生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化
March 26th, 2019
生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans にわたってゼラチナーゼ活性の白血球の遊走に関与する血液-脳関門の透過性を確認する方法に取り組みます。
ここで紹介する方法は、多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎における脳関門を越えた免疫細胞移動の分子メカニズムを研究することを可能にする。脳組織切片における免疫細胞浸潤との空間相関において、血液脳関門透過性とマトリックス-メタロプロテアーゼ活性を同時に調べ、これらの神経炎症事象をEAEの臨床徴候に正確に関連付けることができる。病気のマウスの専門的な取り扱いには、EAEの臨床徴候の正しいスコアリングと同様に、綿密な訓練が必要です。
したがって、視覚的なデモンストレーションは有益です。テキストプロトコルに記載されているように、特異的病原体フリー状態で収容されたC57-Black/6マウスの麻酔で、この手順を開始する。麻酔マウスを片手に固定し、30マイクロリットルのMOGペプチドを注入し、フロイントのアジュバントエマルジョンを後肢の各側面に皮下に完全に、リンパ節に近接します。
今度は、マウスを腹の上に置き、20マイクロリットルのMOGペプチドエマルジョンを尾根の左右の軟脂肪組織に注入します。また、マウスの首にエマルジョンの液滴を少し注入する。百日食毒毒素溶液を腹腔内に100マイクロリットル注入します。
腸への注入を避けるために、マウスの頭を身体の中心の下に持ちます。期待される臨床疾患の前および中にマウスに高いエネルギー含有量の食物を与えるために、飼育食に維持食を置き換える。最初の治療の48時間後に、ペルタシス毒素注射を繰り返す。
毎朝、ケージの中を見てEAEマウスの健康状態を確認してください。EAEマウスを毎日午後にスコア付けします。EAE実験に含まれるすべてのマウスをケージから取り出し、尾にトーヌスがあるかどうかを確認します。
指で尾を上に動かします。健康なマウスは尾を上げておきます。臨床EAEが開始された場合、尾のトヌスは低くなり、尾の徐々に低下することによって見える。
最終的には、マウスは尾を持ち上げることができないでしょう。EAE実験に含まれるマウスをクリーンベンチに置き、歩行の動作を観察し、文書化します。EAE スコアである疾患の重症度の評価のスコア基準のテキストを参照してください。
実験に含まれるすべてのマウスの重みを評価し、文書化します。デキストランストック溶液を調製するには、3キロダルトンデキストランテキサスレッドの10ミリグラムを0.9%塩化ナトリウム溶液の500マイクロリットル、10キロダルトンデキストランアレクサフルオール488の5ミリグラムを0.9%塩化ナトリウム溶液の250マイクロリットルで溶解します。デキストラン作業ソリューションの場合、注入の直前に、10キロダルトンデキストランアレクサFluor 488ストック溶液のピペット55マイクロリットルをシーリングフィルムの一部に。
その後、3キロダルトンデキストランテキサスレッドストック溶液の55マイクロリットルを追加します。100マイクロリットルを使い捨ての細かい注射器に混ぜて集める。次に、麻酔マウスをテーブルの横方向の位置に置きます。
マウスが目を覚ます前に、100マイクロリットルの蛍光トレーサーをマウスに静脈内注入する。トレーサーは、テキストプロトコルに詳述されているようにマウスの灌流を行う前に15分間循環させます。平らなデュワーコンテナに砕いたドライアイスを充填し、液体がドライアイスパックの上約1センチメートルに達するまで2-メチルブタンを追加します。
アイスバケツカバーなどのゆるい蓋で覆います。鋭いはさみで浸透したマウスの頭を切り取った後、より小さいはさみを使用して皮膚と耳を取り除きます。頭蓋マグナムから左側と右側の前部に向かって切断して頭蓋骨を慎重に解剖し、頭蓋骨を脳の上にアップフォールディングできるようにします。
その後、平らな金属ヘラを使用して光学神経を切断しながら、頭蓋骨の基部から無傷の脳を慎重に持ち上げます。アルミ箔の上に脳を置きます。2つのコロナカットを置くことによって3つの部分に脳をカットします。
3つの部分は、脳幹を持つ前頭脳、中脳、小脳を表す。クイオムオールドを第1四半期に最適温度切断マトリックスで満たします。その後、各脳片の前側を下向きにして、脳スライスをクリオマールルドに入れる。
マトリックスで完全に組織を覆います。2-メチルブタン浴に水平に組織を持つクリオマールを置きます。組織ブロック全体を浴槽に浸さないようにして、1分以内に組織が下から上に凍っていることを確認します。
凍結した組織をマイナス80°Cに移して保管します。凍結組織切片の準備のためのテキストプロトコルを参照してください。EAEマウスから調製された6ミクロンの非固定脳組織切片を取り出す。
ヒュームフードでは、シリカゲルを含むプラスチック製の冷凍ボックス内のセクションを解凍して、組織内の水の保持を避けます。1つのスライド上の2つの組織セクションを、撥水ペンで線を引いて分離します。遠心分離反応液は、13で5分間、室温で300グラム、水浴を用いて摂氏37度に予熱した。
その後、1X反応バッファーを使用して、37°Cで5分間組織切片を水分補給します。5分後、1X反応バッファーを注ぎます。組織切片に反応液を加え、摂氏37度で4時間インキュベートする。
その後、スライドを二重蒸留水で5回洗います。今、室温でPBSで一度それらを洗浄する前にマイナス20°Cで氷冷メタノールで5分間セクションを修正します。セクションにPBSに1%BSAを加え、室温で20分間インキュベートします。
次に、組織上のスライドを反転させることにより、セクションからバッファーを廃棄する。一次抗体カクテルをセクションに加え、室温で1時間インキュベートします。セクションをPBSで2回洗浄した後、二次抗体カクテルを加え、室温で1時間インキュベートする。
次に、セクションをPBSで2回洗浄し、埋め込み溶液でスライドを取り付けます。取り付けられた切片を室温で一晩乾燥させた後、蛍光顕微鏡を用いて染色された組織切片を分析する。EAE疾患の重症度は、EAE誘導後16日から20日の間に予想される疾患のピークまで増加する。
臨床EAEのピーク時には、マウスはまた、疾患の寛解期におけるEAEの改善に対する相関性が高まる最も低い体重を示した。ここに示されているのは、EAEに罹患しているC57-Black/6マウスの脈絡叢と隣接する脳のパレンチマの代表的な画像です。マウスを犠牲にする15分前に静脈注射した。
トレーサーはフェネトレートされた微小血管を横切って脈絡叢のストーマに容易に拡散し、血液脳関門は循環トレーサーを脳の円質に拡散することを許さないため、蛍光シグナルは欠いている。これらの画像は、EAEに罹患しているC57-Black/6マウスの小脳における代表的な漏れやすい血管を示しています。矢印は、トレーサーが脳内の微細血管を横切ってCNSパレンチマに拡散したことを示し、これらの血管において血液脳関門機能が損なわれることを示唆している。
CNSのパレンチマでは、緑色と赤色の蛍光シグナルが血管壁の外に見えます。MOG-CFAエマルジョンの正しい皮下配置は、EAEにつながる適切な免疫応答をマウントするために不可欠です。腹腔内注射と筋肉内注射は避けるべきである。
CFAをヒュームフードの下で準備し、減衰したマイコバクテリウムの吸入を避けます。また、MOG-CFAエマルジョンによる自己注射は避け、これは、遺伝的に素因がある個人において、結色素を引き起こしたり、EAEに至る可能性もあるので、避けてください。脳浸潤免疫細胞は、EAEに罹患しているマウスのCNSから単離して、フローサイトメトリーによる神経炎症時の浸潤免疫細胞サブセットを定量化することができる。
内皮およびグリア脳関門の完全性を評価することは、遺伝子組み換えマウスモデルの分析または他の神経疾患のモデルに翻訳することができる。
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概要
この記事は、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）中の神経血管ユニット障害を研究するためのプロトコルを提示します。血液脳関門の透過性と白血球移動に関連するゼラチナーゼ活性の評価に焦点を当てています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- 実験モデル
背景
- 実験的自己免疫性脳脊髄炎は多発性硬化症のモデルです。
- 脳関門を介した免疫細胞の移動を理解することは、神経炎症研究にとって重要です。
- 血液脳関門の完全性は中枢神経系の恒常性の維持に不可欠です。
- マトリックスメタロプロテイナーゼは神経炎症中の白血球浸潤に役割を果たします。
研究の目的
- EAEにおける免疫細胞移動の分子メカニズムを調査すること。
- 血液脳関門の透過性と免疫細胞浸潤を相関させること。
- 神経炎症イベントとEAEの臨床症状を関連付けること。
使用した方法
- 特定病原体フリー条件下でのC57-Black/6マウスの使用。
- MOGペプチドと完全Freundの補助剤の皮下注射。
- 血液脳関門の透過性の評価。
- マトリックスメタロプロテイナーゼ活性の評価。
主要な結果
- 血液脳関門の透過性と免疫細胞浸潤の相関関係を示しました。
- 白血球移動におけるゼラチナーゼ活性の役割を特定しました。
- 神経炎症プロセスとEAEの臨床症状との関連を確立しました。
- 実験手順の視覚的実演を提供しました。
結論
- この研究はEAEにおける神経炎症メカニズムの理解を深めます。
- 開発されたプロトコルは、多発性硬化症に関する将来の研究に役立ちます。
- 臨床症状の専門的な取り扱いと評価が正確な結果にとって不可欠です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative visualization of blood-brain barrier (BBB) and glial barrier impairment in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) provides critical mechanistic insight for neuroinflammatory disease modeling. This approach enables precise mapping of immune cell infiltration and barrier dysfunction, supporting predictive confidence in target validation and translational biomarker development for CNS drug discovery. Integrating spatially resolved permeability and enzymatic activity data informs risk-adjusted portfolio decisions at the discovery-preclinical interface.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking by correlating immune cell migration with barrier disruption in vivo.
- Supports functional target validation through spatial mapping of BBB and glial barrier integrity.
- Facilitates hypothesis testing on molecular drivers of neuroinflammation relevant to multiple sclerosis models.
Screening & Assay Development
- Provides validated in vivo readouts for BBB permeability and gelatinase activity using fluorescent tracers and in situ zymography.
- Establishes reproducible quantitative endpoints for immune cell infiltration and barrier compromise.
- Enables standardization of neuroinflammatory model systems for downstream compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical model outputs with disease-relevant biomarkers of barrier dysfunction and immune cell entry.
- Supports continuity from mechanistic discovery to translational validation in CNS inflammation research.
- Informs risk-adjusted advancement of therapeutic candidates targeting neurovascular unit integrity.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical validation by providing quantitative, spatially resolved data on barrier integrity and immune cell dynamics in EAE models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of BBB and glial barrier mechanisms in neuroinflammation.
- Screening: Delivers standardized, quantitative permeability and enzymatic activity assays for model qualification.
- Analytics: Supports comparative analysis of immune cell infiltration and barrier status across experimental conditions.
- Translational Research: Connects preclinical findings to disease-relevant biomarkers for CNS drug development.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable workflow for barrier assessment in genetically modified or alternative neurological disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroinflammatory target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardizes in vivo barrier assessment and immune cell quantification for reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking mechanistic outputs to clinical disease features.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS therapeutic programs based on validated model outputs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroinflammatory animal models and in vivo imaging techniques.
- Demands access to fluorescence microscopy and immunohistochemistry infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of scoring and tissue processing protocols.
- Adaptable to various mouse strains and neurological disease models with appropriate controls.
- Dependent on precise tracer administration and tissue handling to ensure data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:53
Immunization of C57BL/6 Mice
2:04
Scoring of EAE Mice
3:08
In Vivo Permeability Assay
4:25
Dissection and Freezing of Brains
6:15
In Situ Zymography Combined with Laminin/CD45 Immunofluorescence Staining
8:21
Results: Course of EAE and In Vivo Permeability
9:42
Conclusion
