Name: 生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶ実験的自己免疫性脳脊髄炎における血脳関門透過性とマトリックスメタロプロテアーゼ活性の評価法。C57BL/6マウスを用いて神経炎症時の免疫細胞浸潤メカニズムを可視化し、多発性硬化症研究に貢献します。

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リディア ・ ソローキン、私たちと彼女オリジナルの in situザイモグラフィー プロトコル10共有者は心より感謝します。

すべての研究は動物の保護に関するスイスの法律によるとガイドラインの下で実施し、ベルン、スイスのカントンの獣医のオフィスによって承認された (許可番号: 31/17 そしてある 77/18)。
1. 特定病原体無料 (SPF) 条件の c57bl/6 マウスの住宅
<ol><li>12/12 h 光暗い個別換気ケージの家マウスのサイクルします。広告 libidum を水し、食糧を提供します。マウスの微生物学的品質を監督するには、実験的コホートは、次の FELASA の推奨事項13汚いベッド歩哨によって四半期モニタリングを施行した.</li>
	<li>個別にマーク 8-12 週齢女性 c57bl/6 マウスに耳パンチを使用します。</li>
</ol>2. c57bl/6 マウスの免疫
<ol><li>ソリューション14の準備:<ol>
<li>Freund 完全アジュバント (CFA) のミックス 120 mg の新鮮な pestled の熱の不完全な Freund のアジェバントの 30 mL は、ヒューム フードの下で結核 (菌 H37RA) を不活化。4 ° C で原液を保存します。</li>
		<li>MOGaa35-55-ペプチド原液滅菌 PBS (4 mg/mL) で MOGaa35-55-ペプチドを溶解、-80 ° C で保存</li>
		<li>モグ エマルジョンを準備します。<ol>
<li>1:2 とモグ ペプチド原液 2 mL マイクロ チューブに CFA を希釈します。</li>
			<li>フィルム シールで、チューブをシール、粘着テープでチューブを完全に覆うことによって渦のミキサーに修正します。4 ° C で 4 時間の渦乳剤</li>
		</ol>
</li>
		<li>安定したエマルションと注射器を準備します。<ol>
<li>したマイクロ チューブを取るし、すぐに小さなテーブルの遠心分離機を用いたエマルション スピンダウンします。1 × 18 ' (1.2 mm × 40 mm) 注射針を用いた注射器にエマルジョンを収集します。</li>
			<li>マウスの数によると注射器 (100 μ L/マウス) エマルジョン音量を調整し、¾ × 27 ' (0.4 mm × 19 mm) 注射針 18 G 針を置き換えます。フィルム シールのついた注射器に接続されている注射針をシールします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>百日咳毒素 (PTx) 原液を 500 μ L の滅菌 PBS で凍結乾燥 PTx の 50 μ g 解散 (100 ng/μ L)。4 ° C で原液を保存します。</li>
		<li>PTx 作業ソリューション (腹腔内注射使用 ½ × 30 ' (0.3 mm × 13 mm) 針) のマウスあたり PTx 原液 (300 ng/100 μ L) の 3 μ L で 97 μ L の滅菌 PBS を混在させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>EAE 誘導<ol>
<li>C57bl/6 マウスを麻酔気化器システムを使用する isofluorane とします。マウスの麻酔、2.1 %isofluorane とフェイス マスクにマウスを転送する前に小さな培養室の酸素の 4.5 %isofluorane にマウスを公開します。マウスの低体温症を防ぐために加熱パッドが装備可能麻酔ユニットを使用します。</li>
		<li>1 つの手で麻酔下マウスを修正し、まず後ろ足側面に皮下 MOG35 55 CFA エマルジョンの 30 μ L を注入 (図 1:1 + 2; 合計 60 μ L; 左フランク 30 μ L と右脇腹 30 μ L) 鼠径リンパ節に近くで。</li>
		<li>その腹の上にマウスを置くし、尾ルートで左と右の柔らかい脂肪組織に MOGaa35 55 CFA エマルジョンの 20 μ L を注入 (図 1:3 + 4; 合計 40 μ L; 左側尾ルート 20 μ L と右側テール ルート 20 μ L) と MOGaa35 55 CFA エマルジョン int の小さな液滴o マウスの首 (図 1: 5)。</li>
		<li>PTx 溶液 100 μ L をマウス腹腔内注入します。腸注入を避け体中央下マウスの頭を保持します。</li>
		<li>メンテナンスの食事を置き換える (押し出し大栄養素: 18.5% の粗蛋白質粗脂肪 4.5% 粗繊維 4.5%; 粗灰分 6.5%; 澱粉 35%; 代謝エネルギー: 13.1 MJ/kg) 食事飼育する (押し出し大栄養素: 粗蛋白質 23.5% 粗脂肪 5.5%; 粗繊維 3%;粗灰分 5.7%;澱粉 36%;代謝エネルギー: 14.3 MJ/kg) 前に期待される臨床疾患中に高エネルギーの内容の食物と一緒にマウスを提供するために。</li>
		<li>フェイス マスクを削除し、マウスを地球温暖化パッドとそのホームのケージに転送します。マウスが 10 分後に完全に目を覚まし、運動であることを確認します。</li>
		<li>PTx 注入 (2.2.4) 48 h 最初の治療後を繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 得点 EAE マウスの
<ol><li>みると、ケージの中で毎朝 EAE マウスの健康状態を確認します。</li>
	<li>毎日午後には EAE マウスをスコアします。</li>
	<li>尾は指で上方へ移動することによって緊張を持つかどうかケージとチェック アウト EAE 実験に含まれるすべての個々 のマウスを取る。健康なマウスの尾についていく (尾は、緊張を持っている)。臨床 EAE 始まりましたが、下、尾の漸進的な低下によって目に見える尾緊張になります。最終的にマウスはしっぽをすべて解除することができません。</li>
	<li>EAE 実験ではクリーン ベンチ内で含まれているすべての個々 のマウスを置きますと観察し、歩行動作を文書化します。病気の重症度の評価の採点基準表 115を参照してください (EAE スコア)。</li>
	<li>評価実験に含まれているすべてのマウスの体重を文書化します。</li>
	<li>臨床 EAE を表示するマウスで十分な食糧や水の摂取量を確保するため 1 のスコア ケージの底のプラスチック皿で湿らせた食品を供給しを毎日更新します。</li>
</ol>4. 体内透過性アッセイ
<ol><li>ソリューションの準備:<ol>
<li>デキストラン溶液、10 kDa デキストラン Alexa Fluor 488 として 3 kDa デキストラン テキサス赤 0.9% 塩化ナトリウム溶液 (20 mg/mL) 500 μ L での 10 mg を解散します。</li>
		<li>デキストラン作業ソリューションだけ 10 kDa デキストラン Alexa Fluor 488 のインジェクション ピペット 55 μ L 前に在庫ソリューション (20 mg/mL) フィルム シールの部分にし 3 kDa デキストラン テキサス赤原液 (20 mg/mL) の 55 μ L を追加します。ミックス (最終濃度 2 mg/100 μ L) 細かいシリンジに 100 μ L を収集しています。</li>
		<li>10% ホルムアルデヒド (PFA) 原液、きれいなガラス ビーカー、マグネチックスターラー; を使用して攪拌下で正確に 56 ° C まで熱 1N NaOH の 200 μ L、100 mL の PBS、余分な純粋な粉体 PFA の 10 g を組み合わせてください。PFA を完全に溶解するまで 30 分 56 ° C で維持します。部屋の温度に冷却します。7.4; に pH を合わせなさいペーパー フィルターをフィルター処理します。-20 ° C でのストアPBS を使用するさらに原液を希釈することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>まもなく健康 c57bl/6 マウスまたは苦しんで EAE イソフルラン (マウスは約 1 分の鎮静されます) を c57bl/6 マウスを麻酔します。ステップ 2.2.1 (マウスを 4.5% イソフルラン誘導チャンバー内酸素にさらされる、2.1% イソフルランとフェイス マスクに転送されますが) のように自動化されたシステムを使用します。</li>
	<li>テーブルの上の側臥位、静脈麻酔下のマウスを置く (例えばレトロ軌道) マウスが目覚める前にマウスに 100 μ L の蛍光トレーサーを注入します。</li>
	<li>すぐに、フェイス マスクを削除し、マウスが完全に目を覚まし、運動性短い麻酔後かどうかを確認します。15 分間循環トレーサーをしましょう。</li>
	<li>5.1 手順に進みます。</li>
</ol>5. マウスの灌流
<ol><li>
体内透過性評価。
	<ol>
<li>深いイソフルラン麻酔を誘導することによって蛍光トレーサー投与後 15 分の手順を開始します。誘導するには、マウスに深い麻酔は酸素のイソフルランの 2.3% を使用します。足引っ込め反射を利用して麻酔の深さを判断する (足の指の間の皮膚をつまんで; 屈曲の十分な深さを示す)、前肢と後肢 EAE マウスでの反射を調べる。</li>
		<li>その裏にマウスを修正し、エタノールと腹をスプレーします。ハサミを使用して胸部を開き横隔膜を削除します。ハサミを使用して心臓の右心房を開くし、10 mL の PBS の 4 %10 mL に続いて、心臓の左心室を通してマウスを灌流 PBS で PFA。 注意: PFA を吸い込むことを避けるため、マウスの発煙のフードを灌流します。</li>
		<li>セクション 6 に進んでください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
その場でザイモグラフィー: の
	<ol>
<li>EAE、苦しんでマウスの酸素の 2.3% イソフルランを使用して深いイソフルラン麻酔ステップ 5.1.1 のように麻酔の深さを確認してください。</li>
		<li>次に、その裏にマウスを修正し、エタノールと腹をスプレーします。ハサミを使用して胸部を開き横隔膜を削除します。ハサミを使用して心臓の右心房を開き、20 ml の PBS の心臓の左心室を通してマウスを灌流します。</li>
		<li>セクション 6 に進んでください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 解剖と脳の凍結
<ol><li>寒剤の準備:<ol>
<li>砕いたドライアイスでフラット デュワー容器を満たし、液体ドライアイス パックの上約 1 cm に達するまで 2 methylbutane (イソペンタン) を追加します。カバーします緩いふた-例えば、アイスバ ケット カバー。</li>
	</ol>
</li>
	<li>鋭いハサミで灌流のマウスの頭をクリップ、皮膚と耳はさみの小さいセットを使用して取り外します。</li>
	<li>慎重に左および脳の upfold のスカル キャップできるように右側に前方後頭から切り出して、タツナミソウを解剖します。その後、慎重に持ち上げて頭蓋底からそのまま脳平らな金属のヘラを使用して光学神経を切断しながら。</li>
	<li>アルミ箔に脳を置き、2 つのコロナ カットを配置することで 3 個 (前頭葉脳、中間脳や小脳 + 脳幹) の脳をカットします。</li>
	<li>最適温度切断 (O.C.T.) 行列で第 1 四半期に cryomold (25 mm × 20 × 5 mm) を埋める、個々 の脳の cryomold に下向きの前面側の脳のスライスを配置し、O.C.T. マトリックスを完全に組織を被覆します。</li>
	<li>2 Methylbutane 風呂に水平方向に組織と cryomold を配置、組織フリーズ下部から上部に 1 分以内で全体組織ブロックをお風呂に浸漬を避けることによってかどうかを確認します。</li>
	<li>ストレージ-80 ° C まで凍結するティッシュを転送し、セクション 7 に進みます。</li>
</ol>7. 凍結するティッシュ セクションの準備
<ol><li>-20 ° c で 30 分用クライオスタット-80 ° C から凍結するティッシュから温度を平衡します。</li>
	<li>Cryomold と (-15 ° C に設定) クライオスタット ティッシュ ホルダーにマウントから組織ブロックを削除 O.C.T. 行列を用いたします。</li>
	<li>鋭いメスのクライオスタットのホルダーにティッシュのブロックのエッジをトリムし、組織が表示されるまでに、クライオスタット ナイフで 20 μ m のセクションを削除することによって組織のブロックに切断を開始します。</li>
	<li>
生体内での BBB 透過性の分析。
	<ol>
<li>6-10 μ m の切片を切り取り接着ガラス スライドにそれらを収集し、蛍光顕微鏡を用いたカバー スリップで覆われたセクションをすぐにイメージします。</li>
		<li>(非漏出血管漏出血管の観察される蛍光パターンの拡散と比較しての境界線をシャープに注意を払う) 脳内血管の外観を評価します。肯定的な制御として脳室周囲器官または、BBB が無い脈絡叢の間質にトレーサーの漏れを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
その場でザイモグラフィー: の
	<ol>
<li>クライオスタットを用いた 6 μ m の切片を切るスライド ガラス接着、それらを収集し、凍結するティッシュ セクションで蓋にシリカゲルを含む凍結ボックス-20 ° C。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8 しますその場でザイモグラフィーはラミニン/CD45 蛍光染色と組み合わせて。
<ol><li>ソリューションを準備します。<ol>
<li>埋め込みソリューションを準備します。<ol>
<li>0.2 M Tris バッファーは、pH 8、12 mL、6 mL ddH2O、ポリ (ビニル アルコール) の 2.4 g グリセロール (分析グレード) の 6 g を混合し、室温 (マグネチックスターラー) 4 h のためのソリューションをかき混ぜる</li>
			<li>50 mL の遠心管に溶液を移し、室温 2 時間休ませてくださいその後 50 ° C (水槽) で 10 分のためのソリューションと室温で 2,700 × g で 20 分間遠心を孵化させなさい。</li>
			<li>上清をとり因数-20 ° C で凍結</li>
		</ol>
</li>
		<li>冷たいゼラチン溶液を準備します。<ol>
<li>10 ml ddH2O の牛の皮膚から冷たいゼラチンの 0.1 g を溶解します。</li>
			<li>それは少なくとも 1 日浸し、4 ° C で因数を格納</li>
		</ol>
</li>
		<li>冷たいメタノール (-20 ° C) を準備します。<ol>
<li>Coplin jar に 100% メタノールを入れ、-20 ° C まで冷却</li>
		</ol>
</li>
		<li>10% アジ化ナトリウム ストック溶液を準備します。<ol>
<li>DdH2O の 10 mL に 1 g のアジ化ナトリウムを追加し、常温で保存します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>0.1% アジ化ナトリウム作業溶液を準備します。<ol>
<li>ミックス 99年 μ L の ddH2O の 10% アジ化ナトリウム ストック溶液 1 μ L で。</li>
		</ol>
</li>
		<li>1 mg を 1 ml ソリューションとストアの 100 μ 因数 4 ° C で光から保護を作業のアジ化ナトリウムの豚皮から共役フルオレセイン色素焼 (DQ) ゼラチンを溶かす</li>
		<li>エタノール、-20 ° C でストアの 76 μ L で 1, 10-フェナントロリン一水和物の 30 mg を溶解します。</li>
		<li>25 x プロテアーゼ阻害剤のソリューションを準備します。<ol>
<li>2 mL ddH2O に EDTA 無料プロテアーゼ阻害剤 1 錠を追加します。-20 ° C にてストア</li>
		</ol>
</li>
		<li>使用する直前には、反応液 (150 μ L/セクション) を準備します。<ol>
<li>13,300 × gで 5 分間 1 mg/mL DQ ゼラチン溶液を遠心します。</li>
			<li>プロテアーゼ阻害剤ソリューション x 25 の 6 μ L、1 mg/mL DQ ゼラチン 1.5 μ 20 mg/mL 冷たいゼラチンの 0.3 μ L 反応バッファー (ゼラチナーゼ/コラゲナーゼ アッセイ キット; 参照テーブルの材料) x 10 の 15 μ L ddH2O のミックス 127.2 μ L。</li>
		</ol>
</li>
		<li>使用する直前フェナントロリン ネガティブ コントロール反応液 (150 μ L/セクション) を準備します。<ol>
<li>2 M 1, 10-フェナントロリン (MMP 阻害剤) の 2 μ、15 μ L 反応バッファー、プロテアーゼ阻害剤 EDTA 無料、25 の 6 μ L、1 mg/mL DQ ゼラチン 1.5 μ 20 mg/mL 冷たいゼラチンの 0.3 μ L x 10 の ddH2O のミックス 125.2 μ L。</li>
		</ol>
</li>
		<li>使用前にだけ冷たいゼラチン (非蛍光性) のネガティブ コントロール反応溶液 (150 μ L/セクション) を準備します。<ol>
<li>6 μ L EDTA 無料 25 x プロテアーゼ阻害剤の 20 mg/mL 冷たいゼラチンの 0.3 μ、15 μ L 反応バッファー x 10 の ddH2O のミックス 128.7 μ L。</li>
		</ol>
</li>
		<li>一次抗体 counterstaining、例えばのためのカクテル、0.95 μ G/ml ポリクローナルウサギ抗ラミニンおよび 1 %bsa を PBS で 10 μ G/ml ラット ポリクローナル抗 CD45 抗体を準備し、一次抗体カクテル適切なアイソタイプ コントロールを準備します。</li>
		<li>準備の二次抗体の解決、例えば、7.5 μ g/mL Cy3 ヤギ抗ラット + 15 μ G/ml で PBS で 1 %bsa マルチカウンタオートマタ抗家兎 (光から保護する)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>EAE マウス組織への水の滞留を避けるために、ペンをはじく水で線を描画することによって 1 つのスライド上の 2 の組織切片を別々 の発煙のフードで蓋にシリカゲルを含むプラスチック製の冷凍ボックスの中から 6 μ m 脳の非固定ティッシュ セクションを解凍します。</li>
	<li>反応液 (手順 8.1.9-8.1.11) を用意し、部屋の温度、37 ° c 水のお風呂を使用して前の暖かい 13,400 x gで 5 分間遠心。</li>
	<li>1 x 反応バッファーを使用して 37 ° C で 5 分間ティッシュ セクションを水分補給します。その後、反応バッファー x 1 を注ぐ, 切片中の反応液を追加して、37 ° C で 4 時間インキュベートDdH2O の 5 回スライドを洗ってください。</li>
	<li>-20 ° C で氷冷メタノールで 5 分間のセクションを修正し、その後室温で PBS で一度セクションを洗ってください。</li>
	<li>PBS で 1 %bsa をセクションに追加し、室温で 20 分間インキュベート (光から保護する)。一次抗体カクテルを追加セクションから PBS で 1 %bsa を破棄し、組織上のスライドを反転して、室温で 1 時間インキュベート (光から保護する)。</li>
	<li>PBS で 2 回のセクションを洗う、二次抗体カクテルを追加し、室温で 1 時間インキュベート (光から保護する)。</li>
	<li>セクション PBS で 2 回洗って、埋め込みソリューションのスライドをマウント、マウントされたセクション室温で一晩乾燥 (光から保護する)。最後に、蛍光顕微鏡を用いた染色組織切片を分析します。</li>
</ol>

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<li>Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+peptide+induces+typical+chronic+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+in+H-2b+mice%3A+fine+specificity+and+T+cell+receptor+V+beta+expression+of+encephalitogenic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells.</a> European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).</li>
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<li>Westarp, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte+line-mediated+experimental+allergic+encephalomyelitis--a+pharmacologic+model+for+testing+of+immunosuppressive+agents+for+the+treatment+of+autoimmune+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).</li>
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<li>Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Natalizumab+blocks+adhesion+but+not+initial+contact+of+human+T+cells+to+the+blood-brain+barrier+in+vivo+in+an+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis.</a> Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).</li>
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<li>Krueger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+involves+four+distinct+stages+of+vascular+damage+in+various+models+of+experimental+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).</li>
<li>Hawkins, B. T., Egleton, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+imaging+of+blood-brain+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption.</a> Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).</li>
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<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).</li>
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<li>Sixt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+laminin+isoforms%2C+laminins+8+and+10%2C+play+decisive+roles+in+T+cell+recruitment+across+the+blood-brain+barrier+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).</li>
<li>Grewal, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L+is+required+on+effector+cells+for+local+interactions+in+the+CNS+to+cause+myelin+damage+in+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Immunity. 14, 291-302 (2001).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

ここでは、誘導し、女性の c57bl/6 マウスに惹起を監視するためのプロトコルを提案する.女性が優先的に選択されていると、女性の発症率がある: 3:1 MS での男性。EAE の重症度を評価するために行った 3 点得点シートの使用します。EAE の重大度は、運動機能障害の重症度に関してスコアは一般的にです。マウス先端 EAE の段階、すなわち 2 の上のスコアを示す動物の不必要な苦痛を避けるために犠牲にする必要があります。したがって、それは例えば近い間隔でマウスをスコアに勧めプロトコルで説明したように 1 日 2 回。 いくつかある 0 - 6 ポイント 0-3 からの達し採用ルーチンを得点、16,17,18,19あるいはそれ以上になります20ポイント。しかし、我々 は以前、おそらく洗練された EAE の得点にはつながらない全体的な疾...

中枢神経系 (CNS) は、すべてのボディおよび脊椎動物、精神機能を調整し、恒常性中枢神経系は神経細胞の適切なコミュニケーションのために不可欠。中枢神経系の恒常性は、血流の変化の環境から中枢神経系を保護する神経血管ユニット (NVU) によって保証されます。NVU は、ユニークな生化学的、連続クロストーク ペリサイト, アストロ サイト, ニューロン, と細胞外マトリックス (ECM) の血液脳関門 (BBB) を確立、中枢神経系血管内皮細胞ので構成されます 2 つの確立異なる基底膜1。内皮細胞基底膜 abluminal BBB 内皮細胞においてペリサイトの高番号を隠し持ってし、ラミニン α4 とラミニン α 5、に加えて他の ECM 蛋白質2で構成されて、ensheathes。対照的に、実質の基底膜はラミニン α 1 とラミニン α 2 から成り、アストロ サイト終わり足に包まれています。アストロ サイトのエンド フィートと共に実質の基底膜は、いっぱい脳脊髄血管周囲またはくも膜下スペース3から中枢神経系の神経ネットワークを分離するグリア細胞 limitans を作成します。人身売買の中枢神経系に免疫細胞は、末梢組織に免疫細胞で 2 段階のプロセスが必要とする、まず違反内皮 BBB とその後にグリア細胞 limitans とは異なる、NVU のユニークなアーキテクチャにより中枢神経系細胞に達する。
多発性硬化症 (MS) は中枢神経系、免疫細胞の数が多いが中枢神経系に入力し、neuroinflammation、脱髄、BBB 整合性4の焦点の損失を引き起こすの一般的なアミロイド疾患です。ガドリニウム コントラスト強化磁気共鳴画像 (MRI)5によって可視化として中枢神経系病変の存在によって示されるように、BBB の整合性の損失は MS の初期の特徴です。後毛細管小静脈; のレベルで中枢神経系に白血球の血管外漏出が発生しますただし、BBB 基底膜およびその後グリアのバリア間で免疫細胞漏出に関与する正確なメカニズムは、探検するために残ります。実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) MS の動物モデルとして機能し、MS の病因について私達の現在の知識に大きく貢献しています。例えば、EAE モデルを使用して発見されている最初のキャプチャを含むマルチ ステップ プロセスで白血球の血管外漏出が発生して注目していると P セレクチン糖タンパク質リガンド (PSGL)-1 などの粘液のような分子を介するローリング ステップインテグリン依存型会社逮捕と漏出6の寛容な側面に BBB 内皮細胞の T 細胞のクロールの順。
T 細胞は、血管内皮の BBB と内皮の基底膜に交差している、彼らの同種抗原マクロファージや樹状細胞が髄膜や血管周囲のスペースで戦略的にローカライズに遭遇する必要があります。この相互作用は、炎症性メディエーターの焦点生産グリア limitans7,8,9を介して免疫細胞の中枢神経系組織への浸潤のため後続のメカニズムに必要なトリガーを誘導します。マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP)-2 および mmp-9 活性化焦点ケモカイン活性化を変更し、免疫の前提条件であるアストロ サイトの終わり足細胞外マトリックス受容体の分解を誘導する全体にグリア細胞 limitans 細胞移動、細胞、中枢神経系の実質および EAE10,11の臨床症状の発症を誘発します。
中枢神経系ティッシュ セクションの漏れとゼラチナーゼ活性 CNS BBB と免疫細胞の浸潤の検出を組み合わせた neuroinflammation のコンテキストで内皮細胞およびグリア細胞のバリアの機能の整合性に関する貴重な情報を提供します。例えば、最近調べた内皮タイト結合分子接合部接着分子 (ジャム) の構成の損失-EAE のコンテキストで人身売買、中枢神経系には免疫細胞の B。健康の野生型 c57bl/6 マウスと比較して、健康的なジャム B 欠乏同腹子を示さなかった BBB 整合性の減損内因性と外因性トレーサー12を使用して体内の透水性評価が示すように。EAE のコンテキストでジャム B 欠乏 c57bl/6 マウスは炎症細胞髄膜と血管周囲のスペース12トラップに関連付けられていた改善病気の徴候を示した。この現象を確認する適用の in situザイモグラフィー ジャム B 欠損マウス中のゼラチナーゼ活性の欠如が突破することが免疫細胞の数が減少する可能性がある場合をテストするためにゼラチナーゼ活性の同定を可能、グリア limitans12。
可用性を与え異なる遺伝子組み換えマウスのモデル、例えば、BBB 機能の変化を引き起こす可能性があります別の BBB タイト結合分子を欠けている BBB の整合性を調査するための方法論は、重要。さらに、新しく開発された薬 NVU 障壁に影響を与える可能性があります。ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) による能動免疫による c57bl/6 マウスに惹起を誘導する方法を紹介-ペプチド aa35-55 Freund 完全アジュバントで。我々 は、外因性トレーサーとゼラチナーゼ活性の in situ 検出による内皮細胞およびグリア細胞の体内バリアの整合性をそれぞれ勉強の仕方、NVU の内皮細胞およびグリアの垣根を越えて免疫細胞浸潤をローカライズする方法を説明します。

<table><tbody><tr><td>AMCA抗ウサギ抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-156-045</td><td>4°Cで保管;C;protect from light</td></tr><tr><td>アンチCD45 抗体 (30F11)</td><td>Pharmingen</td><td>07-1401</td><td>4 &deg;C</td></tr><tr><td>抗ラミニン抗体</td><td>DAKO</td><td>Z0097</td><td>4 °C で保存;C</td></tr><tr><td>繁殖用食品</td><td>例: PROVIMI KLIBA SA</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>個別換気ケージ、ブルーライン タイプ II または III</td><td>例: Tecniplast </td><td>1145T、1285L</td><td></td></tr><tr><td>BSA フラクション V</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td>4 >C</td></tr><tr><td>冷ゼラチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 9391</td><td></td></tr><tr><td>Coplinジャー+ラック</td><td>(例:Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>H554.1);H552.1</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 抗ラット抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-156-144</td><td>4 °C で保管;C;光から保護する</td></tr><tr><td>カバースリップ 24 x 40 mm # 1</td><td>例:Thermo Scientific</td><td>85-0186-00</td><td></td></tr><tr><td>Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW)</td><td>例:分子プローブ</td><td>D22910</td><td>-20 >C;光から保護する</td></tr><tr><td>デキストランテキサスレッド (3000 MW)</td><td>Invitrogen</td><td>D3328</td><td>-20 >C;</td></tr><tr><td>EnzChek ゼラチナーゼ/コラゲナーゼアッセイキットを光から保護します&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック;EnzCheck</td><td>E12055</td><td>-20 &deg;C;保護形態</td></tr><tr><td>の光 雌 C57BL/6J マウス (8-12 週)</td><td>例: Janvier Labs</td><td></td><td>雌、8-12 週</td></tr><tr><td>組織学スライド用凍結ボックス</td><td>例: Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>2285.1</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1&frac12;&rsquo;&rsquo;(1.2mm x 40mm)注射針</td><td>(例:BD、BD Microlance 3</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>27G x &frac34;&rsquo;&rsquo;&ndash;Nr. 20 (0.4mm x 19mm) 注射針</td><td>例: BD, BD Microlance 3</td>, <td>302200</td><td></td></tr>, <tr><td>30G x &frac12;&rsquo;&rsquo;(0.3 mm x 13 mm) 注射針</td><td>例: BD、BD Microlance 3</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>不完全フロイント'アジュバント(IFA)</td><td>例:Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-24648</td><td>Store at 4&deg;C</td></tr><tr>メンテナンス<td>食品</td><td>、例:PROVIMI KLIBA SA</td><td>3436</td><td></td></tr><tr><td>MOGaa35-55ペプチド</td><td>、例:GenScript</td><td></td><td>ストア、-80°C;C</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド(Superfrost Plus)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>結核菌H37RA</td><td>など、BD</td><td>231141</td><td>4°Cで保存します。C&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl 0.9 %</td><td>B. ブラウン</td><td>3535789</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. コンパウンド (Tissue-Tek )</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50 30G x &frac12;&rsquo;'</td><td>B. Braun</td><td>9151125S</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>メルク</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>百日咳毒素</td><td>例: List biological laboratories, Inc.</td><td>180</td><td>4 °で保管。C</td></tr><tr><td>ポリ(ビニルアルコール)(Mowiol 4-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤EDTAフリー(ロシュ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693132001</td><td>4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>忌避ペン(例:DAKOペン</td>)、<td>例:DAKO</td><td>S2002</td><td></td></tr>、<tr><td>シーリングフィルム(例:Parafilm)、M</td><td>例:Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td></td></tr>、<tr><td>シリカゲル</td>(<td>例:Carl Roth GmbH + Co.、</td><td>KG 9351.1</td><td></td></tr>)、<tr><td>スティッチハサミ</td><td>、F.S.T</td><td>15012-12</td><td></td></tr>、<tr><td>シリンジ1ml</td>(例:<td>PRIMO</td><td>62.1002</td><td></td></tr>)、<tr><td>シリンジ10ml</td>(<td>例:CODAN Medical)ApS</td><td>2022-05</td><td></td></tr><tr><td>気化器システム Univentor 400</td><td>UNO.</td><td></td><td></td>BV</tr></tbody></table>の

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

単位 (NVU) は血液-脳関門 (BBB) 埋め込みペリサイトの内皮の基底膜を形成微小血管内皮細胞で構成され、グリア limitans 実質の基底膜とアストロ サイトの構成エンドフィード中枢神経系 (CNS) 微小血管の abluminal 側面を採用します。中枢神経系を維持するために加えて、NVU の恒常性は、免疫細胞が中枢神経系に人身売買を制御します。食餌中枢神経系の中に活性化リンパ球の数が少ないは BBB の機能不全や臨床疾患を引き起こすことがなく内皮の障壁を越えることができます。対照的に、多発性硬化症の動物モデルとしてなど neuroinflammation 中実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) の免疫細胞の数が多いことが出来る BBB とその後中枢神経系柔に最終的に到達するグリア細胞 limitans臨床病気に 。
中枢神経系細胞に免疫細胞の移動、異なる分子メカニズムを用いる NVU の内皮細胞およびグリア細胞の境界を越えたシーケンシャル移行は、2 段階のプロセスです。内皮バリアを越えた次の通路、T 細胞が発生するローカル再活動開始以降機構 gelatinases の焦点の活性化につながる血管抗原提示細胞上の同種抗原をグリアの関門を通過して中枢神経系実質 T 細胞になります。したがって、BBB 透過性と EAE の中に中枢神経系の免疫細胞集積に対する空間相関の MMP 活性の両方を評価する、NVU の内皮細胞およびグリアの障壁の完全性の損失を指定することができます。 
能動免疫による c57bl/6 マウスに惹起を誘導する方法、およびその後 BBB 透過性外因性蛍光トレーサーの組み合わせを使用して体内を分析する方法を示します。我々 はさらに表示、視覚化および原 zymogaphy BBB 基底膜と CD45 + 侵略免疫細胞の免疫蛍光染色に結合によって EAE 脳中のゼラチナーゼ活性をローカライズする方法。

C57bl/6 マウス EAE の臨床研修の評価は、図 2 aおよび図 2 bに示されるように、マウスの体重の変化で表した病曲線の結果必要があります。通常 MOGaa35 55 で免疫した c57bl/6 マウスは、能動免疫 (図 1 a) 後病の症状は 1 日 10-12 の周りを開発し始めます。通常、免疫マウスは体重の一時的なドロップの乳剤の注入と百日咳毒素 (図 1 b) の最初の投与後の日を表示します。EAE 誘導後、2 日から、免疫マウスの体重徐々 に病開始まで体重通常臨床症状発症前に一日をしましたが、増加に減少が続いている、病の症状 (図 1 a,B)。EAE の疾患の重症度は、16 と EAE 誘導 (図 2 a) 後 20 日間が期待...

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans にわたってゼラチナーゼ活性の白血球の遊走に関与する血液-脳関門の透過性を確認する方法に取り組みます。

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

ここで紹介する方法は、多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎における脳関門を越えた免疫細胞移動の分子メカニズムを研究することを可能にする。脳組織切片における免疫細胞浸潤との空間相関において、血液脳関門透過性とマトリックス-メタロプロテアーゼ活性を同時に調べ、これらの神経炎症事象をEAEの臨床徴候に正確に関連付けることができる。病気のマウスの専門的な取り扱いには、EAEの臨床徴候の正しいスコアリングと同様に、綿密な訓練が必要です。したがって、視覚的なデモンストレーションは有益です。テキストプロトコルに記載されているように、特異的病原体フリー状態で収容されたC57-Black/6マウスの麻酔で、この手順を開始する。麻酔マウスを片手に固定し、30マイクロリットルのMOGペプチドを注入し、フロイントのアジュバントエマルジョンを後肢の各側面に皮下に完全に、リンパ節に近接します。今度は、マウスを腹の上に置き、20マイクロリットルのMOGペプチドエマルジョンを尾根の左右の軟脂肪組織に注入します。また、マウスの首にエマルジョンの液滴を少し注入する。百日食毒毒素溶液を腹腔内に100マイクロリットル注入します。腸への注入を避けるために、マウスの頭を身体の中心の下に持ちます。期待される臨床疾患の前および中にマウスに高いエネルギー含有量の食物を与えるために、飼育食に維持食を置き換える。最初の治療の48時間後に、ペルタシス毒素注射を繰り返す。毎朝、ケージの中を見てEAEマウスの健康状態を確認してください。EAEマウスを毎日午後にスコア付けします。EAE実験に含まれるすべてのマウスをケージから取り出し、尾にトーヌスがあるかどうかを確認します。指で尾を上に動かします。健康なマウスは尾を上げておきます。臨床EAEが開始された場合、尾のトヌスは低くなり、尾の徐々に低下することによって見える。最終的には、マウスは尾を持ち上げることができないでしょう。EAE実験に含まれるマウスをクリーンベンチに置き、歩行の動作を観察し、文書化します。EAE スコアである疾患の重症度の評価のスコア基準のテキストを参照してください。実験に含まれるすべてのマウスの重みを評価し、文書化します。デキストランストック溶液を調製するには、3キロダルトンデキストランテキサスレッドの10ミリグラムを0.9%塩化ナトリウム溶液の500マイクロリットル、10キロダルトンデキストランアレクサフルオール488の5ミリグラムを0.9%塩化ナトリウム溶液の250マイクロリットルで溶解します。デキストラン作業ソリューションの場合、注入の直前に、10キロダルトンデキストランアレクサFluor 488ストック溶液のピペット55マイクロリットルをシーリングフィルムの一部に。その後、3キロダルトンデキストランテキサスレッドストック溶液の55マイクロリットルを追加します。100マイクロリットルを使い捨ての細かい注射器に混ぜて集める。次に、麻酔マウスをテーブルの横方向の位置に置きます。マウスが目を覚ます前に、100マイクロリットルの蛍光トレーサーをマウスに静脈内注入する。トレーサーは、テキストプロトコルに詳述されているようにマウスの灌流を行う前に15分間循環させます。平らなデュワーコンテナに砕いたドライアイスを充填し、液体がドライアイスパックの上約1センチメートルに達するまで2-メチルブタンを追加します。アイスバケツカバーなどのゆるい蓋で覆います。鋭いはさみで浸透したマウスの頭を切り取った後、より小さいはさみを使用して皮膚と耳を取り除きます。頭蓋マグナムから左側と右側の前部に向かって切断して頭蓋骨を慎重に解剖し、頭蓋骨を脳の上にアップフォールディングできるようにします。その後、平らな金属ヘラを使用して光学神経を切断しながら、頭蓋骨の基部から無傷の脳を慎重に持ち上げます。アルミ箔の上に脳を置きます。2つのコロナカットを置くことによって3つの部分に脳をカットします。3つの部分は、脳幹を持つ前頭脳、中脳、小脳を表す。クイオムオールドを第1四半期に最適温度切断マトリックスで満たします。その後、各脳片の前側を下向きにして、脳スライスをクリオマールルドに入れる。マトリックスで完全に組織を覆います。2-メチルブタン浴に水平に組織を持つクリオマールを置きます。組織ブロック全体を浴槽に浸さないようにして、1分以内に組織が下から上に凍っていることを確認します。凍結した組織をマイナス80°Cに移して保管します。凍結組織切片の準備のためのテキストプロトコルを参照してください。EAEマウスから調製された6ミクロンの非固定脳組織切片を取り出す。ヒュームフードでは、シリカゲルを含むプラスチック製の冷凍ボックス内のセクションを解凍して、組織内の水の保持を避けます。1つのスライド上の2つの組織セクションを、撥水ペンで線を引いて分離します。遠心分離反応液は、13で5分間、室温で300グラム、水浴を用いて摂氏37度に予熱した。その後、1X反応バッファーを使用して、37°Cで5分間組織切片を水分補給します。5分後、1X反応バッファーを注ぎます。組織切片に反応液を加え、摂氏37度で4時間インキュベートする。その後、スライドを二重蒸留水で5回洗います。今、室温でPBSで一度それらを洗浄する前にマイナス20°Cで氷冷メタノールで5分間セクションを修正します。セクションにPBSに1%BSAを加え、室温で20分間インキュベートします。次に、組織上のスライドを反転させることにより、セクションからバッファーを廃棄する。一次抗体カクテルをセクションに加え、室温で1時間インキュベートします。セクションをPBSで2回洗浄した後、二次抗体カクテルを加え、室温で1時間インキュベートする。次に、セクションをPBSで2回洗浄し、埋め込み溶液でスライドを取り付けます。取り付けられた切片を室温で一晩乾燥させた後、蛍光顕微鏡を用いて染色された組織切片を分析する。EAE疾患の重症度は、EAE誘導後16日から20日の間に予想される疾患のピークまで増加する。臨床EAEのピーク時には、マウスはまた、疾患の寛解期におけるEAEの改善に対する相関性が高まる最も低い体重を示した。ここに示されているのは、EAEに罹患しているC57-Black/6マウスの脈絡叢と隣接する脳のパレンチマの代表的な画像です。マウスを犠牲にする15分前に静脈注射した。トレーサーはフェネトレートされた微小血管を横切って脈絡叢のストーマに容易に拡散し、血液脳関門は循環トレーサーを脳の円質に拡散することを許さないため、蛍光シグナルは欠いている。これらの画像は、EAEに罹患しているC57-Black/6マウスの小脳における代表的な漏れやすい血管を示しています。矢印は、トレーサーが脳内の微細血管を横切ってCNSパレンチマに拡散したことを示し、これらの血管において血液脳関門機能が損なわれることを示唆している。CNSのパレンチマでは、緑色と赤色の蛍光シグナルが血管壁の外に見えます。MOG-CFAエマルジョンの正しい皮下配置は、EAEにつながる適切な免疫応答をマウントするために不可欠です。腹腔内注射と筋肉内注射は避けるべきである。CFAをヒュームフードの下で準備し、減衰したマイコバクテリウムの吸入を避けます。また、MOG-CFAエマルジョンによる自己注射は避け、これは、遺伝的に素因がある個人において、結色素を引き起こしたり、EAEに至る可能性もあるので、避けてください。脳浸潤免疫細胞は、EAEに罹患しているマウスのCNSから単離して、フローサイトメトリーによる神経炎症時の浸潤免疫細胞サブセットを定量化することができる。内皮およびグリア脳関門の完全性を評価することは、遺伝子組み換えマウスモデルの分析または他の神経疾患のモデルに翻訳することができる。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質と不活性化結核菌の組み合わせを注入することにより、マウスモデルで実験的な自己免疫性脳脊髄炎を誘発する方法を示しています。このモデルにより、研究者は疾患のメカニズムを研究し、治療的介入をテストすることができます。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このビデオは、ミエリン由来のペプチドにアジュバントを注入して自己反応性T細胞を活性化し、脳に移動することにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発する方法を示しています。百日咳毒素は、血液脳関門の透過性を高めるために投与され、これらのT細胞や他の免疫細胞が脳に入ることを可能にします。これらの免疫細胞は脱髄を引き起こし、神経伝達の障害とEAEの発症につながります。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の生成

このビデオは、EAEマウスモデルにおける血液脳関門の破壊を評価する手順を示しています。さまざまなサイズの蛍光色素が眼窩後方向に注入され、脳の血管を循環します。小さい色素は隙間から脳組織に漏れますが、大きい色素は混乱が深刻な場合にのみ入り、バリア損傷の程度と相関します。...

EAEマウスモデルにおける蛍光色素を用いた血液脳関門破壊の決定

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

出典: Schmitz, K., et al., マウスの多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎および脳炎症の生物発光および近赤外イメージング. J. Vis. Exp.

EAEマウスモデルにおける生物発光イメージング

実験的自己免疫性脳脊髄炎を研究するために、成体マウスの露出した脊髄にガラス窓を埋め込み、維持する方法を説明します。これらのウィンドウは、2光子顕微鏡を使用して生きた動物の細胞内レベルで細胞動態を監視するための脊髄への慢性的な光学アクセスを提供します。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎の成体マウスにおけるガラス脊髄窓の埋め込み

このプロトコルは、実験的自己免疫性脳脊髄炎の薬理学的治療が免疫細胞の浸潤を抑制した結果として中枢神経系の防御を示すか、または免疫細胞の浸潤の猛攻撃中に神経保護的であるかを決定する方法を説明しています。...

自己免疫性脱髄に薬理学的介入のためのCNS保護に対する免疫系の抑制を決定します

我々は、in vivoでのライブ生物発光およびSJL / Jマウスにおける多発性硬化症の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける視神経炎や脳炎の近赤外イメージングのための技術を示します。...

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

このプロトコルの目的は、リッセンセファリックおよびギレンセファリック脊椎動物の中枢神経系の複数の領域から微小血管を分離することです。...

5つの脊椎動物群にわたる中枢神経系微小血管の信頼性の高い絶縁

本稿は、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するプロトコルを提示する。中枢神経系(CNS)における浸潤リンパ球の単離および特徴付けの方法も提示され、リンパ球がCNS自己免疫疾患の発症にどのように関与しているかを示す。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系におけるリンパ球浸潤のフロー細胞量分析

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は、多発性硬化症の動物モデルとして機能します。この記事では、EAEにおける脊髄の炎症、脱髄、および軸索損傷をスコアリングするためのアプローチについて説明します。さらに、マウス血清中の可溶性ニューロフィラメント光レベルを定量化する方法が提示され、生きたマウスの軸索損傷の評価が容易になります。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎における中枢神経系の炎症、脱髄、および軸索損傷のスコアリング

学ぶ実験的自己免疫性脳脊髄炎における血脳関門透過性とマトリックスメタロプロテアーゼ活性の評価法。C57BL/6マウスを用いて神経炎症時の免疫細胞浸潤メカニズムを可視化し、多発性硬化症研究に貢献します。

生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

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