Name: 成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学ぶ成人海馬神経前駆細胞の回路特異的調節法。ケモジェネティック操作により神経幹細胞の増殖と神経新生への影響を評価し、組織切片と免疫組織化学を用いて神経回路の調節メカニズムを解明する。

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L.J.Q.は、ダイバーシティサプリメントR01MH111773の下で国立衛生研究所の精神保健研究所によってサポートされただけでなく、T32トレーニング助成金T32NS007431-20。このプロジェクトは、NIH(MH111773、AG058160、NS104530)からJ.S.に授与された助成金から支援されました。

<ol><li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132 (4), 645-660 (2008).</li>
<li>Spalding, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+hippocampal+neurogenesis+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans.</a> Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).</li>
<li>Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Adult+Hippocampal+Neurogenesis+is+Sufficient+to+Reduce+Anxiety+and+Depression-Like+Behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors.</a> Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).</li>
<li>Clelland, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325, (2009).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).</li>
<li>Anacker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurogenesis+confers+stress+resilience+by+inhibiting+the+ventral+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus.</a> Nature. , 1(2018).</li>
<li>Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+Phenotypic+Characterization+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).</li>
<li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+and+Multiple+Labeling+with+Antibodies+from+the+Same+Host+Species+to+Study+Adult+Hippocampal+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).</li>
<li>Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+S-Phase+Labeling+of+Dividing+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis%3A+Paradigms%2C+pitfalls%2C+limitations%2C+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).</li>
<li>Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Optogenetic+Stimulation+of+the+Rodent+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+Optogenetics+in+Neural+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primer Optogenetics in Neural Systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mossy+Cells+Control+Adult+Neural+Stem+Cell+Quiescence+and+Maintenance+through+a+Dynamic+Balance+between+Direct+and+Indirect+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways.</a> Neuron. , 1-18 (2018).</li>
<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+Stereotaxic+Surgery+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).</li>
<li>Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+DREADDs+for+Neuroscientists%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Primer DREADDs for Neuroscientists.</a> Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).</li>
<li>Zeng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+5-ethynyl-2+%E2%80%B2+-deoxyuridine+staining+as+a+sensitive+and+reliable+method+for+studying+cell+proliferation+in+the+adult+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system.</a> Brain Research. 1319, 21-32 (2010).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).</li>
<li>Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+an+effective+method+to+detect+and+identify+progenitor+cell+types+during+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis.</a> J Vis Exp. , (2013).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
<li>Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+the+adult+rat%3A+age-related+decrease+of+neuronal+progenitor+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).</li>
<li>Gomez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetics+revealed%3A+DREADD+occupancy+and+activation+via+converted+clozapine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine.</a> Science. 357 (6350), 503-507 (2017).</li>
<li>Thompson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dreadd+Agonist+21+%28C21%29+Is+an+Effective+Agonist+for+Muscarnic-Based+Dreadds+in+Vitro+and+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Pharmacology+%26+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo.</a> ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).</li>
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著者は何も開示していない。

このプロトコルの目的は、特定の神経回路を操作すると、一連の免疫組織化学技術を使用して生体内の成体海馬神経新生を調節する方法を評価することです。特定の神経回路によって媒介される成人神経新生のアッセイ活性依存調節は、多様な神経回路を研究するための修飾のための大きな可能性を有する貴重な技術である。これらのタイプの実験の成功は、正確なウイルス送達、所望の操作のための適切なウイルス選択、チミジンアナログの適切な送達、動物の年齢、免疫染色効率、成功を含む複数の要因に依存します。トランスカルダイヤル灌流、および画像の公平な定量化。例えば、不正確なウイルス送達は、問題の回路とは無関係の表現型をもたらすターゲット効果をオフに引き起こす可能性があります。さらに、低品質の免疫蛍光技術は、現在の細胞の真の数を隠し、したがって生物学的に関連しない表現型を産生しうる。制御するもう一つの非常に重要な要因は、成人神経新生が年齢依存性22であることを考慮して、実験を行う際のマウスの年齢である。最後に、各セクションが公平に採点されることが重要です。バイアスを減らすために、体系的なアプローチを取り、人が形態学的情報を使用して成...

成人神経新生は、新しいニューロンが成人で生まれ、既存のニューラルネットワーク1に統合される生物学的プロセスである。ヒトでは、このプロセスは海馬の歯状ジャイル(DG)で起こり、そこでは毎日約1,400個の新しい細胞が2日に生まれる。これらの細胞は、神経原性ニッチを有するDGの内側の部分に存在し、粒状帯(SGZ)と呼ぶ。ここでは、海馬成人神経幹細胞(NSC)は、学習と記憶、気分調節、ストレス応答を含む特定の脳機能の調節に寄与する完全に機能するニューロンになるために複雑な発達過程を経る3 ,4,5,6.行動に影響を与えるために、成人NSCは、局所的および遠位的な化学的手がかりの配列に応答することにより、活動依存的な方法で様々な外部刺激によって高度に規制されています。これらの化学的手がかりは、神経伝達物質と神経調節剤を含み、様々な脳領域から回路固有の方法で作用します。重要なことに、NSC上のこれらの化学的手がかりの回路広い収束は、幹細胞の活性化、分化、および運命の決定のユニークで正確な調節を可能にします。
生体内の成人NSCの回路調節を調知する最も効果的な方法の1つは、免疫蛍光解析と回路広い操作を組み合わせることによってです。成体NSCの免疫蛍光分析は、特定の分子マーカーに対する抗体が成人NSCの発達段階を示すために使用される一般的に利用される技術である。これらのマーカーには、ラジアルグリア細胞および初期神経前駆マーカーとしてのネスチン、中間前駆マーカーとしてのTbr2、神経芽細胞および未熟ニューロンマーカー7としてのdcxが含まれる。さらに、BrdU、CidU、Idu、およびEduなどのチミジン類似体を投与することにより、S相を受けている細胞集団を個別に標識および可視化することができ、8、9、10である。これら2つのアプローチを組み合わせることで、特定の発達段階での増殖がどのように調節されるのか、様々な手がかりがNSC分化や神経新生にどのように影響するかまで、幅広い疑問を調査することができます。
電気刺激、光遺伝学、化学遺伝学などの神経回路を効果的に操作するには、それぞれに長所と短所を持ついくつかのオプションがあります。電気刺激は、電極が後で標的脳領域を調節するために電気信号を送信するために使用される特定の脳領域に移植される広範な手術を伴う。ただし、このアプローチにはセルラーと回路の両方の特異性が欠けています。光遺伝学は、埋め込まれた光ファイバーを通して放出されるレーザーによって刺激される光活性化受容体をコードするウイルス粒子の送達を含むが、広範な操作、大きなコスト、および複雑な手術を必要とする11。化学遺伝学は、デザイナー薬またはDREADDsによって排他的に活性化されるデザイナー受容体をコードするウイルス粒子の送達を含み、その後、クロザピンN-オキシド(CNO)として知られている特定の生物学的不活性リガンドによって活性化される12.DREADDを利用して成人NSCを調節する局所的な神経回路を操作する利点は、CNO管理の容易さと様々な経路にあります。これにより、動物の取り扱いを減らして時間のかかるアプローチが可能となり、神経回路を調節するための長期研究に容易に適応できます。
このプロトコルに記載されているアプローチは、免疫蛍光技術と回路操作の両方を組み合わせた成人海馬神経新生の回路調節を正常に調知するために必要な様々なプロトコルの包括的なコレクションです。化学遺伝学を使用して。以下のプロトコルに記載の方法は、成体神経新生に対するそれらの調節機能を決定するために、生体内で同時に1つまたは複数の回路を刺激または阻害するのに適している。この方法は、質問に高度な時間分解能が必要ない場合に最適です。特定の周波数での刺激/阻害の正確な時間的制御を必要とする質問は、光遺伝学13、14を使用してより良い対処することができる。ここで説明するアプローチは、特にストレスが主要な懸念事項である場合、最小限の動物の取り扱いを伴う長期的な研究に容易に適合する。

<table><tbody><tr><td>24ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>48ウェルプレート</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>T1049</td><td></td></tr><tr><td>5-エチニル-2'-デオキシウリジン (Edu)</td><td>カルボシンス</td><td>NE08701</td><td></td></tr><tr><td>アルコール 70% イソプロピル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>アルコール準備パッド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-680-63</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-488 アジド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A10266</td><td></td></tr><tr><td>アンチチキン ネスティン</td><td>アベス</td><td>NES;RRID:AB_2314882</td><td></td></tr><tr><td>アンチヤギDCX</td><td>サンタクルーズ</td><td>猫#SC_8066;RRID: AB_2088494</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス TBR2</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-4875-82;RRID: AB_11042577</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Solution (povidone-iodine)</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citiric Acid Stock [.1M] クエン酸 (21g/L クエン酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>Clozapine N- Oxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C08352-5MG</td><td></td></tr><tr><td>共焦点ソフトウェア (Zen Black)</td><td>Zeiss Microscopy</td><td>Zen 2.3 SP1 FP1 (black)</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅 (II)五水和物</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AC197722500</td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>アマゾン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>M1100-02</td><td></td></tr><tr><td>デリケートタスクワイプ キムワイプ</td><td>キムテックサイエンス</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>ドリルビット 0.5 mm</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>19007-05</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>E178-1</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン ニードル 2 インチ</td><td>Hmailton Company</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトン シリンジ 5 &mu;Lモデル75 RN</td><td>Hmailton Company</td><td>Ref: 87931</td><td></td></tr><tr><td>高速ドリル</td><td>Foredom</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>輸液</td><td>ハーバード装置</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>注射可能な生理食塩水</td><td>マウンテンサイド ヘルスケア</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>BD 超微細インスリン注射器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ヘンリーSchein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>Stereotax For Small Animal</td><td>KOPF Instruments</td><td>Model 942</td><td></td></tr><tr><td>Leica M80</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780</td><td>Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nair (Hair Removal Product)</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldahyde 4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>158127</tr><tr><td>Plus Charged Slide</td><td>Denville Scientific</td><td>M1021</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Solution (PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 軟膏</td><td>Puralube</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライドラック 20 スライドユニット</td><td>電子顕微鏡 Science</td><td>70312-24</td><td></td></tr><tr><td>スライドラックホルダー</td><td>電子顕微鏡 Science</td><td>70312-25</td><td></td></tr><tr><td>小動物用ヒーティングパッド</td><td>K&H</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Super PAP Pen 4 mm tip</td><td>PolySciences</td><td>24230</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scalpel</td><td>MedPride</td><td>47121</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Solution (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912</td><td></td></tr> ク<tr><td>エン酸三ナトリウム ストック [0.1 M] クエン酸三ナトリウム (29.4g/L クエン酸三ナトリウム)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr>ピン<tr><td>セット</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>獣医ボンド組織接着剤3M</td><td></td><td>1469SB</td><td></td></tr></tbody></table>

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells

成体神経新生は、歯状ジャイル(DG)の顆粒帯(SGZ)で新たに活性化された神経幹細胞(NSC)が新しいニューロンを生成し、既存の神経回路に統合し、特定の海馬機能に寄与する動的なプロセスです。.重要なことに、成人の神経新生は環境刺激の影響を非常に受けやすく、様々な認知機能の活性依存調節を可能にする。様々な脳領域からの神経回路の広大な範囲は、これらの複雑な認知機能を調整します。したがって、特定の神経回路が成人の神経新生を調節する方法を理解することが重要です。ここでは、げっ歯類のNSCと新生児の子孫を調節するデザイナー薬(DREADDs)技術によって排他的に活性化されるデザイナー受容体を用いて神経回路活動を操作するプロトコルについて説明する。この包括的なプロトコルには、ウイルス粒子の立体注射、特定の神経回路の化学的刺激、チミジンアナログ投与、組織処理、免疫蛍光標識、共焦点イメージング、およびイメージングが含まれます。神経前駆細胞の様々な段階の分析。このプロトコルは、NSCとその子孫を視覚化するために使用される抗原検索技術に関する詳細な指示を提供し、クロザピンN-酸化物(CNO)またはCNO含有飲料水を使用して脳回路を調節する簡単で効果的な方法を説明し、DREADDs 発現ウイルス。このプロトコルの強みは、NSCに由来する成人の神経新生に影響を与える多様な神経回路を研究する適応性にあります。

上述の実験手順(図1A,B)に続いて、海馬内の神経原性ニッチに対する反対方式の苔細胞突起を刺激する効果を決定することができた。5-HT2Aクレラインを標識するコッシー細胞と組み合わせたクレ属Gq結合刺激DREADDウイルスを利用することにより、コセ細胞からの興奮性突起を反対方DG上に選択的に活性化し、強い苔状細胞を決定した。刺激は幹細胞の静止を促進した(図1C)。組織の分析前に正確なウイルス送達を確認した(図2A,B)。また、c-fos免疫組織化学実験を用いて苔状細胞の活性化を確認した(データは示さない)。不適切なウイルス注射の場合は、さらなる分析から動物を除外する。不適切な注入とは、目的の座標をターゲットにしなかったり、目的の領域外の発現のほとんどを持っていたり、ウイルスの送達をほとんど持たないものである。この実験では、DGのヒルス中の苔状細胞が目的の標的であり、注射がhilusの外側にある...

このプロトコルの目的は、特定の局所神経回路の化学的操作に応答して成人神経幹細胞/前駆細胞の挙動を分析するアプローチを記述することである。

Adult neurogenesis is a dynamic process by which newly activated neural stem cells (NSCs) in the subgranular zone (SGZ) of the dentate gyrus (DG) generate ...

このプロトコルは、脳内の様々な回路が成人の神経新生を調節する方法、および具体的に神経回路の刺激または阻害が成人神経幹細胞の増殖にどのような影響を与えるかに答えることができる。この技術の利点は、所望の神経回路を特異的に標的化できるとともに、動物に導入されるストレスの量を減らすことが可能である。この方法は、異なる脳回路が成人の神経新生を調節する方法についての洞察を提供することができます, 特に, 特定の神経伝達物質を放出する特定の細胞タイプは、成人の神経幹細胞増殖を調節する方法.この手順を開始するには、PBSに組織切片を配置し、前から後部までの順に正に帯電したスライドに5〜8個のセクションを取り付けます。組織切片を室温で2〜5分間乾燥させ、スライドに完全に付着させます。次に、容器内にクエン酸バッファーを用意します。電子レンジでクエン酸バッファーを5分間加熱し、溶液が沸騰します。その間、取り付けられたセクションをガラススライドホルダに入れます。5分後、スライドホルダーをセクションに入れて慎重にピペットボックスに入れます。電子レンジの電源を50%、調理時間を7分に設定します。タイマーを 7 分間開始し、ソリューションを監視します。溶液が沸騰し始めたら電子レンジを止め、沸騰後に電子レンジを続けます。電子レンジの調理時間が終了していなくても、タイマーが切れた後に停止します。このステップの目標は、水を過度に沸騰させることなく、沸騰温度以下に保つことです。沸騰しすぎると、スライドから組織切片が取り除かれます。次に、クエン酸バッファーと組織スライドを備えたウォームボックスを冷却用のアイスバケツに移します。箱を覆い、約30分間待つか、溶液が接触するまで待ってから、チミジンアナログ染色に進みます。チミジンアナログで組織切片を染色するには、クエン酸緩衝液から組織切片を取り除く。疎水性ペンで境界を描く前に、組織の切片を乾燥させてスライドに完全に付着させます。次に、パーメアビライズバッファーで20〜30分間パーメビリゼーションを行います。TBSトリトンを使用してセクションを2回洗浄し、毎回5分間洗浄します。次いで、エドゥ反応液を調製する。エドゥ反応液中の切片を30分~1時間インキュベートする。その後、TBS-トリトンで3回、毎回5分間洗います。スライドをアルミホイルで覆うか、光保護チャンバーに入れて、このステップの後に光から保護します。この段階では、蛍光顕微鏡を用いて、Edu反応が機能するかどうかを確認します。反応が働く場合、エドゥ標識細胞を観察する必要があります。さて、二次抗体と同じ動物で発生したブロッキングバッファーを使用して、取り付けられた組織切片を30分〜1時間ブロックする。その後、TBSトリトンで2回、毎回5分間洗います。ブロッキングステップ中に、一次抗体をブロッキングバッフ

assaying-circuit-specific-regulation-adult-hippocampal-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

神経幹細胞は、成人の非冬眠年子北極ジリス（AGS）の海馬から調製した。これらの神経幹細胞は、グリア培養とほぼ50:50ニューロンとして、数多くの通路を通って拡大して区別し、維持することができます。...

成人海馬ホッキョクジリス神経幹細胞の増殖と分化

このビデオでは、EdU取り込みを使用して脳組織切片で新たに増殖した神経幹細胞を染色し、続いて免疫蛍光法で特定のタンパク質を可視化する手順を示し、細胞の動態と増殖の理解を深めます。...

マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

成体の海馬神経新生では、静止状態の神経幹細胞が順次進行し、回路内で機能的に統合されたニューロンに発達するときに、異なる遺伝マーカーのセットが発現します。熱誘起抗原賦活化により、他の方法では検出が困難な前駆細胞の種類を同定し、より効果的に同定します。...

熱誘導抗原賦活化:成体海馬神経新生における前駆細胞型の検出および同定に有効な方法

ここでは、脳室下帯と個々の成体マウスの歯状回から、付着性単層またはニューロスフェアのいずれかとして、神経前駆細胞培養を同時に生成するための詳細なプロトコルを記述します。...

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

ここでは、海馬の発達における特定の遺伝子の制御メカニズムを調べるためのツールを提供するプロトコルを提示します。子宮外エレクトロポレーションと器官型スライス培養を用いることで、単一細胞における目的遺伝子の発現をアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションし、発生中の遺伝子の運命を追うことができます。...

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

このビデオ記事は、同じ組織切片内の成体海馬ニューロン新生のすべての段階を検出し定量化するための包括的なプロトコルを示しています。私たちは、異なる宿主種からの適切な抗体が利用できない場合に生じる間接的な多重免疫蛍光の限界を克服する方法を詳しく説明しました。...

大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

私たちは、成体マウスの脳の脳室下ゾーン(SVZ)から神経幹細胞(NSC)とその子孫を単離するための蛍光活性化細胞選別(FACS)ベースの方法を報告します。蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)トランスジェニックマウスに適用することで、ライブイメージングによる細胞周期の進行を研究することができます。...

セル成体マウス脳室下帯から神経幹細胞および前駆細胞の選別とその細胞周期ダイナミクスのライブイメージング

犬の脳は大人の神経新生を研究する貴重なモデルです。ここで紹介する主要な脳組織から大人犬の海馬神経前駆細胞を単離および拡張するためのプロトコルです。...

単離と大人の犬の海馬神経前駆体の拡大

極度切除は、深い定量的プロテオーム分析のために、マウス脳内で最大の神経原性ニッチの新鮮な凍結製剤を可能にする。この方法は正確で効率的であり、最小限の組織摂動を引き起こす。そのため、このニッチの分子微小環境や、他の臓器、領域、種の研究に最適です。...

正確で深い定量プロテオーム分析のための成人皮下帯のクライオセクション解剖

ここでは、マウス歯状回から単離された単一の核を配列決定する方法を紹介し、蛍光活性化核(FAN)ソーティングによってほとんどのニューロンを除外します。このアプローチは、高品質の発現プロファイルを生成し、神経幹細胞などの希少な集団を含む、ニッチに代表される他のほとんどの細胞タイプの研究を容易にします。...

海馬神経原性ニッチを研究するための単一核RNAシーケンシングと組み合わせたニューロンの蛍光活性化核ネガティブソーティング

ここでは、化学的に再プログラムされた幹細胞をドーパミン作動性前駆細胞に分化させ、パーキンソン病のマウスモデルに移植し、移植された細胞の成功した統合と機能的有効性を確認するために、これらの細胞を正確なニューロン調節を達成するためのプロトコルについて説明します。...

神経変性疾患の治療における再プログラム幹細胞由来前駆細胞における化学遺伝学的制御

学ぶ成人海馬神経前駆細胞の回路特異的調節法。ケモジェネティック操作により神経幹細胞の増殖と神経新生への影響を評価し、組織切片と免疫組織化学を用いて神経回路の調節メカニズムを解明する。

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

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