膜をターゲットとした Ca^{2 +}インジケーターによる培養細胞のローカル Ca^{2 +}シグナルの解剖

細胞下解像度でのカルシウム信号の解剖は、出力生物学的現象を決定する細胞内カルシウム信号を解読するための最も重要なステップの1つである。このプロトコルは、カルシウム流入とカルシウム放出の瞬間を監視することを可能にする新しいカルシウムイメージング法を記述する。このプロトコルは、遺伝的にコード化されたカルシウム指標の発現を可能にするすべての細胞タイプに適用可能である。

我々の方法は、実験室培養中の生きている動物の細胞下解像度でカルシウム信号の解剖に拡大される可能性があると考えています。この手順の実演を手伝うのが、研究室の技術者である「松美」です。この手順を開始するには、直径18ミリメートルのガラスカバースリップを12ウェルプレートの各ウェルに入れます。

滅菌水を使用し、使用されている12ウェルプレートごとに0.4%PEI溶液12.5ミリリットルを調製します。各ウェルにPEI溶液の1ミリリットルを追加し、カバースリップの下に泡がないことを確認します。摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターで一晩インキュベートします。

翌日、吸引器を使用してPEI溶液を除去します。各ウェルに滅菌水1ミリリットルを加え、蓋スリップとプレートの間のPEI溶液が十分に洗い流されるようにプレートを振ります。この洗浄プロセスを、新鮮な滅菌水でさらに2回繰り返します。

最終洗浄後、各井戸から水を完全に吸引する。フードの内側では、紫外線を使用してカバースリップを少なくとも15分間乾燥させ、滅菌します。PEIコーティングされた皿は2ヶ月まで摂氏4度で貯えることができる。

先に進む準備ができたら、使用直前に15分間、紫外線で皿を照らします。培養液の蒸発を防ぐために、ウェル間の空間に5ミリリットルの無菌蒸留水を加える。まず、皮質をインキュベーション生理食酒で洗います。

その後、トリプシンとDNAseをインキュベーション生理食前にして皮質を摂氏37度で5分間インキュベートします。その後、氷冷培養生理食酒で皮質を3回洗います。上清を取り除き、150マイクロリットルのDNAse Iストックを添加しためっき培地2ミリリットルを加えます。

20回以下のピペットで細胞を解離し、70マイクロメートルの細孔サイズで細胞ストレーナーを通して細胞を濾過する。次に、20ミリリットルのめっき培地で細胞ストレーナーを洗います。凍結した細胞ストックの調製のために、20ミリリットルの洗浄媒体で細胞を洗浄する。

皮質細胞をメッキ培地で希釈し、1ミリリットル当たり140,000個の生存細胞の密度を高めます。次に、12ウェル培養プレートのPEI被覆伝票に希釈した細胞懸濁液を1ミリリットル加える。二酸化炭素インキュベーターで2〜3日間、セルを摂氏37度に保つ。

細胞が安定している場合は、めっき後2~3日後、培養培地を維持培地に変更する。凍結細胞ストックの調製のために、スイングローターを使用して細胞を187回Gで3分間遠心分離するためにセルを回転させる。上清を吸引し、凍結保存培地を加え、摂氏4度に保ち、1ミリリットル当たり1000万個の細胞密度を得た。

アリコート細胞懸濁液の1ミリリットルを極低温管にする。マイナス80°Cの温度に達するまで、毎分マイナス1度の凍結率で細胞凍結容器にチューブを入れます。冷凍容器をマイナス80度の冷凍庫に移します。

凍結細胞を復活させるために、洗浄媒体及び凍結皮質細胞用維持培地を予め温める。次に、凍結した細胞を摂氏37度の水浴で急速に解凍する。あらかじめ温めた洗浄媒体で細胞を軽く希釈し、スイングローターを187倍Gで遠心分離機で3分間希釈します。

ペレットを1ミリリットルの洗浄媒体に再懸濁し、生存可能な細胞密度を測定する。次いで、細胞を凍結皮質細胞用維持培地で希釈し、1ミリリットル当たり300000細胞の細胞密度を得た。この細胞懸濁液の1ミリリットルをPEI被覆12ウェルプレートのウェルに入れた。

めっきの3~8日後のトランスフェクションの場合、2本のチューブを標識し、1つは血漿DNA用、もう1つはトランスフェクション試薬用に記載する。各チューブに、ウェルあたり50マイクロリットルの減らされた血清培地を加えます。カバースリップあたり0.5マイクログラムの血漿DNAと、ニューロン用トランスフェクション試薬を伴うサプリメント1マイクロリットルを、プラズマDNAチューブに十分に加えます。

Lck-RCaMP2とOER-GCaMP6fの共同トランスフェクションの場合は、各プラスミドの0.5マイクログラムと1マイクロリットルのサプリメントを50マイクロリットルの減らされた血清培地によく混ぜます。次に、トランスフェクション試薬チューブに1ウェルあたり1マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。ボルテックス両チューブは1〜2秒間。

次に、トランスフェクション試薬混合物をDNA混合物に加える。ピペットを軽く混ぜ、室温で5分間インキュベートします。この混合物をドロップワイズでセルにロードします。

マーカータンパク質が発現するまで2~3日間、二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。LとOを混ぜてAAC感染を起分させる。混合ニューロン-アストロサイト培養物にAACの3マイクロリットルを加える。

ミックスする皿をそっと揺らします。GEC が発現されるまで、1 週間から 2 週間培養を維持します。まず、Lck-RCaMP2およびOER-CaMPG6fを用いてトランスフェクトした細胞を含むカバースリップを顕微鏡の記録室に取り付けます。

400マイクロリットルのイメージング媒体を加え、チャンバーの上に蓋を置きます。GCaMP6f用のフィルタセットと光源を選択します。OER-GCaMP6fを表現するアストロサイトを見つけます。

次に、RCaMP2用のフィルタセットと光源を選択し、Lck-RCaMP2が同じアストロサイトで表現されているかどうかを確認します。2つのヘルツでLck-RCaMP2の時間経過画像を2分間記録し、イメージングデータを保存します。この後、GCaMP6fのフィルタセットを戻します。

2つのヘルツでOER-GCaMP6fのタイムラプス画像を2分間記録し、イメージングデータを保存します。本研究では、Lck-RCaMP2およびOER-GCaMP6fはHeLa細胞で発現され、両方の信号をトランスフェクションの24時間後に画像分割光学を使用して同時に記録した。ヒスタミンの添加に際して、Lck-RCaMP2およびOER-GCaMP6fのシグナル強度が増加した。

Lck-RCaMP2およびOER-GCaMP6fによって報告されたカルシウムイオン標高の時間コースは、同じ関心領域で比較される。両方のセンサーは、振動状のカルシウムイオンの標高を報告します。そして、両方とも、検査された5つの細胞のうちの2つの同じ時間経過を示す。

しかし、Lck-RCaMP2によって示されるカルシウムイオンの上昇は、他の細胞におけるOER-GCaMP6fよりも高いレベルにとどまっている。これらの結果は、カルシウムイオンの上昇が原形質膜付近で延長され、ヒスタミン刺激によって誘導されるこのカルシウムイオンシグナルの源であるERの周りに早期に終了することを示している。ラット海馬と皮質からのニューロン-アストロサイト混合培養中のアストロサイトからの自発的なカルシウムイオンシグナルは、Lck-RCaMP2およびOER-GCaMP6fによって示される。

自発的なカルシウムイオンの標高は、以前の報告と一致する細胞体ではなく、アストロサイクプロセスでのみ表示されます。未熟ラット海馬ニューロンにおけるLck-GCaMP6fによる自発的なカルシウムイオン上昇は、2つのヘルツで見られる。関心のある 5 つの異なる地域のタイム コースは、これらの標高がローカルにサブセルラー ドメインに限定されることを示唆しています。

OER-GCaMP6f-発現AAVベクターに感染した成熟したマウス海馬ニューロンは、DHPGの添加に応答してカルシウムイオン応答を示す。カルシウムイメージングの場合、励起光度が最も重要な因子です。光の漂白や光毒性を避けるために、励起光をできるだけ低くしてください。

カルシウムシグナルの供給源は、カルシウムチャネルに特異的な阻害剤を用いてポマコリによってさらに確認することができる。特定の出力を呼び起こすためにカルシウム信号を解読することは、基本的な生物学的問題でした。このカルシウムイメージング技術は、細胞内カルシウムシグナルの多様性を記述する方法を開きます。