Name: オンラインMRI画像のガイダンスの下でレソスマカクの皮質への光遺伝学アデノ関連ウイルスベクターの対流強化された配信 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶMRIガイダンス下の対流強化配布法によるレソスマカク皮質への光遺伝学ウイルスベクター導入。広範な神経活動操作と複雑な神経回路の理解に貢献する革新的アプローチを解説する。

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この研究は、米国心臓協会の博士後期フェローシップ(AY)、防衛先端研究プロジェクト庁(DARPA)の再編成と傷害回復を加速する可塑性によって支えられた(REPAIR;N66001-10-C-2010)、R01。NS073940、およびUCSF神経科学イメージングセンターによって。この研究はまた、賞番号K12HD073945、ワシントン国立霊長類研究センター(WaNPCR、P51 OD010425)の下で国立衛生研究所のユーニスケネディ震え国立研究所によってサポートされました。神経技術センター(CNT、グラントEEC-1028725の下で国立科学財団工学研究センター)。カミロ・ディアス・ボティア、ティム・ハンソン、ヴィクトル・カラジア、ダニエル・シルバースミス、カレン・J・マクレオド、ジュリアナ・ミラニ、ブレイクリー・アンドリュースが実験に協力してくれたことに感謝します。

すべての手順は、カリフォルニア大学サンフランシスコ大学、サンフランシスコ機関動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されており、実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠しています。8歳と7歳の成人男性の2匹のオスのカゲザルを用いて、それぞれ体重17.5kgと16.5kg(サルGとサルJ)を用いて以下の手順を行った。
注:すべての外科的処置のための標準的な無菌技術を使用する。
1. ベースラインイメージング
<ol><li>動物を鎮静し、挿管し、イソファランの下で全身麻酔を維持する(濃度は、呼吸数や心拍数などのバイタルサインに応じて、必要に応じて0〜5%の間で変化した)。動物の温度、心拍数、酸素飽和度、心電図応答、および手順全体を通してCO2の終末津波部分圧力を監視します。</li>
	<li>動物をMR互換の立体フレーム(材料の表を参照)に入れ、手順全体を通して残ります。動物をポータブルMR互換のイソファランマシンに接続し、MRIスキャナ(3T)に輸送します。</li>
	<li>標準T1(フリップ角度=9°、繰り返し時間/エコー時間=668.6、マトリックスサイズ=192 x 192 x 80、スライス厚さ=1mm)とT2(フリップ角度=130°、繰り返し時間/エコー時間=52.5、マトリックスサイズ=256 x 256 x 45、スライス厚=1mm)を取得 参照および外科計画のため。</li>
	<li>麻酔から動物を回復し、動物の住宅地に輸送します。</li>
	<li>後天したT1およびT2画像を使用して、開頭術の配置を決定します。開頭術の位置は、MRからの目的の皮質領域をマカクの脳アトラス(パキシノス、黄、ペドリド、トーガ2nd版)と一致させることによって正確に決定することができる。さらに、これらのベースライン画像は、ウイルス注入の位置の推定値を提供することができる。ここで示す目的の皮質領域は、M1 と S1 です。</li>
</ol>2. MR互換室注入
<ol><li>動物を鎮静し、挿管し、1.1のように標準的な麻酔モニタリングで全身麻酔を維持します。</li>
	<li>それは部屋の注入およびウイルスベクターの配達を通して残るMR互換の立体フレームに動物を置く。ポータブルMR互換イソファルランマシンに動物を接続します。</li>
	<li>メスで約5センチの長さで中間線から約2cmの矢状切開を作成します。</li>
	<li>エレベーターを使用して頭蓋骨から下にある軟部組織を取り除きます(「材料の表」を参照)。</li>
	<li>トレフィンを使用した注射用に事前に計画された軌道をカバーする円形開頭切開術(直径2.5cm)を作成します(「材料の表」を参照)。<ol>
<li>トレフィンの中心点を下げ、トレフィンの端を越えます。計画された頭蓋の中心にインデントを作成し、トレフィンの調整可能な中心点を使用してトレフィンを固定するために、頭蓋骨の十分に深い位置にインデントを作成します。これは、基礎となる神経組織に損傷を引き起こす可能性がありますので、頭蓋骨の深さを完全に貫通しないように注意してください。</li>
		<li>定期的に開頭術全体を通して組織の水分を維持するために必要に応じて生理生理生理生理で領域を洗い流します。</li>
		<li>中心が作られたら、トレフィンを頭蓋骨に下げ、トレフィンを時計回りに反時計回りに回転させ、骨キャップを鉗子で取り外すまで下向きの圧力を加えます。トレフィンで下層組織を損傷しないように注意してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>頭蓋切開の中心にある硬膜を通して細かい縫合糸(サイズ6-0)を通し、脳の表面から縫合糸をそっと引っ張って、頭蓋切開の中心にテントを作って、硬膜を持ち上げます。</li>
	<li>次に、脳にダメージを与えないように、細かい眼用ハサミを使用してテントの中心に近いデュラを穿刺します。その後、頭蓋骨の中心から端に硬膜をカットし、細かい眼科のはさみでエッジに沿って続けます。</li>
	<li>円筒形のカスタムメイドのCED MR互換チャンバー(図1;生産指示のセクション4を参照)を頭蓋骨に取り付け、CED注入中にカニューレサポートを提供し、チャンバーフランジの曲率が整列するようにします。頭蓋骨の曲率によく合う。</li>
	<li>プラスチックねじと歯科用アクリルまたは数本のチタンネジを使用して、頭蓋骨にインプラントを固定します。</li>
</ol>3. ウイルスベクター配信
<ol><li>MR互換チャンバーを埋め込み、カニューレ注入グリッド(図1A-B、補足図1)をチャンバーに挿入した直後に、MR解剖画像を介して注入位置を視覚化するための生理生理物(0.9%NaCl)でグリッドを埋め、次の点を考慮し、脳の水分を維持するために、湿った滅菌吸収性ゼラチンでチャンバーキャビティを充填する(図1F)。</li>
	<li>輸送およびMR注入の間にシリンダーの無菌性を維持するために無菌の抗菌切開ドレープで皮およびシリンダーをカバーする。ビタミンEカプセルを置き、注射グリッドの上部に陽性の同定を行います。</li>
	<li>動物が挿管されたままの間、麻酔回路から気管内チューブを取り外し、ポータブルMR互換イソファランマシンに再接続し、動物をMRIスキャナに輸送します。</li>
	<li>T1画像(フリップ角度=9°、繰り返し時間/エコー時間=668.6、マトリックスサイズ=192 x 192、スライス厚さ=1mm、80スライス)を取得して、射出グリッドと皮質表面の上部からの距離を計算します。ビタミンEカプセルはT1画像ではっきりと見え、注射グリッドの上部のマーカーとして使用する必要があります(図2A)。MRイメージングソフトウェアの定規ツールを使用して、射出グリッドの上部と皮質面との間の距離を測定します。</li>
	<li>T2画像(フリップ角度=130°、繰り返し時間/エコー時間=52.5、マトリックスサイズ=256 x 256、スライス厚さ=1mm、45スライス)を取得し、注入の標的部位に基づいて各部位に最適なカニューレガイドを決定します(図2B-C)。前述のように、カニューレグリッドはT2画像で最もよく見える生理生理生理物で満たされています。MRイメージングソフトウェアを使用して、冠状動脈面と矢状面をスクロールして、注入の標的位置を見つけます。</li>
	<li>室温で数時間ウイルスベクターを解凍した後、ウイルスベクターをMR造影剤ガドテッリドール(250:1;2mM Gd-DTPAの比率、材料の表を参照)をピペットまたは渦混合で混合します。 注:提示された技術は、EYFPに融合したC1V1のカムキアプロモーター駆動発現を用いてAAVベクターについて試験した(AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP、力体:2.5 x 1012ウイルス分子/mL;材料の表を参照)。</li>
	<li>混合ウイルスを0.2 mL高圧IVチューブにロードします(材料の表を参照)。</li>
	<li>ウイルス注入ラインを準備するためのMRスキャナの外に滅菌フィールドを確立します。</li>
	<li>高圧IVチューブを使用して、長い延長線(MRボアに対する注入ポンプの位置に応じて約3〜5メートル)をMR互換の3 mLシリンジと生理生理物でプライムに接続します。</li>
	<li>長い延長線の遠位端をウイルスを搭載した0.2 mL IVチューブの近位端に接続し、還流耐性カニューレを1mmのステップチップ(図2D;カニューレ生産指示のセクション5を参照)を遠位端に取り付けます。クランプスタイルのカテーテルコネクタを備えたこのアセンブリ(材料の表を参照)(図2E)。</li>
	<li>最後に、MR互換ポンプに注射器をセットします(材料の表を参照)。ポンプコントローラはMR互換ではないため、スキャナー制御室に置きます。</li>
	<li>前に得られたベースライン解剖学的MR画像を使用して、カニューレ注入グリッド位置と標的注入部位に到達するために必要な挿入深度を選択します。無菌テープを使用してカニューレの挿入深さをマークします。</li>
	<li>1 μL/minの速度で注入を開始し、カニューレ先端からの流体の排出を観察することにより、注入ライン内の流体の流れを視覚的に検証します。</li>
	<li>注入ラインの流れを維持しながら、注入グリッドを通してカニューレを手動で注入を挿入し、挿入中に浸透した組織がカニューレを詰まらせるのを防ぎます。</li>
	<li>ウイルスベクトル注入のオンライン監視のための高速(2分)フラッシュT1加重画像(フリップ角度=30°、繰り返し時間/エコー時間=3.05、マトリックスサイズ=128 x 128、スライス厚さ= 1mm、64スライス)を取得します。</li>
	<li>MRスキャナで検出するのに十分なウイルスが注入されるようなベクターを~10μL注入した後、MR画像を取得し、ウイルスの観察された広がりによって明らかなように正しいカニューレの配置を確認する。挿入されたカニューレの深さが正しくない場合は、それに応じて深さを調整するか、カニューレをゆっくりと取り外し、3.12 のように挿入を再試行します。</li>
	<li>オンラインMR画像(フラッシュT1加重)のガイダンスを介して注入を監視し、注入速度を数分ごとに1 μL/minステップで5 μL/minに増加させます(図3A)。</li>
	<li>ウイルスベクターの約40μLを注入した後、注入速度を1μL/minステップで減少させ始め、約50μLを注入した後に注入を停止し、カニューレを10分間所定の位置に残す。</li>
	<li>ゆっくりと脳からカニューレを取り除き、次の場所に移動します。場所ごとに 3.9 ~ 3.19 の手順を繰り返します。</li>
	<li>動物輸送の前に、注射の終わりに無菌ドレープでシリンダーをカバーします。その後、手術室に動物を輸送します。</li>
	<li>MR互換室を切除し、骨フラップを交換し、筋肉を覆い、標準的な無菌技術を使用して皮膚を縫合するか、チタンシリンダーおよび人工硬膜でチャンバを交換することによって外科的切開を閉じる(参照してください(ヤズダン・シャーモラドら 20169) 神経記録と刺激のため。</li>
</ol>4.MR互換チャンバー生産
<ol><li>ナイロンカニューレ射出グリッド(図1A-B)を指定寸法に従って加工して製作する(補助図1)。</li>
	<li>3Dは、アクリロニトリルブタジエンスチレン(ABS0プラスチック(図1C-E)からMR互換シリンダーをプリントします(補足ファイル1-3を参照してください;3Dプリンタおよび材料の材料の表を参照)。 注:1 つの設計は、MR 互換シリンダ内の固定カニューレ注入グリッド (図 1C)を維持し、別の設計では、射出領域を拡張してグリッドを回転させることができます (図 1D-E)。</li>
	<li>カニューレ射出グリッドを通し、両方の部分が同じねじりを示すようなMR互換チャンバの対応する空洞をタップします。 注:両方のコンポーネントが同じスレッドを持つ場合は、任意の種類のスレッドを使用できます。</li>
	<li>MR互換シリンダのタップ穴にねじ込んでナイロンカニューレ射出グリッドを挿入します。</li>
</ol>5. 還流耐性カニューレ生産13
<ol><li>カミソリの刃を使って、内側のシリカチューブ用に0.32mm IDと0.43mm ODで30cm長のシリカチューブを切断します(材料の表を参照)。</li>
	<li>外シリカチューブ用に長さ7.5cm、長さ5cmのシリカチューブを0.45mm ID、0.76 mm ODで切断します(材料の表を参照)。</li>
	<li>内管が外管を1mm伸ばすようなシアノアクリレートで30cmの内側チューブに7.5cmの外側チューブを付け、還流に強い工程を作ります(図2D)。シアノクリレートが内側のチューブの内側に入らないようにするには、カニューレ先端から遠く内側のチューブの外側にシアノクリレートを置きます。</li>
	<li>クランプスタイルのカテーテルコネクタに取り付ける場合は、5cm長のシリカチューブを内側チューブのもう一方の端に貼り付けます(ステップ3.10を参照)。</li>
</ol>

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</ol>

PNSは、脳刺激を用いて臨床療法を開発しているNeuralink社に金銭的な関心を持っています。

ここでは、MR誘導CEDによるNHP原発性身体感覚および運動皮質における大規模な光遺伝学発現を達成するための実現可能かつ効率的な手法を概説する。MR誘導CEDの使用は、NHP脳におけるウイルス注入の従来の方法に対して重要な利点を提示する。そのような利点の1つは、必要な注入が少ない大きな領域に対して発現を達成する能力である。例えば、従来の方法では、2〜3mm径領域1、2、5、17におけるベクトル降伏発現の1〜2μLの複数の注射。大規模ベクタースプレッドの達成に向けたこれまでの試みは、複数の注射で約10mm3の発現量を生み出したが、ここでは、わずかな注入で200mm3以上の発現を達成する方法を提示する。. CEDによる50 μLの単一注入は皮質CED9</sup...

光遺伝学は、神経活動の操作と脳内のネットワーク接続の研究を可能にする強力なツールです。この技術を非ヒト霊長類(HPS)に実装することで、霊長類の脳における大規模な神経計算、認知、行動に対する理解を深める可能性があります。光遺伝学は近年、NGPで成功裏に実施されているが、1,2,3,4,5,6,7,研究者は、これらの動物の大きな脳領域全体で高いレベルの発現を達成しています。ここでは、マカクザルの皮質の広い領域にわたって高レベルの光遺伝学的発現を達成するための効率的で簡素化されたアプローチを提供しています。この技術は、最先端の記録8、9および光学刺激10技術と組み合わせて、これらの動物の現在の光遺伝学的研究を改善する大きな可能性を秘めています。
対流増強送達(CED)は、中枢神経系11、12、13への薬理学的薬剤および他の大きな分子、ウイルスベクターを含む送達の確立された方法である。従来の送達方法は、脳の小さな領域に分散する複数の少量注入を伴うのに対し、CEDはより少ない注入でより広範で、より均一な薬剤分布を達成することができる。注入中の圧力駆動バルク流体流れ(対流)により、CEDを用いてウイルスベクターを送送る際に、標的組織のより広く均一に分散されたトランスダクションを可能にします。最近の研究では、磁気共鳴(MR)誘導CEDを用いて、一次運動(M1)および身体感覚(S1)コルチス9および視床14の大領域の経発性およびその後の光遺伝学的発現を実証した。
ここでは、皮質注射が少ない大きな皮質領域にわたって光遺伝学的発現を達成するためにCEDの使用を概説する。

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 高圧 IV チューブ</td><td>Smiths Medical Inc., Dublin, OH, USA</td><td>533640</td><td></td></tr><tr><td>0.32 mm ID, 0.43 mm OD Silica</td><td>Tubing Polymicro Technologies</td><td>1068150027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm ID, 0.76 mm OD Silica Tubing</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFP</td><td>Penn Vector Core, University of Pennsylvania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABSプラスチック</td><td>Stratasys、MN、USA</td><td>ABSplus-P430</td><td></td></tr><tr><td>抗菌性切開ドレープ</td><td>3M</td><td>6650EZ</td><td>Ioban ドレープ</td></tr><tr><td>歯科用アクリル</td><td>Henry Schein, Inc.</td><td>1013117</td><td>アクリルボンディングエージェント</td></tr><tr><td>エレベーターVWR</td><td>インターナショナル、LLC。</td><td>10196-564</td><td>ランゲンベックエレベーター、ワイドチップ</td></tr><tr><td>ファイン縫合</td>糸 <td>McKesson Medical-Surgical Inc.</td><td></td><td></td>1034505</tr><tr><td>Gadoteridol</td><td>Prohance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>光刺激用レーザー</td><td>Omicron-Laserage, Germany</td><td>PhoxX 488-60</td><td></td></tr><tr><td>MR compatible 3 cc syringe</td><td>Harvard apparatus, Holliston, MA, USA</td><td>59-8377</td><td></td></tr><tr><td>MR イメージングソフトウェア</td><td>Pixmeo</td><td>OsiriX MD 10.0</td><td></td></tr><tr><td>MR-Compatibleポンプ</td><td>ハーバード装置、マサチューセッツ州ホリストン、米国</td><td>ハーバードPHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>MR互換定位固定フレーム</td><td>KOPF</td><td>1430M MRI</td><td></td></tr><tr><td>ペリフィックスクランプスタイルカテーテルコネクタ</td><td>B-ブラウン、ベツレヘム、ペンシルベ</td>ニア州、米国 <td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックネジ</td><td>プラスチック 1</td><td>0-80 x 1/8N</td><td>ナイロンネジ</td></tr><tr><td>チタンネジ</td><td>Crist Instrument Co., Inc.</td><td>6-YCX-0312</td><td>セルフタッピング骨ネジ</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>GerMedUSA</td> <td>Inc,SKU:GV70-42</td><td></td></tr><tr><td>uPrinter SE 3Dプリンター</td><td>Stratasys, MN, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin E Capsule</td><td>Pure Encapsulations, LLC.</td><td>DE1</td><td></td></tr><tr><td>湿式滅菌吸収性ゼラチン</td><td>ファイザー社</td><td>AZL0009034201</td><td>ジェルフォーム</td></tr></tbody></table>

オンラインmri画像のガイダンスの下でレソスマカクの皮質への光遺伝学アデノ関連ウイルスベクターの対流強化された配信

Convection Enhanced Delivery of Optogenetic Adeno-associated Viral Vector to the Cortex of Rhesus Macaque Under Guidance of Online MRI Images

非ヒト霊長類(NHP)光遺伝学では、ウイルスベクターを持つ大きな皮質領域に感染することは、しばしば困難で時間のかかる作業です。ここでは、光遺伝学的ウイルスベクターの磁気共鳴(MR)誘導対流増強送達(CED)を一次体感覚(S1)および運動(M1)皮質の効率的で広範な皮質発現を得ることを実証する。光感受性イオンチャネル。黄色蛍光タンパク質(EYFP)に融合した赤色シフトオプシンC1V1をコードするアデノ関連ウイルス(AAV)ベクターをMR誘導CED下のレッサスマカクザルの皮質に注入した。輸液後3ヶ月間、エピ蛍光イメージングは、M1およびS1の光遺伝学発現の大きな領域(>130 mm2)を2つのマカクで確認した。さらに、マイクロエレクトロコルチコグラフィーアレイを用いて発現領域からの信頼性の高い光誘発電気生理学応答を記録することができました。その後、レポーターに対する組織学的分析および免疫染色は、エピ蛍光イメージングによって示される分布に対応するM1およびS1における広範囲かつ緻密な光遺伝学発現を明らかにした。この技術により、従来の技術に比べて損傷を最小限に抑えながら、より短い期間で皮質の広い領域にわたって発現を得ることができ、HOPなどの大型動物における光遺伝学的ウイルス送達に最適なアプローチとなり得ます。このアプローチは、進化的に人間に近い動物モデルにおいて細胞型特異性を有する神経回路のネットワークレベル操作の大きな可能性を示す。

MRIガイダンスに下記の対流強化配信(CED)
ウイルスベクターの広がりは、オンラインMR画像の指導の下でCED注入中にモニタリングされた(図3A)。本研究では、2匹のサルのS1とM1を標的とした(図3B)。Yazdan-Shahmorad et al. 20169で説明したMR画像(図3C)のポストホック解析で3次元分布量を推定し、皮質の広い領域のカバレッジを確認した。サルGのM1注入は、時間の制約のためにMRガイダンスなしで行われました。
ウイルス発現の検...

ここでは、マカク脳の大きな皮質領域にわたって光遺伝学的発現を達成するための効率的かつ簡素化されたアプローチとして、皮質へのウイルスベクターの磁気共鳴(MR)誘導対流増強送達(CED)を示す。

オンラインMRI画像のガイダンスの下でレソスマカクの皮質への光遺伝学アデノ関連ウイルスベクターの対流強化された配信

In non-human primate (NHP) optogenetics, infecting large cortical areas with viral vectors is often a difficult and time-consuming task. Here, we ...

非ヒト霊長類の光遺伝学的ウイルスベクターの対流強化送達(CED)により、研究者は神経活動を大規模に操作して複雑な神経計算および行動を理解できるようになる。CEDを使用すると、従来の方法と比較して短時間でわずかな注射で霊長類脳の大きな領域にわたって高い光遺伝学的発現を達成することができます。磁気共鳴またはMR適合チャンバー移植は、非ヒト霊長類手術において標準的な練習を使用して行われ、この手順は、このビデオで簡単に概説されるテキストプロトコルで詳細に説明される。テキストプロトコルに記載されているように動物の沈殿、位置決め、および初期切開に続いて、トレフィンを使用して注射のための事前計画された軌道をカバーする円形頭蓋切開術を作成する。計画された頭蓋骨の中心に十分に深い頭蓋骨の内側にインデントを作成し、トレフィンの調整可能なセンタリングポイントを使用してトレフィンを固定します。中央ができたら、トレフィンを頭蓋骨に下げ、骨キャップを鉗子で取り外すまで下圧を加えながら、トレフィンを時計回りに反時計回りに回転させます。テキストプロトコルに詳述されているように硬膜を持ち上げた後、頭蓋切除術の中心から端まで硬膜を切断し、細かい眼科はさみで端に沿って続けます。チャンバーフランジの曲率が頭蓋骨の曲率とよく一致するように注入中にカニューレサポートを提供するために、頭蓋骨の上に頭蓋骨の上に頭蓋骨に対流を強化した配信MR互換チャンバーをマウントします。プラスチック製のネジと歯科用アクリルまたはいくつかのチタンねじを使用して、インプラントを頭蓋骨に固定します。MR互換チャンバーを移植し、チャンバーにカニューレ注入グリッドを挿入した後すぐに、MR解剖画像を介して注入位置を視覚化するための0.9%の生理学でグリッドを埋める。また、脳の水分を維持するために、濡れた滅菌吸収性ゲルフォームでチャンバーキャビティを満たします。輸送およびMR注入の間にシリンダーの無菌性を維持するために無菌の抗菌性の切開のドレープで皮およびシリンダーを覆う。ビタミンEカプセルを入れ、正の識別のために注射グリッドの上部をマークします。動物が挿管されたままの間、麻酔回路から気管チューブを取り外し、ポータブルMR互換イソフルランマシンに再び取り付けます。MRIスキャナーに動物を輸送します。T1 画像を取得して、射出グリッドの上部と皮質表面からの距離を計算します。ビタミンEカプセルは、T1画像ではっきりと見える、注射グリッドの上部のマーカーとして使用する必要があります。T2画像を取得し、輸液の対象部位に基づいて各部位の最適なカニューレガイドを決定します。カニューレグリッドは、T2画像で最もよく見える生理生理が満たされています。MRイメージングソフトウェアを使用して、コロナと矢状の平面をスクロールして、注入のターゲット位置を見つけます。ウイルスベクターを室温で数時間解凍した後、ピペットまたは渦混合によりMR造影剤ガドテリドールとウイルスベクターを混合する。混合ウイルスを0.2ミリリットル高圧IVチューブにロードします。高圧IVチューブを使用して、長い延長線をMR互換の3ミリリットルシリンジと生理食塩水と素数に接続します。長い延長チューブのもう一方の端を、ウイルスに搭載された0.2ミリリットルのIVチューブに接続します。次に、還流抵抗力のあるカニューレをクランプスタイルのカテーテルコネクタを使用して、このアセンブリの遠位端に1ミリリットルの階段状の先端を取り付けます。最後に、MR互換ポンプにシリンジをセットします。得られたベースライン解剖学的MR画像を用いて、カニューレ注入グリッドの位置と、標的注入部位に到達するために必要な挿入深度を選択する。滅菌テープを使用してカニューレの挿入深さをマークします。1分間に1マイクロリットルの速度で注入を開始し、カニューレ先端からの流体の放出を観察することによって、注入ライン内の流体の流れを視覚的に検証する。注入ラインの流れを維持しながら注入グリッドを通してカニューレを手動で挿入すると、注入ライン内の流れが挿入中にカニューレを詰まらせるのを防ぎます。今、ウイルスベクター注入のオンライン監視のための高速フラッシュT1加重画像を取得します。MRスキャナで検出するのに十分なウイルスが注入されるようにベクターの約10マイクロリットルを注入した後、観察されたウイルスの広がりに明らかなように正しいカニューレ配置を検証するMR画像を取得する。挿入されたカニューレの深さが間違っている場合は、それに応じて深さを調整するか、ゆっくりとカニューレを取り外して挿入を再試行してください。オンラインMR画像のガイダンスを介して注入を監視します。注入速度を数分ごとに毎分1マイクロリットルずつ毎分5マイクロリットルに増やします。注入速度をゆっくりと上げ、高い注入速度が組織損傷を引き起こす可能性があるため、1分間に5マイクロリットルを超えないようにすることが重要です。約40マイクロリットルのウイルスベクターを注入した後、1分間のステップで1マイクロリットルの注入速度を低減し始める。約50マイクロリットルを注入した後、注入を停止します。カニューレを10分間所定の位置に置いておきます。ゆっくりと脳からカニューレを削除し、次の場所に移動します。動物輸送前の注射の終わりに無菌ドレープでシリンダーを覆い、その後、手術室に戻って動物を輸送します。連続コロナセクションの組織学的分析は、輸液部位の周りの大規模な光遺伝学的発現を明らかにする。ここに示されているのが、同じMRコロナスライスに対する注入後の造影剤のベースラインコロナMR画像と広がりである。コロナ組織部はほぼ同じから示される。ペルオキシダーゼ染色は、黄色蛍光タンパク質またはEYFPレポーターの発現を反映する。表面エピフルーレセンスと組織学的染色で測定されたEYFP発現の領域間で良好なアライメントが観察される。これらには、MR画像から推定されるベクトル拡散の領域が含まれる。白い点は注射部位を示し、黒い領域全体が頭蓋骨切り出しによって露出した領域を表す。ここに示されているのは、体性感覚皮質におけるYFP発現の内側側側面を示す抗GFP抗体で染色されたコロナ切片の低倍率画像である。黒い矢印はカニューレトラックの位置を示します。隣接する組織は、YFP陽性細胞の層分布を示すために、より大きな倍率で示される。YFP陽性細胞の人口密度の高い領域は、主に2〜3、5〜6の層に位置しています。さらに拡大すると、2 ~ 3、レイヤ 5、およびレイヤ 6 の典型的なピラミッド型セルが明らかになります。カニューレは、流れが止まった後10分間、そのままにしておいていることが重要です。これにより、ウイルスが周囲の標的となる神経組織に浸透することが保証されます。CEDは、哺乳類の大きな脳領域全体で均一に高い発現レベルを達成するための効率的なアプローチです。これは、神経回路と接続性に関する理解を広げる可能性を秘めています。CEDによるウイルス伝達後、その後の光遺伝学的刺激実験を電気記録および行動エッセイと組み合わせ、脳内の複雑な回路ダイナミクスを明らかにすることができる。この技術は、2018年にYazdan-Shahmoradらの研究グループによって採用されており、光遺伝学的神経変調が感覚運動皮質のネットワーク全体の接続性変化を誘導するために使用されました。

convection-enhanced-delivery-optogenetic-adeno-associated-viral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ここでは、視覚野の神経細胞とグリア細胞の蛍光標識用AAVベクターの頭蓋内注射を提示する。...

アデノ随伴ウイルスベクターの頭蓋内注射

遺伝学と光学系を組み合わせた神経科学のツールの最近の開発は、空間的および時間解像度の前例のないレベルの神経回路の活動を制御することができ、「光遺伝学」と呼ばれる。ここでは、前頭前皮質及びsubicular錐体ニューロンの遺伝的に定義されたサブセットのoptogenetic操作で、生体内の記録に統合するためのプロトコルを提供する。...

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

このプロトコルは、光遺伝学的機能的磁気共鳴画像法(ofMRI)を成功させるために必要なステップとデータ分析を説明しています。ofMRIは、高磁場fMRIの読み出しと光遺伝学的刺激を組み合わせた新しい技術であり、機能的な神経回路とそのダイナミクスを生きた脳全体にわたって細胞タイプ特異的にマッピングすることを可能にします。...

光遺伝学機能MRI

このビデオは、Thy1-GFPトランスジェニックラインのin vivo...

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

現在実施されているように、非ヒト霊長類のオプトジェネティクスは、脳へのウイルスベクターの注射を必要とします。最適な注入方法は、信頼性が高く、多くのアプリケーションにとって、死後の組織学で容易かつ明確に特定される任意の深さの個々の部位を標的にできる必要があります。これらの特性を有する注入方法が提示される。...

非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのAAVベクターの注射

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングするためのアデノ随伴ウイルス注入と頭蓋窓移植を組み合わせたプロトコルについて説明します。...

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

くも膜下ウイルスの注入を使用するアデノ随伴ウイルスの広範な送達のための新しい技術が記載されています。この方法は、マウス新皮質ニューロンの表層への広範な形質導入を保証するだけでなく、非選択的プロモーターを使用した場合でも、第5層錐体ニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現をもたらします。...

AAV2のくも膜下注射によるマウス新皮質ニューロンの広範な形質導入

このプロトコルは、ウイルスの送達、視球体の着床、光血栓誘導、アストロサイトおよびニューロン活動の同時記録、アストロサイトのオプトジェネティック刺激を含む統合的な手法を提供します。この統合手法は、虚血性脳卒中の急性期から慢性期にわたり、アストロサイトとニューロンの関係を同時に調査することを目的としています。...

振る舞うマウスの神経細胞およびアストロサイト活動の光血栓性脳卒中モデリングおよび in vivo 光学記録のための統合手法

手順は脳波、筋電図、脳乳酸濃度が監視されながらoptogenetically大脳皮質錐体ニューロンの活動を操作するために記述されている。彼らは自発的睡眠/覚醒サイクルを受けながら、実験的な録音はケーブルつながマウスで実行されます。...

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

学ぶMRIガイダンス下の対流強化配布法によるレソスマカク皮質への光遺伝学ウイルスベクター導入。広範な神経活動操作と複雑な神経回路の理解に貢献する革新的アプローチを解説する。

オンラインMRI画像のガイダンスの下でレソスマカクの皮質への光遺伝学アデノ関連ウイルスベクターの対流強化された配信

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