軸索抑制と再生を研究するラットモデルにおける顔面神経外科
2020年5月5日
このプロトコルは、様々な傷害パターンの記述を含む、ラットモデルにおける顔面神経手術への再現可能なアプローチを記述する。
このプロトコルは、科学者が顔面神経損傷後の結果と、多くの異なるパラメータ間の再生を改善する方法を研究するのに役立ちます。この技術の主な利点は、ラットの解剖学が顔面神経への容易なアクセスを可能にし、その大規模な我々は関連する傷害パターンのすべてを研究することができるということです。この技術の応用は、顔面神経損傷後の患者のリハビリテーションに向けて広がる。
再生電位として、ラットは再現性と簡潔な実験モデルを提供します。そして、この方法は、顔面神経麻痺または麻痺のための外科的および医学的療法への洞察を提供することができる。そして、それは他の頭頸部モデルまたは他の末梢神経に翻訳可能です。
両手を使って顕微鏡で操作するのは難しいかもしれません。顔面神経解剖を試みる前に、顕微鏡で双眼鏡版を使って練習することをお勧めします。足指ピンチに対する応答の欠如を確認した後、ラットの目に軟膏を塗布し、外科的領域を剃る。
ラットの識別方法を確立し、首の下にガーゼのロールを配置します。3つの交互のクロルヘキシジンと70%エタノールスクラブで露出した皮膚を消毒し、ラットをステレオ顕微鏡の下に置きます。前後方向にイプシラテリアを操作して、心房後皮膚の自然な折り畳みを決定します。
15本の刃を使って、耳下垂の折り目に2~3ミリメートルの切開を行います。切開の計画と配置は、傷のサイズを最小限に抑えながら顔面神経の確実な同定を確保するための最も重要なステップです。即時皮下筋膜を通して鈍く解剖し、組織暴露を高めるためにマイクロワイトラナーレトラクタを置く。
頭蓋骨の基部に沿って挿入に向かって劣った方向から優れた方向に移動する前の筋を識別します。筋肉挿入点に沿って筋肉の腹を通して穏やかに広がり、前部筋の腱を明らかにする。腱は、頭蓋骨の基部に固体挿入を持つ筋肉から発せられるフィルム状の白いプロセスとして表示されます。
前部筋と腱を同定した後、さらに筋肉の腹を引っ込めるためにワイトラナーレトラクターを調整します。露出した領域は顔面神経の主幹が横たわっている三次元空間である。左口の口腔の出口から遠位方向に神経に沿って解剖する。
クラッシュ傷害パターンを誘発するには、滑らかな表面のジュエラーの鉗子を使用して、一定かつ再現可能な圧力を適用する神経を30秒間しっかりとつかんで圧縮し、適切なクラッシュ傷害を確実にします。簡単なトランセクションの場合は、細かい歯の鉗子で神経の上に直接エピニューリウムをつかみ、鋭利なマイクロシザーを使用して、1回の切り口で所望のポイントで神経をきれいにトランセクトします。神経ギャップモデルの場合、調整可能なキャリパーを使用して、所望の神経神経ギャップ長を設定して、動物間の同様の傷害パターンを確保し、単に実証したように神経をトランセクトします。
実験的な傷害が送達された後、滅菌生理的な状態で創傷を灌漑し、滅菌ガーゼで組織を乾燥させる。制度的ガイドラインに従って皮膚切開を閉じる前に。ここで、顔面神経の主幹の生撮像は、成人トランスジェニックThy1-GFPラットにおける第1PESの分岐点に約2〜3ミリメートル遠位のクラッシュ傷害を伴って示されている。
傷害後1、2、3、および4週間での蛍光の徐々な復帰の評価は、これらのトランスジェニック動物における神経再生をモニタリングするためのマーカーとして使用することができる。ヒストモルフォメトリクス解析を使用して、軸索直径、破片の量、神経線維、神経の割合、および密度測定を定量化できる、限界下顎除算の断面画像を得ることができます。顔面神経を識別する際に、関連する解剖神経が見えるように、必要に応じてレトラクタの配置を頻繁に調整することが重要です。
この手順に従って、関連する神経および筋肉を免疫組織化学分析のために採取し、他の実験群に対する再生の程度を評価することができる。その開発に続いて、この技術は、顔の神経損傷後の機能的な結果を研究する研究者のための道を開きました。具体的には、シンキネシスの現象に影響を与える方法。
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概要
このプロトコルでは、ラットモデルにおける顔面神経手術の再現可能な手法について、特に損傷パターンと再生結果に焦点を当てて詳しく解説します。これにより、顔面神経損傷のリハビリテーションに向けた外科的手法および医学的治療の研究を促進します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 再生医療
- 動物モデル
背景
- ラットモデルを用いることで、顔面神経へのアプローチが容易になります。
- この手術手技は、神経損傷および再生法の評価に役立ちます。
- ラットの解剖学的特徴により、さまざまな損傷パターンの詳細な研究が可能です。
研究目的
- 顔面神経麻痺または不全麻痺に対する治療アプローチを評価すること。
- 顔面神経損傷後の再生に関する理解を深めること。
- 研究間で再現可能な詳細な手術手技を確立すること。
使用された手法
- 本研究では、顔面神経の手術的介入のためにラットモデルを用います。
- 主な処置には圧挫損傷と切断が含まれ、再現性を確保するために具体的な手術手順が詳述されています。
- 再生結果のモニタリングには、生体イメージングおよび組織形態計測学的解析が用いられます。
- 顕微鏡下での系統的な解剖が重視されており、熟練した技術と準備が必要です。
主な結果
- 顔面神経を適切に可視化し操作することで、再生プロセスの評価が可能になります。
- 蛍光イメージングと組織形態計測学的解析により、神経回復を定量的に測定できます。
- この手法により、神経損傷後の連合運動（シンキネシス）現象に関する重要な知見が得られます。
結論
- 本研究は、顔面神経損傷および再生を解析するための基礎的なプロトコルを確立するものである。
- これにより、研究者が神経リハビリテーションにおける機能的転帰や治療アプローチを探索することが可能となる。
- 本手法は、末梢神経研究におけるより広範な応用に向けて重要な意義を持つことを示している。
よくある質問
業界における重要性
ラット顔面神経損傷モデルは、軸索再生および抑制を評価するための再現性のあるプラットフォームを提供し、神経再生治療開発におけるターゲット検証を支援します。その拡張性と解剖学的なアプローチの容易さにより、損傷パターンと再生反応の一貫した評価が可能となり、神経栄養因子や抗抑制候補物質の前臨床段階でのリスク低減を促進します。このモデルは、ヒトの顔面神経修復戦略に関連する、定量可能な組織形態学的および機能的なリードアウトを提供することで、基盤研究とトランスレーショナルリサーチを橋渡しします。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 定義された神経挫滅、切断、またはギャップ損傷後の軸索抑制メカニズムおよび再生経路の解析を可能にする。
- 運用的価値： 神経活性試薬または細胞の一貫した導入をサポートし、ターゲットへの結合および経路変調の評価を可能にする。
- 予測的価値： 軸索径、繊維密度、およびデブリ除去の組織形態学的定量化により、ターゲットの有効性とメカニズム的なリスク低減のための客観的な指標が得られる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備状況：再生促進化合物や抑制的アンタゴニストの高再現性スクリーニングに適した、標準化された損傷モデルを構築します。
- 定量的出力：蛍光標識された軸索のライブイメージングと組織形態計測分析により、縦断的かつ定量的な再生追跡が可能です。
- 拡張性：ラットモデルは頭蓋内から頭蓋外の神経セグメントにわたる外科的操作に対応しており、多パラメータ評価をサポートします。
翻訳・前臨床研究
- 翻訳的連続性：顔面神経リハビリテーションにおける臨床的エンドポイントに合わせ、機能回復およびシンキネシスの軽減の評価を容易にします。
- 前臨床モデリング：疾患に関連する末梢神経系において、中枢または末端器官の操作および細胞療法の評価を可能にします。
- リスク調整済み進展：信頼性の高い生存率と種間の一貫性により、より高次な動物種への移行前のGo/No-go判断を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このモデルは、制御された神経損傷によるターゲット検証を可能にし、化合物スクリーニングのためのアッセイ開発へと進み、さらに機能的および構造的なアウトカム測定を通じて再生療法の前臨床評価を支援することで、創薬ワークフローに統合されます。
- 探索生物学：標準化された損傷パラダイムを用いて、軸索成長阻害剤および促進剤に関する仮説検証を促進します。
- スクリーニング：再生速度と忠実度に対する化合物の影響を評価するための、再現性のある神経損傷モデルを提供します。
- 分析：組織形態計測および蛍光ベースの読み取りにより、用量反応およびターゲット結合分析のための定量化可能なデータを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：軸索再生の指標を共同運動（synkinesis）などの機能的転帰に結びつけ、臨床的妥当性を裏付けます。
- 企業での再利用：複数の治療法や時点にわたる反復的な試験に利用可能な、再利用可能な外科的プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：定量可能で再現性のある損傷および再生指標を用いることで、軸索再生研究におけるメカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用の価値：標準化された手術手技および術後評価プロトコルにより、研究室間の整合性とデータの信頼性が向上します。
- 戦略的価値：標的生物学を明確にし、後期の神経再生プログラムにおける失敗リスクを低減させることで、早期のGo/No-go判断を可能にします。
- ポートフォリオへの影響：臨床的に関連性の高い末梢神経モデルにおける検証済み標的調節に基づき、リスク調整された神経再生候補物質の優先順位付けを可能にします。
実施上の留意点
- 顕微鏡下での誘導による、マイクロサージャリーの専門知識およびげっ歯類の神経解剖学への習熟が必要である。
- 標準化された損傷誘導のためには、マイクロワイトラナーリトラクター、精密ピンセット、マイクロシザーズ、および調節式キャリパーを含む専用器具への依存がある。
- 軸索の縦断的な追跡および組織形態学的解析のために、トランスジェニックリポーターライン（例：Thy1-GFP）または免疫組織化学的処理が必要となる。
- ラットの生存を確保し、再生評価における混在変数を最小限に抑えるための術後ケアプロトコルが求められる。
- マウスモデルと比較して遺伝的操作の可能性が限定的であるため、遺伝子ノックアウトまたは過剰発現アプローチによるメカニズムの解明が制限される可能性がある。
