Name: 低酸素/SU5416モデルを用いたマウスにおける肺高血圧の誘導と特徴づけ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぶ 低酸素とSU5416を用いたマウス肺高血圧誘導法。右心室機能測定と形態学的評価により、心血管病理生理学研究の新規治療標的を探索する。

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この研究は、米国心臓協会(AHA-17SDG3370112および18IPA34170258)からの助成金によって支えられ、国立衛生研究所NIH K01 HL135474からY.S.O.Bへのドイツハーツティフトゥンによってサポートされました。

動物実験の前に、地元の機関動物ケア委員会の認可を得る。現在の実験は、シナイ山のイカーン医学部の施設動物ケア・使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。
1. PH誘導
<ol><li>準備<ol>
<li>研究を始める前に、慎重に実験計画を立ててください。最初のSU5416注射と同時に、マウスが低酸素症に供されることを確認してください。低酸素/SU5416法を用いてPHを誘導するための実験計画の一例を 図1Aに示す。制御マウスは車両のみを受け取った。このモデルでは、SU5416を3週連続で週に1回マウスに注射する。</li>
		<li>この研究には8〜12週齢のC57BL/6マウスを使用する。12-hの明暗サイクルで18-20 °Cで動物を収容する。食べ物と水がアクセス可能な アドリビタムであることを確認します。</li>
		<li>動物の重量を量る。ノルモキシアと低酸素/SU5416:各グループにランダムにそれらを割り当てます。</li>
		<li>図1B.安全な窒素(N2)タンクに示すように、2低酸素室をチャンバー近くに準備します。酸素(O2)コントローラを10%O2の点にセット2する。システムを安定状態にします。</li>
		<li>注射用のSU5416を準備します(体重20mg/kgの用量を使用してください)。SU5416は水溶液に溶解しません。したがって、計算量を100 μL DMSO8に溶解します。例えば、25gマウスの場合、注入されるSU5416の量は、100μL溶媒(DMSO)に溶解した0.5mgである。このマウスのSU5416の最終濃度は、したがって、5 mg/mLです。 注意: SU5416 は危険物です。製品に付属の安全データシートをよく読み、この物質を取り扱う際には必ず推奨の注意事項を取ってください。保護手袋を着用し、(注射用)目の保護を使用してください。SU5416の化学構造を図1Cに示す。 注:溶液の適切な過剰を計算して、注入中に失われるボリューム(注射器、バイアルなど)を補正します。使用するシリンジに応じて、デッドボリュームは約200μLです。10匹のマウスのグループについて、2回のマウス投与量を超えて計算する。</li>
		<li>注射用注射器を準備します。25 G x 5/8 インチ針で 1 mL の注射器を使用してください。</li>
	</ol></li>
	<li>SU5416皮下注射<ol>
<li>動物を拘束します。ケージの蓋にマウスを置き、拘束を助けます。皮膚をつかみ、背骨に平行にテントを形成する。マウスによる咬傷の可能性を避けるために、頭の後ろをつかむことを確認してください。 注:2人の研究者の存在は、一方が動物を保持し、もう一方が注射を行うことができるので、手順をより速く、より正確にします。</li>
		<li>皮膚の緩い折り目で脇腹の上に皮下に針を挿入します。針を皮膚に平行に挿入してください。腹壁に浸透しないようにしてください。</li>
		<li>シリンジの内容(溶解したSU5416または車両の100 μL)を注入します。 注:完全な配達後に漏れを避けるために、注射器を約10 s保持し、針を皮膚の下でわずかに回転させます。</li>
		<li>針を引き出し、ケージに動物を戻します。SU5416注入後、換気された低酸素室にケージを入れます。</li>
	</ol></li>
	<li>低酸素症への暴露<ol>
<li>時間をかけて換気を監視します。酸素供給の10%を維持することを確認してください。21%O2で半密閉可能なチャンバーでノルモキシア動物を維持する。</li>
		<li>チャンバーに酸素レベルを測定する酸素センサーが装備されていることを確認します。チャンバーの広範な開口部を避けてください。清掃と食品や水を追加するために、3日ごとに20分以上のチャンバーを開きます。</li>
		<li>毎日動物を検査します。ピロ勃起や体重の大幅な減少などのストレス信号を考えてみましょう。 注意:低酸素/SU5416の下の動物は体重5を失うことが期待されています。これは病気の発症を示す指標です。</li>
		<li>連続して 3 週間連続して毎週 SU5416 注入を繰り返します (実験計画の概要については 、図 1A を参照)。 注:注射部位を変化させることは、皮膚刺激を軽減するのに役立ちます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 侵襲的RV圧力測定による機能特性評価
<ol><li>準備 注: 麻酔体制を選択します。注射可能または吸入可能な麻酔薬を使用することができる。注射用麻酔薬のわずかな過剰摂取(特にケタミン/キシラジンまたはペントバルビタールから)が心臓機能に大きな影響を与える可能性があるため、揮発性麻酔薬の使用が推奨されます。研究内のすべてのマウスに同じ麻酔薬を使用することは非常に重要です。<ol>
<li>動物ごとの正確な麻酔薬の線量を保証するために気化器を使用してください。イオブルランの用量は以下の通りである:誘導3〜4%、維持1%が100%酸素と混合した。 注:個人用保護具を着用し、蒸気を吸い込むのを避けてください。</li>
		<li>体温を維持するために、加熱パッドや温ランプを用意してください。体温を監視するための直腸温度プローブを準備します。</li>
		<li>適切な換気を確認してください。事前に人工呼吸器を用意してください。Yチューブコネクタを用意し、手動モードで人工呼吸器の機能を確認します。圧的な外傷を避けるために、吸気圧が<1cmH2Oであることを確認してください。呼吸数を110呼吸/分に設定します。</li>
		<li>20Gの血管内カテーテルを切断して気管内チューブを準備します。</li>
		<li>必要な器具を準備する:小さな鉗子、はさみ、弾性フックレトラクター、容器の焼灼器、綿棒。綿棒で右心室に小さな穿刺を作るために使用される小さい25 G x 5/8"針を調節する。</li>
		<li>圧力カテーテル、圧力容積制御ユニットを準備し、データ取得ソフトウェアを開始します。37°CでPBSを充填した15 mLチューブにPVカテーテルを15分間置き、メーカーのプロトコルに従ってキャリブレーションします。</li>
		<li>臓器の灌流と固定のために、PBSと50%PBS / 50%OCTの溶液を調製し、2 x 10 mL注射器(25G針付き):1つは心臓と肺を PBSで 浸透させるために使用され、2番目のものは彼の検査に使用される肺標本にOCT / PBS(50/50)溶液を注入するために使用されます。</li>
	</ol></li>
	<li>挿管<ol>
<li>マウスの重量を量り、麻酔前に健康状態を記録します。</li>
		<li>3-4%のイオブルランで麻酔を誘発する。つま先ピンチ反射をテストすることによって麻酔の深さをチェックしてください:手足のつま先をしっかりとつまみます。動物が手足を引き出した場合、それは不十分な麻酔の徴候である。</li>
		<li>麻酔の誘導後、首と胸部を剃ります。</li>
		<li>マウスを加熱パッドに置きます。体温を監視するための直腸温度プローブを設置します。 メモ:体温の維持は機能測定のために重要である。体温は約36.5~37 °Cです。</li>
		<li>湾曲した鉗子を使用して、マウスの上部の切り口に縫合糸を取り付け、外科テープで加熱パッドに伸ばして固定する。手術用テープを使用して、マウスの手足を固定します。</li>
		<li>動物を挿管するために小さいはさみを使用して内側頸部の皮膚に約1cmの小さな切開を行います。 注: 口腔挿管は、より多くの経験を必要とする代替方法です。</li>
		<li>綿先端のアプリケーターは、中間レベルの耳下腺と下顎下唾液腺をぶっきらぼうに分離する。これは気管の上に筋肉を露出します。.</li>
		<li>気管を露出するこれらの筋肉を慎重にカットします。</li>
		<li>小さいはさみで気管軟骨の間に小さな切開を行い、準備された気管チューブを挿入します。血管内カテーテルの金属ガイドを取り出します。</li>
		<li>カテーテルを人工呼吸器に接続します。手動で肺を静かに膨らませて気管管の位置を確認します。テープでポジションを固定します。</li>
		<li>処置を通して1%のイオブルラン麻酔を維持する。</li>
		<li>つま先ピンチ反射をテストすることにより、定期的に麻酔の深さを監視します。それに応じて麻酔を調整します。 注:実験中の推奨心拍数は、1%イオブルラン麻酔下で、約400拍/分です。心拍数を制御するためには体温や麻酔の維持が不可欠です。イオブルランの過剰は心拍数を減少させることができます.しかし、回収はイオブルラン速度を低下させることによって達成できる。</li>
	</ol></li>
	<li>RV圧力測定(オープン胸部アプローチ)<ol>
<li>小さいはさみでは、xiphoidプロセスと上腹部部分の上に約1cmの皮膚切開を行います。胸部を覆う皮膚と腹部の腹部の腹部の壁を分離する:中央線から始まり、xiphoidに遠位し、両側を慎重に横方向に動かす。出血を制御するために熱コータリーを使用してください。 注: 目標は、腹壁を通って胸腔にアクセスすることです。</li>
		<li>腹腔を開き、鼓動する心臓や肺を傷めないように注意して、慎重に横隔膜を切断します。 注:目標は、心臓の頂点と右心室を露出することです。良好な露出および心臓の眺めはカテーテルの正しい配置のために重要である。手順全体の出血を避けることは非常に重要です.小さな空の体積変化でも右心の負荷が変化し、記録されたパラメータに影響を与える可能性があります。</li>
		<li>綿状のアプリケーターを使用して心膜をそっと取り除きます。</li>
		<li>心臓に圧力カテーテルを置く直前に、カテーテルをマウスの隣に持って来てください。</li>
		<li>針で準備された綿先端アプリケーターを使用すると、右心室の先端遠位部分に刺し傷が生じさせる。慎重に針を取り外し、この穴に圧力カテーテルを挿入します。 注: これは力を加えずに動作するはずです。これが不可能な場合は、心臓の延長傷害を避けるために、最初の穴の近くに新しい穴を作ってみてください。針は約3mmより深く挿入してはならない。</li>
		<li>右心室の方向に平行に圧力カテーテルを挿入し、先端を肺動脈に向けます。</li>
		<li>圧力波トレースを監視し、カテーテルの正しい位置を確認します。代表的なトレースは、 図 2に示されています。</li>
		<li>圧力信号が安定するようにします。呼吸を一時停止し、少なくとも3つの測定値を得る。個々の測定の間に動物が換気されることを可能にする。</li>
		<li>すべての測定が記録されたら、カテーテルを取り除き、水浴中のPBS充填チューブに戻します。 メモ:実験が完了したら、メーカーの指示に従ってカテーテルを清掃してください。</li>
	</ol></li>
	<li>安楽死と肺灌流<ol>
<li>実験が完了すると、マウスを排泄して安楽死させる。</li>
		<li>胸を広く開きます。はさみを使用して、胸骨全体を切断し、心臓や肺を傷めないように注意してください。</li>
		<li>虹彩はさみを使用すると、血液がチャンバーを離れることができるように左心室に小さな切開を行います。</li>
		<li>右心室に10mLのPBSを含む注射器の25G針を入れ、肺が血液を取り除くまでPBS溶液を注入する。</li>
		<li>このステップが完了したら、重要な組織収穫(心臓と肺)によって安楽死を確認する:カバと大動脈の付着物を切断し、心臓と肺 をブロックで取り除く。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 形態評価
<ol><li>心臓と肺を取り除いた直後(ステップ2.4.5)、心臓を分離し、両方の心房を取り除く。曲がった手切除ハサミで、左心室(LV)から右心室(RV)を慎重に解剖し、中隔(S)を左心室に残す。RVとLV +Sの重量を量り、フルトン指数= RV / LV + S (図3)5,95を9計算する。</li>
	<li>右心室の一部を取り、OCTプレフィル充填埋め込み型に配置します。右心室の他の部分をRNAやタンパク質分析に使用します。ドライアイスで凍結し、-80°Cで保管してください。</li>
	<li>虹彩はさみを使用して、心臓および他の残りの組織から肺を隔離する。 注:肺の準備のために、上記のような灌流(ステップ2.4.3-2.4.5)は非常に重要です。</li>
	<li>肺の一部を凍結し、RNA、タンパク質抽出または他のアッセイのためにそれを保存します。</li>
	<li>組織学的分析のために肺の他の部分を使用してください。この目的のために、使用されたローブ10、11,11の気管支に50%PBSおよび50%OCTを含むシリンジを挿入する。実験者は、注射器の含有量が組織に浸透すると肺が膨張することを容易に見ることができる。</li>
	<li>これらの肺片をOCTで事前に充填した埋め込み型に入れ込み、ドライアイスで凍結します。冷凍後、-80°Cで保存してください。</li>
	<li>クライオスタットマシンを使用してRVと肺の8μmセクションを準備します。空気は30分間室温でセクションを乾燥させます。</li>
	<li>10分間パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して室温でスライドを固定します。 注:PFAは既知のヒト発がん性物質です。化学発煙フード、適切な手順、および個人用保護具を使用して、暴露リスクを低減します。詳細については、材料安全データシート(MSDS)を参照してください。</li>
	<li>ヘマトキシリン/エオシン染色による血管リモデリング評価 注:肺の心臓および血管のリモデリングの構造変化を評価するために、ヘマトキシリン/エオシン染色を行う(図3)。<ol>
<li>ヘマトキシリン溶液で8分間染色する。</li>
		<li>水道水を5分間流し、蒸留水で素早くすすい水を流します。</li>
		<li>95%のEtOHで1分間、エオシン溶液で1分間の反染色でリンスします。</li>
		<li>脱水(80%エタノール10-30 s、100エタノール1分間、100%トルオール3分間)</li>
		<li>カバースリップで取り付け、カバーします。スライドを室温で一晩乾燥させます。 注: 染色に使用するソリューションは危険な場合があります。化学発煙フード、適切な手順、および個人用保護具を使用して、暴露リスクを低減します。詳細については、MSDS を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>ピクロシリウス赤染色による右心室線維症評価 注:ピクロシリウスレッド染色では、酸であるピクロシリウスレッドは、コラーゲン12に結合します。従って、この染色はコラーゲン含有量の組織学的検査に用いることができる。<ol>
<li>58°Cで予熱されたブイン溶液でスライドを1時間インキュベートします。</li>
		<li>スライドを水道水で洗い、10〜15分間セクションから黄色の色を取り除きます。</li>
		<li>0.1%の速い緑で室温で20分間汚す。</li>
		<li>1%酢酸で1分間リンスします。</li>
		<li>水道水で5分間すすいでください。</li>
		<li>0.1%シリウスレッドで室温で30分間染色し、続いてトルオールで脱水症状を起こす。 注意: 染色に使用するソリューションは危険な場合があります。化学発煙フード、適切な手順、および個人用保護具を使用して、暴露リスクを低減します。詳細については、MSDS を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>WGA染色によるRV心筋細胞肥大症評価 注:細胞レベルでの右心室(RV)の肥大は、小麦胚芽凝集剤(WGA)染色を行うことによって評価することができる(図4)。<ol>
<li>冷たいアセトン溶液でスライドを15分間固定し、その後3ステップのPBSで洗浄します(各5分)。</li>
		<li>ダコ溶液中の10%のヤギの血清を室温で30分間ブロックします。</li>
		<li>WGAでスライドをインキュベートする:WGA 1:200を追加し、暗闇の中で37 °Cで1 1/2時間インキュベートします。</li>
		<li>PBSで3回スライドを洗います。</li>
		<li>核酸染料でスライドをインキュベートします。</li>
		<li>PBSで3回スライドを洗います。</li>
		<li>取り付けのために、液体の過剰を取り除き、取り付け媒体およびカバースリップを適用する。暗い場所で室温で1時間スライドを乾かして、4°Cで保管してください。 注: 染色に使用するソリューションは危険な場合があります。化学発煙フード、適切な手順、および個人用保護具を使用して、暴露リスクを低減します。詳細については、MSDS を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>さらに、具体的に血管のリモデリングを評価するために肺の免疫化学を行います.例えば、平滑筋細胞染色は血管の筋肉質化を評価するのに使用でき、フォン・ヴィルブランド因子染色は内皮変化を視覚化するために使用することができる。これらのメソッドは、他の 5 で説明されています。</li>
</ol>

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著者は宣言するものは何もありません。

このプロトコルは、慢性低酸素症とSU5416注射(低酸素/SU5416)18の2つの病理学的刺激を組み合わせることによってマウスの18PHをモデル化する方法を記述する。このマウスモデルをヒトPH状態と相関させようとする試みにおいて、必然的に現在のPH分類を見なければならない、表1に示す。ほぼすべての形態のPHは、肺血管収縮および内皮および平滑筋細胞の異常増殖によって特徴付けられる。これは肺動脈の圧力の上昇につながり、その結果、右心室の後負荷が増加する。
PHの動物モデルを特徴付けるすべての試みは、肺血管系および右心室の組織病理学的リモデリングの証拠を含むべきである。シングルヒット低酸素マウスモデルは、血管系リモデリング22、3の軽度の形態に導きます。これらの病理学的知見には、内皮細胞、平滑筋細胞および線維芽細胞増殖を伴う、以前に非筋肉化血管の筋質化が含まれる。これらの知見は、第2のヒッ...

肺高血圧症(PH)は、右心カテーテル法,1,2によって評価されるように、平均肺動脈(PA)圧が安静時25mmHgを超える状態で定義される病1態生理学的状態である。PHに至る病気はさまざまです。PH関連条件を整理する試みとして、いくつかの分類システムが開発されました。現在の臨床分類は、複数のPH関連疾患を5つの異なるグループ1に分類する。この区別は、患者の様々なグループが臨床提示、病理、予後、および治療2に対する応答において異なる疾患を有するので重要である。表1は、各疾患の基本的な病理的特徴を補完する現在の分類を要約する。
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59252/59252tbl1.jpg"> 表1:グループ内の主な組織病理学的特徴とともに、PHの臨床分類の概要。低酸素/SU5416プロトコルのモデル化PHに適しています。このテーブルは19から変更されています。PH: 肺高血圧症,PAH:肺動脈性高血圧
PH関連疾患の治療の著しい進歩にもかかわらず、PHは治癒なしで残っており、3年の死亡率は20%から80%の間に30%の範囲である。これは、PHの根本的なメカニズムを理解し、その後、予防し、進行を遅らせ、病気を治す新しい治療法の開発に不可欠な必要性を示しています。動物モデルはこの範囲にとって極めて重要です。現在、PHを研究するために様々なモデルが存在する。興味のある読者は、このトピック2、3、43に2関する優れたレビューを4参照しています。PHに至る様々な疾患を念頭に置いて、ヒトPHの多様な状態を1つの動物モデルで完全に再現できないことは明らかです。利用可能な動物モデルは、i)シングルヒット、ii)2ヒット、iii)ノックアウト、およびiv)過剰発現モデル3に分類することができます。シングルヒットモデルでは、PHは単一の病理学的刺激によって誘発され、2つのヒットモデルはより重篤なPHを誘導し、複雑なヒト疾患をより密接に模倣することを目的とした2つの病理学的刺激を組み合わせる。病因学的な違いに加えて、いくつかの刺激は動物の種および遺伝的背景にも依存するPHモデリングの違いをもたらす4。
最も一般的に使用される古典的なPHげっ歯類モデルの1つは、慢性低酸素モデル2です。低酸素症は、ヒトだけでなく、いくつかの動物種においてPHを誘導することが知られている。低酸素症は、PHに対する生理学的刺激であるという利点を有する(表1)。しかし、げっ歯類のPHを誘導するために使用される低酸素症の程度は、ヒトよりもはるかに重篤であるが、単一の侮辱(低酸素)は、血管のリモデリングの軽度の形態にしか導かない。これは、人間の病気の重症度を模倣しません。第二ヒットの添加は、PHを誘導するための余分な刺激であり、有望な結果を示した:低酸素刺激と結合されたげっ歯類への化合物SU5416の注入は、より重度のPH表現型22、5、65,6を誘導する。SU5416は血管内皮増殖因子(VEGF)受容体-2の阻害剤である。それはVEGF受容体をブロックし、内皮細胞アポトーシスにつながる.低酸素条件下では、これはアポトーシス耐性内皮細胞のサブセットの増殖を刺激する。さらに、SU5416は平滑筋細胞増殖をもたらす。これらの効果の組み合わせは、肺循環の病理学的血管リモデリングをもたらし、PA圧力の上昇および右心室リモデリング22、5、75,7をもたらす。このモデルは、まずラット6で説明され、後でマウス4、5、75,に適用された。4マウスモデルは、ラットに比べて重症の血管リモデリングを呈する。さらに、ノルモキシアに戻すと、ラットではPHが進行し続け、一方マウスでは部分的に可逆性である。
以下のプロトコルは、低酸素/SU5416法(計画、タイムライン、実行)を用いてマウスでPHをモデリングするためのすべてのステップを説明する。さらに、モデルの特性評価は、このプロトコルに記載されています:機能的に(開胸技術を使用して右心室(RV)圧力を侵襲的に測定することによって、形態論的(左右の心室の両方を解剖して計量することによって)、組織学的(肺血管リモデリング、右心室心筋肥大および線維症を評価することによって)
このプロトコルで説明されているすべての手順と方法は、どの経験レベルでも調査担当者が簡単に実装できます。オープンチェスト技術(ここで説明)を用いたRVの機能測定は、現場でのゴールドスタンダード法ではないが、経験の浅い実験者でも迅速に学習し、正確に再現できるという利点を有する。

<table><tbody><tr><td>酢酸氷河</td><td>ロス</td><td>3738.1</td><td></td></tr><tr><td>アセトン、組織学グレードラボ</td><td>デポ</td><td>VT110D</td><td></td></tr><tr><td>ADVantage圧力ボリュームシステム</td><td>Transonic</td><td>ADV500</td><td></td></tr><tr><td>Bouinのソリューション</td><td>シグマ</td><td>Ht10132</td><td></td></tr>焼<tr><td>灼システム</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>接続チューブとバルブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コットンチップ アプリケーター</td><td>Covidien</td><td>8884541300</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ、24 x50 mm</td><td>Roth</td><td>1871</td><td></td></tr><tr><td>データ収集と分析</td><td>Emka</td><td>iox2</td><td></td></tr><tr><td>ダイレクトレッド 80</td><td>シグマ</td><td>365548-5G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (ジメチルスルホキシド)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュモン#5鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-10</td><td></td></tr>デュ<tr><td>モン#7ファイン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11274-20</td><td></td></tr>埋め込み<tr><td>金型</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E-6032</td><td></td></tr><tr><td>エオシン溶液シ</td><td>グ</td>マ<td>HT110216</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、実験室グレードカ</td><td>ロライナバイオロジカルサプライカンパニー</td><td>861285</td><td></td></tr><tr><td>ファストグリーンFCF</td><td>シグマ</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド&nbsp;</td><td>ゲイマー&nbsp;</td><td>T/Pump</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン 2</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>7231</td><td></td></tr><tr><td>低酸素チャンバー</td><td>Biospherix</td><td>A30274P</td><td></td></tr><tr><td>誘導チャンバー</td><td>DRE Veterinary</td><td>12570</td><td></td></tr><tr><td>挿管カテーテル (静脈内カテーテル SurFlash (20 G x 1") )</td><td>テルモ&nbsp;</td><td>SR*FF2025</td><td></td></tr><tr><td>アイリスはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>NDC-10019-360-40</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器</td><td>DRE 獣医</td><td>12432</td><td></td></tr><tr><td>マウス (C57BL/6)</td> <td>チャールズ リバー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニードル 25 G x 5/8 インチ</td> <td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>ティッシュ テック</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>PBS(リン酸緩衝生理食塩水)</td><td>コーニング</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>ピリン酸飽和溶液1.3%</td><td>シグマ</td><td>P6744-1GA</td><td></td></tr><tr><td>圧力容量カテーテル</td>トランス<td>ソニック</td><td>FTH-1212B-4018</td><td></td></tr><tr><td>リトラクター</td>ケン<td>トサイエンティフィック</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>静的酸素コントローラーProOx 360</td>バイオ<td>スフェリックス</td><td>P360</td><td></td></tr><tr><td>SU 5416</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8442</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Suture, black braided silk, 5.0</td><td>Surgical Specialties Corp.&nbsp;</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>サージカルテープ</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ 10 ml</td><td>BD</td><td>303134</td><td></td></tr><tr><td>針付きシリンジ 1 ml</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>Sytox グリーン ヌクレイン酸染色</td><td>Thermo Scientific</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>腱切開はさみ</td><td>Pricon</td><td>60-521</td><td></td></tr><tr><td>Toluol</td><td>Roth</td><td>9558.3</td><td></td></tr><tr><td>ベンチレーター&nbsp;</td><td>CWE</td><td>SAR-830/P</td><td></td></tr><tr><td>WGA アレクサ・フルーア&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>ロス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

低酸素/su5416モデルを用いたマウスにおける肺高血圧の誘導と特徴づけ

Induction and Characterization of Pulmonary Hypertension in Mice using the Hypoxia/SU5416 Model

肺高血圧症(PH)は、右心カテーテル法によって評価されるように、安静時25mmHgを超える平均肺動脈圧によって定義される病態生理学的状態である。疾患の広いスペクトルは、病因、病理組織病理学、臨床提示、予後、および治療への応答で異なるPHにつながることができます。過去数年間で大きな進歩を遂げたにもかかわらず、PHは未硬化の病気のままです。根本的なメカニズムを理解することは、新しい治療法の開発への道を開くことができます。動物モデルは、この目標を達成するための重要な研究ツールです。現在、PHの再現に使用できるモデルがいくつかあります。このプロトコルは、2 ヒット マウス PH モデルについて説明します。PH開発の刺激は、血管内皮増殖因子(VEGF)受容体アンタゴニストであるSU5416の低酸素および注射である。低酸素/SU5416の開始から3週間後、動物はヒトPH(主に1群)で観察された組織病理学的変化を模倣した肺血管改修を発症する。肺循環における血管の再モデリングは、右心室(RV)のリモデリングをもたらす。RV圧(開胸法を用いた)、RVの形態測定(心室の両方を解剖し、計量すること)および改造の組織学的評価(血管再造形と心臓の両方を評価して、RV心筋細胞肥大および線維症を評価することによって肺)を詳細に説明する。このプロトコルの利点は、野生型と遺伝子組み換えマウスの両方での適用の可能性、比較的容易かつ低コストの実装、および対象疾患の迅速な開発(3週間)である。この方法の制限は、マウスが重度の表現型を発症しないことであり、PHはノルモキシアに戻ると可逆的である。予防は、治療研究と同様に、(外科げっ歯類モデルとは対照的に)高度なスキルの必要性なしに、このモデルで容易に実施することができる。

本プロトコルでは、マウスにPHを誘導する低酸素/SU5416モデルの作成について詳細に説明する。さらに、観察期間の終わりに肺血管および心臓評価を行うための必要なステップをすべて詳述する。
このモデルの実験計画の概要を、図1A13,,14に示します。マウスは、ノルモバリック低酸素症(10%O2)2を受け、週に1回、SU5416を3週連続で皮下注射する。このプロトコルでPHを誘導するために使用される刺激は、図1Bおよび1Cに示されている。
VEGF受容体拮抗薬SU5416は、内皮細胞アポトーシスを引き起こすことによって作用し、したがって、アポトーシス耐性内皮細胞の増殖を可能にする。これは、肺血管系における血管...

このプロトコルは、低酸素症への暴露およびVEGF受容体拮抗薬の注射に基づくマウスにおける肺高血圧(PH)の誘導について説明する。動物は、プロトコルの開始から3週間後にPHおよび右心室(RV)肥大を発症する。モデルの機能的および形態的特徴付けも提示される。

低酸素/SU5416モデルを用いたマウスにおける肺高血圧の誘導と特徴づけ

Pulmonary Hypertension (PH) is a pathophysiological condition, defined by a mean pulmonary arterial pressure exceeding 25 mm Hg at rest, as assessed by ...

このプロトコルは、肺高血圧症を誘発し、右心室の機能測定を行うために使用することができる。Sugen低酸素モデルは、実装が容易であり、誘導後2〜3週間以内に肺高血圧症の特徴の一部を再現することができます。このモデルを用いて、疾患の発症に関与する新しい経路を特定できる。私たちは、新しいターゲットを特定し、その治療の可能性をテストすることができます。誘導手順を開始する前に、低酸素室の近くに窒素タンクを固定し、酸素コントローラを10%酸素の位置に設定します。次に、25ゲージ針を備えた1ミリリットルシリンジに作りたてのSU5416溶液をロードし、注入する最初の動物を手動で拘束する。皮膚をつかんで背骨に平行なテントを形成し、マウスによる咬傷の可能性を避けるために、頭の後ろをつかむことを確認します。緩い皮膚の側面の上に皮下に針を挿入し、皮膚に平行に折り畳まれ、注射器の内容物の100マイクロリットルを提供します。10秒後、針を引き出し、動物をケージに戻します。すべての動物が注射されたら、マウスを換気された低酸素室に入れます。低酸素暴露の場合、チャンバーに酸素レベルを測定し、3日ごとに20分以下の間、洗浄し、食べ物と水を加えるためにチャンバーを開けるための酸素センサーが装備されていることを確認してください。毎日動物にストレスの兆候がないか検査し、毎週3週間連続してSU5416注射を繰り返します。圧力測定手順を開始する前に、Yチューブコネクタを準備し、手動モードで換気装置の機能を確認します。気圧を避けるために、吸気圧を1センチメートル未満の水に設定し、呼吸数を毎分110呼吸に設定します。20ゲージの血管内カテーテルを切断して気管内チューブを作成し、圧力量制御ユニットをオンにします。データ取得ソフトウェアを開始し、37°Cの水浴でPBSの15ミリリットル遠心分離管に圧力体積カテーテルを置きます。次に、メーカーのプロトコルに従ってカテーテルを較正します。マウスを加熱パッドの上に置き、体温を監視するための直腸プローブを設置します。次に、麻酔マウスのつまみつまみへの反応が無い場合を確認し、首と胸部を剃ります。外科用テープでマウスの手足を固定し、内側頸部皮膚に1センチメートルの切開を行います。綿の先端アプリケーターを使用して、耳下腺と顎下唾液腺をぶっきらぼうに分離して、気管の根底にある筋肉を露出させる。慎重に気管を完全に露出するために筋肉をカットし、気管軟骨の間に小さな切開を作るためにはさみを使用しています。準備した気管内チューブを挿入し、血管内カテーテルの金属ガイドを取り外します。次に、カテーテルを人工呼吸器に接続し、手動で肺を静かに膨らませて気管管の位置を確認します。テープでポジションを固定します。右心室圧測定の場合、シフォイドプロセスと上腹部に1センチメートルの皮膚切開を行い、中線からシフォイドに遠位し、両側を慎重に横方向に移動させ、胸と腹壁の上に皮膚を分離します。腹腔を開き、横隔膜を慎重に切り、鼓動する心臓または肺を傷つけないように注意する。そして、綿の先端のアプリケーターを使用して、心膜を穏やかに取り除きます。マウスの近くに圧力カテーテルを持ってきて、右心室の非定型遠位部分に刺し傷を作るために針を装備した綿の先端のアプリケーターを使用する。慎重に圧力カテーテルで針を交換し、肺動脈に面した先端と右心室の方向に平行に圧力カテーテルを挿入します。カテーテルの正しい位置を確認するために圧力波のトレースを見てください。圧力信号が安定したら、呼吸を一時停止し、少なくとも3つの測定値を得ます。すべての測定が記録されたら、慎重に水浴中のPBS充填遠心管にカテーテルを戻します。ここで、観察期間の終わりに右心室圧の代表的な圧力曲線および定量的な分析が示されている。低酸素症とSU5416治療後の再モデリングされた肺動脈の組織学的分析は、ノルモキシ動物と比較して内側壁の厚さの増加を明らかにする。心筋細胞肥大を評価する小麦胚芽凝集剤染色は、低酸素とSU5416曝露が心筋細胞サイズおよび右心室肥大の著しい増加をもたらすことを示す。また、フルトン指数の測定による右心室肥大の形態評価は、低酸素動物における右心室肥大の増加を確認する。これは研究の結果に悪影響を及ぼす可能性があるため、出血を避けるために機能測定を行うことが重要です。このプロトコルは、わずかな変更を伴うラットの肺高血圧症を誘発するためにも使用することができる。特に、ラットにおける唯一のSugen注射は、肺高血圧を誘発するのに十分である。

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