細胞遺伝学的手法を用いたタバココナジラミの卵の受精率を決定します。

Lizが開発したプロトコルは、私たちがホワイトフライ受精率を決定することを可能にします。この技術を応用することで、白ホエの行動や生態に対する理解が深まりつつあり、ホタルはハプロディプロイドであるため、受精率は卵巣位置における性比に等しい。

このプロトコルは、私たちの知る限り、ホワイトフライのために最初に記述され、3時間以内に完了することができます。まず、ペトリ皿カバーに覆い込み可能な穴を作り、大人の白身を挿入して取り除きます。湿度チャンバーを設置し、溶融したピペットチップに快適な作業角度で薄いピンを挿入してプローブを作り、薄いプローブを作ります。

必要に応じて、ホワイトフライの卵の取り扱いが容易になるため、ガラスピペットチップを熱で伸ばします。その後、メスのホチフライがきれいな葉の上にオビポジットできるようにし、ペトリ皿の寒天に収まるようにカットします。ホワイトフライのオビジポジションの間に、石鹸と水で顕微鏡スライドをきれいにしてください。

よく乾燥させ、片方の端にパラフィンフィルムを伸ばして、液体が滴を形成し、卵がより簡単に見えるようにします。卵をデコール化するには、ガラス製のパスツールピペットを使用して、大人の除去と卵の収集の直前にパラフィンフィルムに83%次亜塩素酸ナトリウム漂白剤溶液を加えます。漂白剤と氷酢酸はいずれも腐食性です。

彼らはフードや換気の良い領域で手袋で処理する必要があります。DAPIは刺激性もあり、手袋で扱う必要があります。その後、葉から成虫のホタルを取り出し、その葉を顕微鏡の下に置きます。

ペディセルが葉から取り除かれるまで、各卵をベースから慎重に持ち上げます。このプロトコルを実行する前に、多くの卵の練習。卵をベースからゆっくりと持ち上げ、卵ペディセルが葉から取り除かれるのを見たら、葉から完全に持ち上げます。

漂白剤の各滴に卵を2〜3個移し、10分間放置します。卵を固定するには、ガラスピペットを使用して漂白剤を捨てます。その後、氷酢酸を滴下し、3分間待ちます。

次に、氷河酢酸を取り除き、クラークの溶液を滴下します。その後、溶液の大部分が蒸発するまで10分待ちます。70%エタノールを加え、10分間もう一度待ちます。

卵を染色するには、まず残留エタノールを除去する。その後、卵に1xPBSの滴を加え、pHを7に近づけます。乾燥を防ぐために、顕微鏡スライドを湿度チャンバーに入れます。

30分後、1xPBSを取り除き、1ミリリットルDAPIあたり1マイクログラムの滴を加えます。顕微鏡スライドを暗い湿度室に入れ、少なくとも15分待ちます。卵を洗うために、まずDAPI溶液を取り除きます。

その後、卵に1xTBSTの滴を追加します。5 分後に 1xTBST を取り外します。この洗浄を2回繰り返し、合計3回の洗浄を行います。

最後の洗浄の後、慎重に顕微鏡スライドのきれいな部分にパラフィルムからすべての卵をピペット。余分なTBSTを取り除き、20マイクロリットルの取り付け媒体を加えます。最後に、卵の上にきれいなカバースライドを置き、カバースライドを透明なマニキュアで密封して長期保存し、蛍光顕微鏡を用いてイメージングに進みます。

卵のデコールリオネーションに続いてDAPI核染色を行い、蛍光顕微鏡で観察した場合の受精と胚性の割り当てを可能にした。雌の前核は、受精した雌の卵子と未受精卵の両方の中心付近にあり、精子は雌の卵子の頂点付近の明るい筋として見える。この技術の1つのアプリケーションは、細菌のendosymbiontsがホタルの原発性比に影響を与えるかどうかを判断することです。

例えば、リケッチア感染と未感染のB.tabiciホワイトフライによって産卵された卵の一次性比は、2つの治療において性比に有意差を示さなかった。成人期まで飼育された卵子に関しては、リケッチア感染および感染していない成人にも同様の結果が見られ、少なくともこの研究では、リケッチア感染女性による受精率が高いという証拠はなかった。このプロトコルを使用することで、特異性精子が卵子を受精できるかどうかを判断することができます。

受精が観察されない場合、女性の精子を見ることによって、交配中に精子が移されるかどうかをバックアップして見ることができます。受精が起こった場合、成人の性比と受精率を比較して、ハイブリッド子孫の発達の生存率を決定することができる。