Name: 哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶRNA結合タンパク質PKRのRNAインタラクター同定法。ホルムアルデヒド架橋と免疫沈降を用いて哺乳類細胞周期中の転写後制御を解析し、神経変性疾患の病態理解に貢献する。

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この作品は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 韓国政府科学省と ICT (NRF 2016R1C1B2009886) によって資金を供給によって支えられました。

<ol><li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li>
<li>Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon-inducible+double-stranded+RNA-activated+protein+kinase+self-associates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).</li>
<li>Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAX%2FPACT-PKR+stress+response+pathway+promotes+p53+sumoylation+and+activation%2C+leading+to+G%281%29+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest.</a> Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).</li>
<li>Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+differentially+regulates+insulin+receptor+substrates+1+and+2+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).</li>
<li>Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappa+B+Activation+by+Double-Stranded-RNA-Activated+Protein+Kinase+%28PKR%29+Is+Mediated+through+NF-kappa+B-Inducing+Kinase+and+Ikappa+B+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).</li>
<li>Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deletion+of+PKR+abrogates+TNF-induced+activation+of+IkappaBalpha+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22JNK%2C+Akt+and+cell+proliferation+but+potentiates+p44%2Fp42+MAPK+and+p38+MAPK+activation.+Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase.</a> JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).</li>
<li>Dabo, S., Meurs, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR+and+its+role+in+stress%2C+signaling+and+HCV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection.</a> Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).</li>
<li>Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+68%2C000-Mr+Protein-Kinase+Is+Highly+Autophosphorylated+and+Activated+yet+Significantly+Degraded+during+Poliovirus+Infection+-+Implications+for+Translational+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation.</a> Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).</li>
<li>Bando, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+RNA+dependent+protein+kinase+%28PKR%29+is+involved+in+the+extrastriatal+degeneration+in+Parkinson%27s+disease+and+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease.</a> Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).</li>
<li>Onuki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-dependent+protein+kinase+is+involved+in+tunicamycin-induced+apoptosis+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease.</a> The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).</li>
<li>Peel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+cell+stress+kinase+PKR+in+Alzheimer%27s+disease+and+human+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice.</a> Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).</li>
<li>Peel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%2C+PKR%2C+binds+preferentially+to+Huntington%27s+disease+%28HD%29+transcripts+and+is+activated+in+HD+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue.</a> Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).</li>
<li>Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upstream+signaling+pathways+leading+to+the+activation+of+double-stranded+RNA-dependent+serine%2Fthreonine+protein+kinase+in+beta-amyloid+peptide+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity.</a> Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PKR+complexes+with+TRBP+in+Immunometabolic+regulation+and+eIF2alpha+phosphorylation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity.</a> Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).</li>
<li>Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+interferon-induced+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+activity+by+Sindbis+virus+infection+and+heat-shock+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress.</a> Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).</li>
<li>Youssef, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+for+snoRNAs+in+PKR+activation+during+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).</li>
<li>Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+Phosphorylation-resistant+Eukaryotic+Initiation+Factor+2+a-Subunit+Mitigates+Heat+Shock+Inhibition+of+Protein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).</li>
<li>Benkirane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+potential+of+TAR+RNA+binding+protein+TRBP+and+its+regulatory+interaction+with+RNA-dependent+protein+kinase+PKR%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR.</a> The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).</li>
<li>Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+by+a+mutant+of+the+IFN-inducible+dsRNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase.</a> Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKR+is+activated+by+cellular+dsRNAs+during+mitosis+and+acts+as+a+mitotic+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator.</a> Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+human+tarbp2+reveals+cellular+microRNA+targets+and+cell-cycle+function+of+TRBP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP.</a> Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).</li>
<li>Zhu, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PKR+promotes+network+excitability+and+enhanced+cognition+by+interferon-gamma-mediated+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition.</a> Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).</li>
<li>Dagon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%2C+PKR%2C+down-regulates+CDC2%2Fcyclin+B1+and+induces+apoptosis+in+non-transformed+but+not+in+v-mos+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells.</a> Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAU1+binding+3%27+UTR+IRAlus+complements+nuclear+retention+to+protect+cells+from+PKR-mediated+translational+shutdown%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown.</a> Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28A+is+a+suppressor+of+ER-associated+translation+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKR+Senses+Nuclear+and+Mitochondrial+Signals+by+Interacting+with+Endogenous+Double-Stranded+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs.</a> Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).</li>
<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li>
<li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li>
<li>Kim, B., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fCLIP-seq+for+transcriptomic+footprinting+of+dsRNA-binding+proteins%3A+Lessons+from+DROSHA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Dhir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+double-stranded+RNA+triggers+antiviral+signalling+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans.</a> Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).</li>
</ol>

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S または M 相逮捕のサンプルを準備するプロセスを図 1に示します。S 期の細胞を逮捕、逮捕高効率 (図 1 a) を確保する間に 9 h のリリースで 2 回チミジンと細胞を扱ってチミジンの二重ブロック メソッドを使用しました。チミジンと一度セルを扱って M 相の逮捕のため 9 h のリリースに続いて、ブロック prometaphase (図 1 b) 細胞にノコダゾールを適用します。細胞周期のサンプルを準備する 1 つの重要なステップは、最初のチミジン ブロック後リリースのステップです。チミジンを完全に削除するには、少なくとも 2 回新鮮な PBS のセルを洗浄するが重要です。不適切な洗浄および残留チミジン増加の不均質性と減少した細胞で起因できます。M 相逮捕の成功は、円形の細胞 (図 2 a) 数の増加に基づいて視覚的に確認できます。ただし、M 相サンプルはまだ彼らの形態に基づく多くの間期細胞...

プロテインキナーゼ rna (PKR)、として知られている真核生物の開始因子 2 α キナーゼ 2 (EIF2AK2) はよ特徴付けられた蛋白質キナーゼ Rna によって提供される情報を伝送します。それは真核生物の翻訳開始 2 サブユニット α (神経: Eif2) に属するキナーゼ家族とグローバル翻訳1を抑制して感染への応答でセリン 51 で神経: Eif2 を廃止します。このコンテキスト PKR は PKR 活性化と自己リン酸化2のプラットフォームを提供するウイルスの二本鎖 Rna (二本) によってアクティブ化されます。神経: Eif2、に加えて PKR できますもをリン酸化 p53、インスリン受容体基質 1、阻害剤 B、c 6 月 N 末端キナーゼ (JNK) 多数信号伝達経路3,4、5の活動を規制するには 6。
PKR はもともとポリオ ウイルスの伝染の間にポリオ ウイルスの二本7、8を認識することによって神経: Eif2 をリン酸化するキナーゼとして同定されました。PKR は昨今は免疫応答を超えて多面的な役割を果たすことと多くの人間の病気でその異常活性化や故障はございません。アクティブ/Phosphorylated PKR (pPKR) はアポトーシス中によく見られる、変性疾患、特にハンチントン病などの神経変性疾患、パーキンソンのおよびアルツハイマー病9 患者の共通の特徴 ,,1011,12,13。また、PKR は代謝ストレスや熱衝撃14,15,16,17など様々 なストレス条件下で作動します。その一方で、PKR 阻害は高められた細胞増殖とも悪性転化18,19の結果します。PKR 関数はまた正常な脳機能に重要なと pPKR のレベルとして細胞周期の間に高架 M 相20,21,22時。このコンテキストで pPKR はグローバルな翻訳を抑制する適切な細胞分裂20に必要なキーの分裂シグナル伝達システムへの手がかりを提供しています。また、pkr からの持続性の活性化は中国のハムスターの卵巣の細胞周期の停止細胞23G2/m 期で起因しました。その結果、PKR のリン酸化は、21M/G1 遷移中に急速な不活性化を確保するため負帰還ループによって調整されます。
PKR の広い範囲の機能にもかかわらず PKR 活性化の私達の理解は、キャプチャし、PKR をアクティブにすることができます二本を識別する標準化されたハイスループット実験的アプローチの不足のため制限されています。前の研究は、PKR を二本 2 倒立 Alu 反復 (IRAlus)20,24が、細胞周期の間にまたはの下で PKR をアクティブにすることができます追加の細胞二本鎖 rna の存在の可能性によって形成されるやり取りできること示されています。ひと細胞におけるストレス条件は探検でした。RNA 結合タンパク質 (RBP) の RNA インターアクターを識別するに従来のアプローチは、クロスリンク RNA RBP 錯体25,26,27に紫外光を使用します。最近の研究はマウス システムのこの UV 架橋アプローチを適用し、核小体低分子 Rna が代謝ストレス16の間に PKR 活性化を調節することが識別されます。ホルムアルデヒドの高架橋効率を活用することにより28HeLa 細胞の細胞周期中に PKR と相互作用する Rna を識別する方法を提案します。同様のアプローチは、シュタウフェン Drosha29,30,31など他の dsRBPs を研究に適用されています。短い散在させていて核要素 (正弦波)、長い散在核要素 (ライン)、内在性レトロ ウイルス要素 (ERV) とも α サテライト Rna など PKR が非翻訳 Rna のさまざまな種類と対話できるとわかった。また、PKR がミトコンドリア Rna (mtRNAs)、重鎖と光の相補的な相互作用を介してどのフォームの分子間二本鎖 Rna28と対話できることを示した。最近の出版物は、さらにいくつかの mtRNAs が二重のフォームに存在し、dsRNA センサー32インターフェロンを誘発する分化関連タンパク質悪性黒色腫 5 などをアクティブにすることができます私たちのデータをサポートしました。もっと重要なは、表現と mtRNAs の細胞内局変調細胞周期の間に、様々 なストレスによって28PKR 活性化を調節する能力に重要な可能性があります。
この記事で提案する架橋結合する最近開発されたホルムアルデヒドと免役沈降法 (fCLIP) のための詳しいプロトコルを取り込み、細胞周期中に PKR と相互作用する Rna を解析するメソッド。チミジンとノコダゾールを用いた細胞周期停止試料を準備する方法を示す.これらの Rna を識別する高スループット シーケンス ライブラリを準備する PKR バインド Rna とメソッドを特定する fCLIP プロセスを提案する.さらに、我々 は qRT PCR を使用して PKR バインド Rna を分析する手順の詳細を描きます。具体的には、mtRNAs の strandedness を分析するアンチセンス逆転写法を紹介します。記述されていたプロトコルは HeLa 細胞の PKR、最適化されますが、細胞周期サンプル、fCLIP、アンチセンス qRT PCR 解析の準備などの重要なステップは、携帯電話の二本を勉強するまたは他の dsRBPs の RNA インターアクターを識別するために簡単に変更できます。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA、pH 8.0</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 M トリス、pH 7.0</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1 M トリス、pH 8.0</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量遠心チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10% Nonidet-p40 (NP-40)</td><td>Biosolution</td><td>BN015</td><td></td></tr><tr><td>10X DNA ローディングバッファー</td><td>TaKaRa</td><td>9157</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3' アダプター</td><td></td><td></td><td>5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3</td></tr> <tr><td>M 酢酸ナトリウム pH 5.5</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5' アダプター</td><td></td><td></td><td>5'-GUU CAG AGU UCU ACU GUC CGA CGA UCN NNN-3'</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>酸フェノールクロロホルム、pH 4.5</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>アジャンクール AMPure XP</td><td>ベックマンコールター</td><td>A63881</td><td>磁気ビーズ DNA/RNA クリーンアップ</td></tr><tr><td>南極アルカリホスファターゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>抗DGCR8</td><td></td><td></td><td>自社製</td></tr><tr><td>抗PKR (D7F7)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>抗PKR (ミリ)</td><td>ミリポア EMD</td><td>07-151</td><td></td></tr><tr><td>ATP (100 mM)</td><td>GE Healthcare</td><td>GE27-2056-01</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルーナトリウム塩</td><td>Sigma-aldrich</td><td>B5525</td><td></td></tr><tr><td>子牛腸内アルカリホスファターゼ</td><td>TaKaRa</td><td>2250A</td><td></td></tr><tr><td>細胞スクレーパー 25 cm 2 ポジション</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>CMV プロモーター シーケンス</td><td></td><td></td><td>5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Dulbecco</td></tr> <tr><td>の修正イーグル培地</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 混合物 (2.5 mM)</td><td>TaKaRa</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、絶対、ACS グレード</td><td>アルファ エーザー</td><td>A9951</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>メルク</td><td>M-TMS-013-BKR</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>メルク</td><td>104008</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>バイオベーシック</td><td>GB0235</td><td></td></tr><tr><td>グリコブルー コプレシピタント (15 mg/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>メルク</td><td>8.18766.1000</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext rRNA 枯渇キット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E6318</td><td>rRNA枯渇キット</td></tr><tr><td>ノコダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>正常ウサギIgG</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>PCRフォワードプライマー(RP1)</td><td></td><td></td><td>5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACCG GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3'</td></tr><tr><td>PCRインデックスリバースプライマー(RPI)</td><td></td><td></td><td>5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'PCR</td></tr><tr><td>チューブ、フラットキャップ付き、0.2mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>リン酸bufered saline (PBS) Tablet</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Phusion high-fidelity DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>High-fidelity polymerase</td></tr><tr><td>スイングアウトローター付きPlateFuge微量遠心分離機</td><td>Benchmark</td><td>c2000</td><td></td></tr><tr><td>Polynucleotide kinase (PNK)</td><td>TaKaRa</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR プライマー 配列: CO1 ヘビー</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース: 5&prime;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:CO1ライト</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-TTGAGGTTGCGGTCTGTGTTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:CO2ヘ</td><td></td><td></td><td>ビーフォワード/リバース:5&prime;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGGGGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:CO2ライト</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:CO3ヘビーフォ</td><td></td><td></td><td>ワード/リバース:5&prime;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:CO3ライト</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:CYTB Heavy</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse:5&prime;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:CYTB Light</td><td></td><td></td><td>Forward/Reverse:5&prime;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:GAPDH</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:ND1ヘビー</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&プライム;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&プライム;/5&プライム;-CGCAAATGGGGGGTAGGCGTG-3&プライム;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:ND1ライト</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:ND4ヘビー</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:ND4ライト</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:ND5ヘビー</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:ND5ライト</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:ND6ヘビー</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCRプライマー配列:ND6ライト</td><td></td><td></td><td>フォワード/リバース:5&prime;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>ランダムヘキサマー</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/&mu;L)</td><td>TaKaRa</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>組換えRnase阻害剤(40 U/&mu;L)</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero rRNA Removal Kit</td><td>Illumina</td><td>MRZH116</td><td>rRNA Removal Kit</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FINEPCR, ROTATOR AG</td><td>D1.5-32</td><td></td></tr><tr><td>RT primer sequence: CO1 Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:CO1 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:CO2ヘビー5</td><td></td><td></td><td>&prime;-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:CO2 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:CO3ヘビー5</td><td></td><td></td><td>&prime;-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:CO3 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACCACCACCACCCCCTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:CYTB Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGGGGGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:CYTB Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCCCCACCCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:GAPDH</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGGCTCGGCT-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:ND1ヘビー5</td><td></td><td></td><td>&プライム;-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&プライム;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:ND1 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:ND4ヘビー5</td><td></td><td></td><td>&プライム;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&プライム;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:ND4 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:ND5ヘビー5</td><td></td><td></td><td>&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:ND5 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:ND6ヘビー5</td><td></td><td></td><td>&プライム;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>RTプライマー配列:ND6 Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>シリコン処理ポリプロピレン 1.5 mL G-tube</td><td>Bio Plas</td><td>4167SLS50</td><td></td></tr><tr><td>デデシル硫酸ナトリウム</td><td>Biosesang</td><td>S1010</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase In Rnase 阻害剤</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 逆転写酵素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック 18080093</td><td></td><td>ライブラリー調製用逆転写酵素</td></tr><tr><td>SuperScript IV 逆転写酵素</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18090010</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBR金核酸 gl染色</td>用逆転写酵素 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA リガーゼ 1 (ssRNA リガーゼ)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNAリガーゼ2、切り捨てられたKQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Tris-borate-EDTAバッファー(TBE)</td><td>TaKara</td><td>T9122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>UltralinkプロテインAセファロースビーズ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22810</td><td>プロテインAビーズ</td></tr><tr><td>超音波処理装置</td><td>バイオラプター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>バイオベーシック</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>ダイハンサイエンティフィック</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>キシレンシアノール</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>&gamma;-32P-ATP (10 &mu;Ci/&mu;L、3.3 &mu;M)</td><td>パーキンエルマー</td><td>BLU502A100UC</td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳類の細胞周期中に rna 活性化蛋白質キナーゼの rna インターアクターを勉強

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

タンパク質キナーゼ (PKR) rna は生得の免疫反応蛋白質のメンバーであるし、ウイルス Rna の二重鎖の二次構造を認識します。ウイルスの二本鎖 Rna (二本) にバインドされると、PKR は二量体化とそれに続く自己リン酸化を受けます。リン酸化 PKR (pPKR) はアクティブになり、真核生物の開始因子 2 (神経: Eif2) グローバル翻訳を抑制する α サブユニットのリン酸化を誘導します。増加する証拠を PKR を細胞周期の間に生理学的な条件の下で、または感染せず様々 なストレス条件下で起動できるかを示唆しています。しかし、pkr からの RNA の活性剤の私達の理解はキャプチャし、二本の pkr から相互作用を分析する標準化された実験方法の不足のために限られました。ここでは、提案する実験的具体的に豊かにし、PKR を分析するためのプロトコルは HeLa 細胞を用いた細胞周期中に Rna をバインドします。我々 は、PKR RNA 複合体を修正し、免疫沈降で分離するホルムアルデヒドの効率的な架橋アクティビティを利用します。PKR co 沈澱 Rna は、高スループット シーケンス ライブラリを生成するさらに処理することができます。PKR と相互作用する細胞二本鎖 rna の 1 つの主要なクラスは、重鎖と光鎖 Rna の相補的な相互作用による分子鎖 Rna として存在できますミトコンドリア Rna (mtRNAs) です。これらの二重 mtRNAs の strandedness を勉強するには、本鎖固有 qRT PCR のためのプロトコル。私達のプロトコルは PKR バインド Rna の解析に最適化されますが、細胞二本や他の dsRNA の結合蛋白質の RNA インターアクターを研究する簡単に変更できます。

HeLa 細胞を細胞周期の S または M の段階で逮捕するプロセスの模式図を図 1に示します。M 相逮捕のサンプルでは、(図 2 a) 顕微鏡の下で円形の形をした細胞を明確に視覚化できます。細胞周期の停止の効率を調べる、FACS (図 2 b) を使用してセルの核の内容を分析できます。D7F7 抗体が immunoprecipitate PKR する優れた性能を示す免疫沈降効率テストの代表的なデータを図 3に示します。この免疫沈降効率の違いは、2 つの異なる PKR 抗体 (図 4) を使用した高スループット シーケンス ライブラリのクラス分布の相違に反映されてが可能性があります。さらに、PKR immunoprecipitate (図 5 a) の総細胞ライセート (図 5 b) 全体のしみの西部分析を使用して D7F7 抗体の特異性...

HeLa 細胞を用いた哺乳類細胞周期中に二本鎖 RNA 結合蛋白質キナーゼ rna (PKR) 勉強 RNA インターアクターのための実験的アプローチを提案します。このメソッドは、クロスリンク RNA PKR 錯体と PKR バインド Rna を豊かにする免疫沈降にホルムアルデヒドを利用しています。これらの Rna は、高スループット シーケンスまたは qRT PCR からさらに分析できます。

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

このプロトコルは、ゲノム全体の方法でRNA結合タンパク質PKRのRNAインターアクターを同定する方法を提供する。RNA結合タンパク質による遺伝子発現の転写後の調節をよりよく理解するのに役立ちます。この技術の主な利点は、ホルムアルデヒドの効率的な架橋を利用してRNA結合タンパク質に結合したRNaseを固定し、免疫沈降によってそれらを豊かにすることです。活性化されたPKRは、パーキンソン病およびアルツハイマー病などの神経変性疾患患者において観察される。PKR相互作用二本鎖RNaseを同定することは、これらの変性疾患の病因をよりよく理解するのに役立ちます。この方法は、RNA結合タンパク質のRNAインターアクターを研究するために使用することができる。特に、この方法は、二本鎖RNaseのような構造化されたRNaseを認識するタンパク質を研究するのに役立つと考えています。細胞を収穫する前に、サイクル逮捕サンプルの均質性を確認してください。さらに、利用可能な最良の抗体を使用して免疫沈降効率を最適化することが重要です。まず、SまたはM相逮捕サンプルの種子750、000または100万個のHeLa細胞。24時間、摂氏37度、炭酸ガス5%で細胞を成長させます。2ミリモルチミジンで細胞を治療し、摂氏37度で18時間インキュベートします。PBSで細胞を2回洗います。その後、新鮮なメディアを追加し、9時間摂氏37度でインキュベートします。S相逮捕細胞の場合、2ミリモルチミジンで細胞を治療する。M相逮捕細胞の場合、ノコダゾールの1ミリリットル当たり100ナノグラムの細胞を治療する。摂氏37度で15時間インキュベートします。S相サンプルの場合、細胞スクレーパーで細胞を採取し、15ミリリットルの円錐管に移します。M相サンプルの場合、細胞培養皿の側面をタップしてM相逮捕細胞を取り外し、15ミリリットルの円錐管に移します。次に、室温で380gの細胞を3分間遠心する。上清を取り除き、冷たいPBSの1ミリリットルで細胞を再懸濁する。細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移す。セルを摂氏4度で10,000gで30秒間遠心し、上清を完全に取り除きます。ホルムアルデヒド架橋を行う場合は、まず0.1%パラホルムアルデヒドの750マイクロリットルを細胞に加え、室温で10分間インキュベートして細胞を固定します。次いで、250マイクロリットルの1モルグリシンを加え、室温で10分間インキュベートし、反応を急がせます。細胞を摂氏4度で10,000gで30秒間遠心分離する。上清を完全に取り除く。次に、PBSを1ミリリットルで再中断する。セルを摂氏4度で10,000gで30秒間遠心し、上清を取り除きます。0.2体積%プロテアーゼ阻害剤および2体積%RNase阻害剤を補ったfCLIPのリシスバッファーの400マイクロリットルで再懸濁。氷の上で10分間インキュベートし、超音波処理器を使用して超音波処理を行います。次に、5モルの塩化ナトリウムを11マイクロリットル加え、塩化ナトリウム濃度を150ミリモルに調整し、渦を短時間調整します。次いで、21で遠心分離機、摂氏4度で130g、15分間。上清を冷蔵1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。免疫沈降を行うために、まず20マイクロリットルのプロテインAビーズを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに加えます。次いで、400マイクロリットルのfCLIPライシスバッファーでビーズを洗浄します。ビーズを摂氏4度で1,000gで1分間遠心します。次に上澄み液を取り除き、400マイクロリットルのfCLIPライシスバッファーを慎重に加え、3~4回反転してビーズを静かに再懸濁します。洗浄を3回繰り返します。最後の洗浄後、上清を完全に取り除きます。ビーズをfCLIPライシスバッファーの300マイクロリットルに再懸濁します。塩化ナトリウム濃度を150ミリモルに調整するために、8.3マイクロリットルの塩化ナトリウムを加えます。10マイクロリットルのプロテインキナーゼRNA活性化抗体を加え、摂氏4度で3時間回転器でインキュベートします。次に、ビーズを摂氏4度で1,000gで1分間遠心する。上清を取り除き、400マイクロリットルのfCLIP洗浄バッファーを加え、3~4回反転してビーズを静かに再懸濁します。洗浄を2回繰り返します。最後の洗浄後、上清を完全に取り除きます。次に、300マイクロリットルのライセートを加え、3時間回転器で摂氏4度でインキュベートします。その後、ビーズを摂氏4度で1,000gで1分間遠心する。上清を取り除き、400マイクロリットルのfCLIP洗浄バッファーを加え、3~4回反転してビーズを静かに再懸濁します。洗浄を3回繰り返します。最後の洗浄後、上清を完全に取り除きます。次に、fCLIP溶出バッファーの300マイクロリットルを加えます。熱ミキサーで25°Cで3時間インキュベートし、ビーズからRNA活性化タンパク質キナーゼを溶出させます。室温で1,000gで遠心分離機、清浄なシリコンチューブに上清を移す。最後に、300マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏65度で一晩インキュベートします。SまたはM相におけるHeLa細胞の細胞周期停止の効率をFACSを用いて検討した。D7F7抗体は、RNA活性化タンパク質キナーゼを免疫沈殿させる優れた能力を示した。PKR免疫沈殿または全ヘラリセートのウェスタンブロット分析は、PKRの大きさに対応する1つの強いバンドのみを示し、D7F7抗体がPKRを認識する際に高度に特異的であることを示した。異なる免疫沈殿効率を有する異なるPKR抗体を用い、読み取りマップの異なるクラス分布をもたらした。PKR共免疫沈降RNaseに対する放射性同位元素シグナルの減少は、rRNA除去に成功した際に観察された。PKR共同免疫沈降RNA試料は、陰性対照と比較してミトコンドリアRNaseの強い濃縮を示した。ストランド特異的な逆転写を用いて、SまたはM相逮捕細胞に対してPKRと共免疫沈降した重鎖ミトコンドリアRNaseを区別した。細胞周期停止サンプルを調製する上で最も重要なステップは、PBSで細胞を2回洗浄する必要があり、均質性のために細胞パステルのみを収集しなければならないか、サンプルが損なわれる場所です。倫理的なプロセスのために、最も重要なステップはホルムアルデヒド架橋および量である。この手順の後に溶出したRNAはノーザンブロット法、qRT PCRまたはハイスループットシーケンシングを使用して分析することができる。これらの実験は、PKRに結合したRNaseの種類および相対量を同定することができる。この技術は、RNA結合タンパク質のRNAインターアクターを研究し同定するために適用することができ、RNA結合タンパク質によって媒介される遺伝子発現の転写後調節の理解を深める。ホルムアルデヒドは危険であるため、固定、溶液、および初期洗浄バッファーは慎重に取り扱う必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

FRETに基づく記者はますます、生細胞におけるキナーゼとホスファターゼの活動を監視するために使用されています。ここでは、ターゲットのリン酸化の細胞周期依存性の変化を評価するためのFRETに基づくレポーターを使用する方法の方法を説明します。...

FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

細胞集団の細胞周期の位置を決定する、または信号が増殖にどのような影響を与えるか理解する、容易にこのプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって測定することができる。我々は、細胞を染色し、細胞周期内の位置を定量化するための簡単​​な実験的なアプローチを報告する。...

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

この原稿は、特定のオリゴヌクレオチド指向濃縮を介して真核細胞で形成された選択された同族RNPを単離するアプローチを説明しています。DHX9/RNAヘリカーゼAで構成されるレトロウイルス5'非翻訳領域に結合した同族RNPを単離することにより、このアプローチの適用性を実証します。...

オリゴヌクレオチド指向溶出を用いて細胞から同族RNA-タンパク質複合体の単離

RNA-タンパク質相互作用は、多くの細胞プロセスの中心にあります。ここでは、特定のRNAを単離し、それに関連する新規タンパク質を同定するin...

急速な手法による新規RNA結合タンパク質の単離

我々は、細胞周期の特定の段階に関連する事象を研究するための状況を提供する2つの細胞同期プロトコールを報告する。我々は、このアプローチが、摂動のない細胞周期または細胞周期に影響を及ぼす薬剤への暴露で特定の遺伝子の調節を分析するのに有用であることを示す。...

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

高分解能共焦点顕微鏡を用いた解析に続いて HeLa 細胞の二重チミジン同期するためのプロトコルを提案します。このメソッドは、多数の有糸分裂、また界面機能を有する多機能性蛋白質の細胞分裂の役割の解明を可能にする S...

有糸分裂の多機能の細胞周期蛋白質の役割を研究する有糸分裂細胞同期と高分解能共焦点顕微鏡を組み合わせた

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1...

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

cDNAの速度論的架橋と解析は、生細胞におけるタンパク質-RNA相互作用のダイナミクスを高い時間分解能で調べることができる方法です。ここでは、酵母細胞の増殖、UV架橋、収穫、タンパク質精製、次世代シーケンシングライブラリ調製ステップなど、プロトコルについて詳しく説明します。...

χCRACを用いたin vivoでのタンパク質-RNA相互作用ダイナミクスの高時間分解能モニタリング

このプロトコルは、小さなDNAおよびRNA基質上のポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)のキナーゼ活性を測定するための非放射性アッセイを記述する。...

小ヌクレオチド基質のポリヌクレオチドリン酸化を測定する非放射性アッセイ

学ぶRNA結合タンパク質PKRのRNAインタラクター同定法。ホルムアルデヒド架橋と免疫沈降を用いて哺乳類細胞周期中の転写後制御を解析し、神経変性疾患の病態理解に貢献する。

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

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