組み立て済みプラスチックマイクロ流体チップ内のヒト幹細胞由来ニューロンの区分化
2019年5月3日
このプロトコルは、コンパートメント化されたマイクロ流体チップの使用を示し、環状オレフィン共重合体で成形された注射をヒト幹細胞から分化した培養ニューロンに対して行う。これらのチップは、従来のコンパートメント化ポリ(ジメチルシロキサン)デバイスよりも組み立て済みで使いやすいです。ウイルス標識、流体単離、軸除染、免疫染色など、複数の一般的な実験パラダイムがここに記載されています。
区画化された微小流体デバイスは、ニューロンを極偏の形で研究することを可能にする。これらのデバイスは、基本的な神経科学と翻訳神経科学の研究の両方に役立ちます。このプロトコルは、環状オレフィン共重合体チップを使用して、ヒト幹細胞から分化したニューロンを区分化する方法を説明する。
これらのCOCチップは、PDMSマルチコンパートメントデバイス上で分化されたニューロンのより健康的な培養を生成します。このプロトコルでは、NIH承認のH9幹細胞株と区別されるニューロンの培養を実証する。同様の手順を使用して、ニューロンをmIpSCsと区別することができます。
マルチコンパートメントチップは、加湿を加湿して二次封じ込めに配置する必要があります。マルチコンパートメントチップのチャネルは、プレコート溶液で満たされ、その後PBSでフラッシュする必要があります。まず、ポリL-オルニチンを細胞培養グレードの蒸留水に溶解し、チップあたり600マイクロリットルの溶液を作ります。
残りのPBSを井戸から吸引し、ピペット先端がチャネル開口部から離れているようにします。右上ウェルにポリL-オルニチンの作業溶液の150マイクロリットルをロードします。90秒待ってから、右下ウェルに150マイクロリットルの溶液を加えます。
5分間待ってから、左の井戸の溶液でローディングプロセスを繰り返します。その後、加湿器トレイにチップを入れて、一晩で摂氏4度にします。ペトリ皿を使用する場合は、パラフィルムで包み、一晩摂氏4度に置きます。
次に、ウェルから溶液を吸引し、ピペット先端がチャネル開口部から離れて配置されることを確認する。そして、滅菌水のそれぞれ150マイクロリットルで右と左の井戸を2回積み込んで繰り返します。ラミニン作業溶液を準備します。
ラミニン作業溶液のそれぞれ150マイクロリットルで右と左の井戸をロードします。トレイ内のチップを37°Cで2時間インキュベートします。カルシウムとマグネシウムを使わずにPBSでチップをすすぎ。
PBSのそれぞれ150マイクロリットルで右と左の井戸をロードします。5分間待ちます。井戸からPBSを吸引し、NSC培地でチップをすすいだ。
右と左の井戸にそれぞれ150マイクロリットルを積み込みます。チップをプレコンディショナーに5%CO2で37°Cインキュベーターでトレイに一晩インキュベートします。ヒト神経幹細胞をマルチコンパートメントチップに播種するには、まずヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を計る。
その後、井戸からメディアを吸引します。右上ウェルに細胞溶液のピペット5マイクロリットル、右下ウェルに5マイクロリットルが続く。顕微鏡を使用して、細胞がチャネルに入っていることを確認します。
細胞がチップの底に付着するまで5分間待ちます。ピペットは右および左の井戸にNSC媒体のおよそ150マイクロリットル。適当な加湿容器内の5%CO2、摂氏37度でインキュベート。
48時間後、井戸からNSC培地を吸引し、各上部ウェルと各底部ウェルに150マイクロリットルを加えることによって神経分化培地に置き換えます。5%CO2内の培養ニューロン、加湿器トレイ内の摂氏37度インキュベーター。軸索コンパートメントから残りの神経分化培地を取り出し、遠心分離管に入れます。
摂氏37度で保管してください。50マイクロリットルのウイルス溶液を150マイクロリットルの温めた媒体と混合する。ピペット100マイクロリットルの混合物を軸索コンパートメントの両方のウェルにする。
37°Cインキュベーター内で2時間インキュベート。ウイルス含有メディアを撤回し、廃棄する。1つの軸索コンパートメントによく新鮮なメディアの75マイクロリットルを穏やかにピペットし、メディアがチャネルを通って他の軸索井戸に流れ込みます。
このプロセスを 1 回繰り返します。最後に、保存した培地で軸索コンパートメントを充填し、チップをインキュベーターに移します。分化媒体を用いてチップで1週間後、ヒト神経幹細胞はニューロンに分化し、体性コンパートメント内に均等に分布して分布した。
これに対し、PDMSデバイスのニューロンは、分化培地の添加後早くも5日で凝集し、細胞の健康が損なわれた。mCherry蛍光タンパク質を用いた標識ニューロンおよび樹状脊椎の可視化は、チップ内で分化したNSC由来ニューロンが成熟したシナプスを形成することを示した。ニューロンは興奮性シナプスマーカー、vGlut1に対して標識された。
免疫染色結果は、ウイルス標識されたニューロンがvGlut1、およびニューロン特異的マーカーであるβ-チューブリン3と共局化できることを示している。ウイルス伝達されたmCherryニューロンは、予め組み立てられたチップ内に確立された軸索局在性微小環境に射影を拡張する。奇数の前と直後にmCherry標識ニューロンの画像間の比較は、完全に切断された軸索を示した。
アキソトミー手順を実行する場合を除き、チャネルが流体で満たされていることを確認することが重要です。COC区画化チップは使いやすく、神経損傷、シナプス形成、シナプス可塑性、疾患の病態生理学に関連する多数の調査への扉を開くことができます。
概要
このプロトコルは、ヒト由来の幹細胞から分化したニューロンの培養に、サイクリックオレフィンコポリマー（COC）製の区画化されたマイクロ流体チップの使用を示しています。この研究は、ウイルスマーキングや免疫染色を含む様々な実験パラダイムに対するこれらのチップの使用に関する洞察を提供し、ニューロンの挙動とメカニズムに関する調査を促進します。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- マイクロ流体工学
背景
- 区画化されたマイクロ流体デバイスは、分極した形でのニューロンの研究に不可欠です。
- COCチップは従来のPDMSデバイスと比較して、より健康的な培養を生み出します。
- このプロトコルには、ヒト由来の幹細胞からニューロンを分化させる手順が含まれています。
- これらのデバイスは、神経損傷、シナプス可塑性、および関連する病態生理学的状態の探索に役立ちます。
研究目的
- ニューロンの培養にCOCマイクロ流体チップの有効性を示す。
- 細胞操作とニューロンの挙動の観察のための方法を詳細に説明する。
- 従来の方法に比べて、組み立て済みのCOCチップを使用する利点を強調する。
使用された方法
- サイクリックオレフィンコポリマー製の区画化されたマイクロ流体チップが使用されました。
- ヒト神経幹細胞はデバイス内で分化し、培養されました。
- 主要なタイムラインには、様々な温度とCO2レベルでの培養期間が含まれていました。
- 使用された技術には、ポリ-L-オルニチンコーティング、ラミニン塗布、およびウイルスマーキングが含まれていました。
主な結果
- 培養後、ニューロンがチップ内に均一に付着し、効果的な分化を示しました。
- 免疫染色により、成熟したシナプスの存在とニューロンマーカーの適切なマーキングが確認されました。
- 結果は、PDMSデバイスと比較して、ニューロンの健康状態と分布に有意な違いを示しました。
- ウイルスマーキングにより、軸索局在環境へのニューロンの投射が成功裏に行われていることが示されました。
結論
- この研究は、生存率の高いニューロンの培養のための信頼できる方法を示しています。
- 結果は、ニューロン損傷とシナプス機能に関する新しい調査の大きな可能性を示唆しています。
- COCチップの使用により、神経メカニズムと疾病モデリングに関連する様々な研究分野を促進することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Compartmentalized microfluidic chips fabricated from cyclic olefin copolymer (COC) enable precise spatial control of human stem cell-derived neuron cultures, supporting advanced mechanistic studies in neurobiology. This platform enhances predictive confidence in neuronal differentiation, synaptic maturation, and injury modeling, directly impacting early discovery and translational neuroscience pipelines. The standardized chip format facilitates reproducible workflows and integration with high-resolution imaging, supporting portfolio-wide assay development and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal differentiation and synaptic connectivity in a controlled microenvironment.
- Supports mechanistic de-risking by isolating axonal and somatic compartments for targeted perturbations.
- Facilitates functional target validation through compartment-specific interventions and readouts.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, slide-compatible platform for quantitative imaging and immunocytochemistry.
- Enables reproducible preparation of disease-relevant neuronal systems for downstream screening.
- Supports assay scalability and platform reuse across multiple experimental paradigms, including viral labeling and axotomy.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease modeling by enabling studies of neuronal injury, synaptogenesis, and plasticity.
- Maintains translational continuity from stem cell differentiation to mature neuron function within a single device.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions by providing robust, physiologically relevant data.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic chip method bridges early discovery, assay development, and translational research by enabling compartmentalized neuron culture, manipulation, and analysis within a unified workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neuronal differentiation, synaptic formation, and injury response.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables high-content imaging, immunostaining, and quantitative marker analysis across compartments.
- Translational Research: Provides a platform for modeling disease-relevant neuronal processes and injury mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, standardized chip format compatible with diverse experimental needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuronal assays and reduces mechanistic ambiguity in neurobiological studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of neuron culture workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust, high-content data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurobiology-focused discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, neuronal differentiation, and microfluidic device handling.
- Needs access to high-resolution microscopy and immunocytochemistry infrastructure.
- Demands cross-team standardization of chip preparation and experimental protocols.
- Adaptable to various human stem cell lines and neuronal subtypes with protocol optimization.
- Maintaining optimal humidity and temperature is critical for long-term neuron health and reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:45
Preparation of the Multi-compartment Chips
1:05
Coating of Multi-compartment Chips for hSC-neurons
2:59
Seeding NSCs into the Multi-compartment Chip
4:05
Viral Fluorescent Labeling of hSC-neurons within the Chip
5:02
Results: Using Compartmentalized Microfluidic Chips to Isolate Neurons Differentiated from Human Stem Cells
6:16
Conclusion
