウェルに化学物質を素早く添加し、その後すぐに測定を継続することが重要です。蛍光色素と色素の種類を変更することで、当社のアッセイを簡単に修正して、さまざまな科学的な質問に答えることができます。これらのアッセイは、ヒト精子機能に及ぼす影響について、化合物の大規模なグループをテストするために、いくつかの研究で既に使用されています。

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Ca^{2 +}の効果の評価のためのスクリーニングアッセイ中スループット-シグナリングおよびひと精子先体反応

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