Name: 原子間力顕微鏡による細胞外小胞のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡による細胞外小胞のラベルフリーイメージング手法。電気的固定化と形状補正解析により、高分解能なサイズ測定と生体物理学的特性評価を実現します。

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著者らは、国立科学財団(賞番号IGERT-0903715)、ユタ大学(化学工学種子助成学科および大学院研究フェローシップ賞)、スコルコヴォ科学研究所からの財政的支援を認めています。と技術(スコルテックフェローシップ)。

1. 生体流体からのEVの分離
<ol><li>差動超遠心分離8、降水量、またはサイズ排除クロマトグラフィー9などの確立された方法のいずれかによってEVを分離する。</li>
	<li>期待される表面および発光バイオマーカーの存在および製剤のクロスコンタミネーションを示すバイオマーカーの欠如を確認する。電子顕微鏡で単離粒子の脂質二層形態を確認する。 注:エキソソームを分離する場合、ナノ粒子追跡解析(NTA)または動的光散乱によって測定される流体力学的なサイズ分布は、期待される範囲内にあるべきである。EVとエキソソームの分離の詳細は、このプロトコルの範囲を超えています。選択された方法は、実験的な質問と研究10の目標に依存します。次のステップは、市販の沈殿キット(材料の表)を用いてMCF-7乳癌細胞の増殖培地からの沈殿によってエキソソームを濃縮する手順の具体的な図を示す。</li>
	<li>細胞培養拡大の前に、MCF-7乳癌細胞を液体窒素中に貯蔵する。細胞をサブ培養に解凍する。</li>
	<li>無菌の慣行に従って、150のmm版の細胞めっきを行う。イーグルの最小必須培地、0.01 mg/mLヒト組換えインスリン、および10%のエキソソームフリーの胎児ウシ血清で構成される成長培地を使用する。</li>
	<li>培養を95%の空気と5%のCO2で通気し、37°Cでインキュベートします。 </li>
	<li>細胞が落ち着いた後(めっき後約24時間)、培体を変更する。1:10比でプレートを分割し、培養10枚、それぞれ20mLの培地を含む。</li>
	<li>細胞がまだ増殖期にある場合、これらのプレートの9(180 mL)から〜70−80%の合流で培養およびプール媒体を収穫する。</li>
	<li>メディアを 60 mL と 120 mL に分割し、さらに 30 mL/チューブに分割し、遠心分離機を 3,000 x gで 15 分間使用します。</li>
	<li>各管から新しい無菌50 mLチューブに上清を移し、エキソソーム分離を行います。</li>
	<li>公開されたプロトコルに従って沈殿によってエキソソームを分離するか(例えば、参照11を参照)、または市販の絶縁キット(材料の表)を使用する場合は、製造元の指示に従ってください。後者の場合の最初のステップとして、遠心分離機細胞培地を3,000 x gで15分間引き出し、細胞や細胞の破片を廃棄する。</li>
	<li>沈殿液(1:5容積比)を上清に加え、混合し、一晩冷蔵する。</li>
	<li>室温で30分間1,500 x gで遠心分離機。遠心分離後に上清を捨てます。</li>
	<li>残りのエキソソームペレットを1,500 x gでさらに5分間回転させます。ペレットを乱すことなく、吸引によって残りの沈殿液を除去する。</li>
	<li>1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)バッファーの100 -500 μLでペレットを再ステーペンし、ダウンストリーム分析に必要に応じて複数のアリコートに分割します。</li>
	<li>直ちにAFMイメージング用の単離エキソソームの表面固定化に進む。必要に応じて、凍結解凍サイクル中にサンプルの損傷を避けるために予防措置を講じながら、後で使用するために-80°Cでアリコートを凍結してください。</li>
</ol>2. 細胞外小胞の表面固定
<ol><li>強力な両面テープ、エポキシ、または代替接着剤を使用して、マイカディスクをAFM/走査トンネリング顕微鏡(STM)磁気ステンレススチール製試料ディスクにしっかりと取り付けます。</li>
	<li>鋭いかみそりやユーティリティナイフを使用して、または上面に粘着テープを取り付け、それを孔質にして材料の層を取り除くことによって、マイカディスクをクリーブします。 注:いずれの方法も、以前に環境にさらされたマイカの薄い層を取り除くことによって、処女表面を明らかにする必要があります。手順の後、AFM/STM金属試料ディスクへのマイカの取り付けは堅固なままでなければなりません。</li>
	<li>室温で、10mM NiCl2溶液の100 μLでマイカの上面を10sで処理し、表面電荷を負から正に変更します。</li>
	<li>糸くずのない拭き取りまたはブロッティングペーパーを備えたブロットNiCl2溶液。マイカ表面を脱イオン(DI)水で3倍洗い、乾燥窒素の流れで乾燥させます。 注: AFM で修正したサーフェスをスキャンして、汚染物質が含まれであることを確認することをお知めします。</li>
	<li>AFM試料ディスクに、付属の表面改変マイカをペトリ皿に入れます。</li>
	<li>1x PBSでステップ1.14からエキソソームサンプルを希釈し、溶液のmL当たり4.0 x 10x 10 10の粒子の間の濃度を得る。NTAを用いて希釈粒子濃度を検証する。</li>
	<li>ピペットから希釈されたエキソソーム溶液の100 μLを空にしてマイカの表面にセッシルドロップを形成する。</li>
	<li>ペトリ皿に蓋をしてパラフィンフィルムで密封し、サンプルの蒸発を減らします。4°Cで12-18hのサンプルをインキュベートします。 注:固定化されたエキソソームの表面密度は、インキュベーション時間と液体中のEVの濃度に伴って増加します。エキソソームが低濃度でサンプル中に存在する場合は、より長いインキュベーション時間が必要な場合があります。</li>
	<li>インキュベーション後、表面を乱すことなく試料の80−90%を吸引する。この時点で、エキソソームはマイカ基板上で静電固定化される。</li>
	<li>水和したEVをイメージングする前に、1x PBSで表面をすすいで下さい。3倍を繰り返します。試すプロセス全体を通してサンプルを水和するように注意してください。</li>
	<li>マイカ表面を1x PBSで洗浄した後、液体の80%~90%を除去し、新鮮な1x PBSのピペット〜40 μLを取り除き、サンプルをカバーします。</li>
	<li>乾燥したEVをイメージングする場合は、基板をDI水ですすいでください。3倍を繰り返します。 注:DI水でリンスすると、塩結晶の形成や、基板が乾燥するにつれて表面に溶剤が堆積するのを防ぐことができます。</li>
	<li>乾燥したEVをイメージングする前に、表面に触れることなくできるだけ多くの液体を吸引し、残りを乾燥窒素の流れで乾燥させます。</li>
</ol>3. AFMイメージング
<ol><li>乾燥したEVをイメージするには、タッピングおよび非接触イメージングモードで空気中でスキャンするように設計された片持ち直しを選択し、プローブホルダーに取り付けます。 注:材料の表に記載されている例の片持ち味の特性(長さ123μm、幅40μm、先端半径7nm、および37 N/mばね定数)は、利用可能なAFM計測器と互換性のあるプローブを選択する際にガイドとして使用することができます。<ol>
<li>ステップ 2.13 から AFM ステージに準備を配置します。磁気ステンレス鋼の標本ディスクは段階のサンプルを固定する。準備と段階が熱的に平衡化するための時間を確保します。</li>
		<li>タップモードを使用して、マイカの表面の十分に大きな領域をスキャンします。たとえば、5 x 5 μm の面積を選択し、512 行で 512 行のスキャンレートでラスター化し、高さと位相の両方の画像を取得して、サンプルの地形と表面特性に関する補完的な情報を提供します。 注: イメージ領域とイメージを形成するために選択した行数に伴ってスキャン時間が増加しますが、スキャンレートが 1 秒あたりにスキャンされた行数として定義されると減少します。高速スキャン速度は、画質に影響を与える可能性があります。したがって、ラスター化の速度は、取得時間と画質のトレードオフのバランスをとる必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>水和小胞を画像化するには、柔らかい水和サンプルのスキャンに適した片持ち直しを選択し、液体中のスキャン用に設計されたプローブホルダーに片持ち式を取り付けます。 注:利用可能なAFM計測器と互換性のあるプローブを選択する場合、材料の表に記載されているプローブの仕様(公称長さ175μm、幅22μm、先端半径20nm、0.07 N/mばね定数、および4~8kHzの範囲の駆動周波数でのイメージング用に最適化された)をガイドとして使用できます。<ol>
<li>1x PBSで片持ちの先端を濡らし、スキャン中に液体に気泡を導入する可能性を減らします。</li>
		<li>ステップ 2.11 から AFM ステージに準備を配置します。磁気ステンレス鋼の標本ディスクは、その表面に固定化されたEVを含む付属のマイカを固定します。</li>
		<li>調製とAFMステージが熱的に平衡化する時間を確保します。</li>
		<li>タッピングモードで水和マイカサーフェスをイメージします。高さと位相の両方の画像を取得します。 注:イメージング品質は、計測、選択されたプローブ、およびスキャンパラメータの影響を受けます。スキャン条件を最適化する場合、開始点として使用できます: 5 x 5 μm 領域を 512 行でスキャンし、~0.8~ 1.0 Hz のスキャン レートと 4 ~ 8 kHz のドライブ周波数を選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 画像解析
注: 取得した高さ画像には、次のデータ処理および解析手順が適用されます。同様の手順は、位相データを分析するために適応されてもよい。以下の説明は、GNU一般公衆ライセンスの下で利用可能な無料でオープンソースのソフトウェアであるGwyddion12に固有です。同様の機能は、代替ソフトウェア ツールで使用できます。
<ol><li>データプロセス、SPMモード、ヒントに移動し、モデルヒントを選択します(図2)。サンプルのスキャンに使用する先端のジオメトリと寸法を選択し、[OK]をクリックします。</li>
	<li>表面の再構成を実行して、先端の浸食アーティファクトを修正します。画像を開きます。メニューから、[データプロセス]、[SPMモード]、[ヒント]を選択し、[サーフェスの再構成]を選択し、[OK] をクリックします (図3)。 </li>
	<li>スキャン データから基板の傾きを取り除いて、実験室の XY 平面に一致するようにイメージング プレーンを配置します。このタスクを実行するには、[データ プロセス] 、[レベル]を選択し、[平面レベル]を選択します (図 4)。</li>
	<li>[データ プロセス]を選択してイメージの行を位置合わせし、[データを修正]を選択し、[行の位置を整列]を選択します。いくつかの配置オプションを使用できます (図 5)。たとえば、中央値は、各スキャン ラインの平均高さを検出し、データから減算するアルゴリズムです。</li>
	<li>[データ プロセス]に移動し、[データを修正]に移動し、[傷跡の削除] (図 6)を選択します。</li>
	<li>データプロセスからアクセス可能なレベルドロップダウンメニューで[ベースを平坦化]を選択して、マイカサーフェスをゼロの高さZ = 0に位置合わせします(図7)。</li>
	<li>グレインドロップダウンメニュー(図8A)で[しきい値でマーク]を使用して、スキャンしたサーフェス上のEVを識別します。このアルゴリズムは、表面固定エキソソームを、ユーザが選択した閾値を超える高さによってゼロサーフェス基板から突き出た粒子として識別します。1 ~ 3 nm の範囲のしきい値を選択すると、バックグラウンド干渉のほとんどが除去されます。より小さいしきい値は、よりクリーンな背景で使用されます。 注: 図8Aのしきい値は 1.767 nm です。この閾値化を伴うMCF-7エキソソーム同定の結果を図8Bに示す。Gwyddionは、自動しきい値(大津の方法)、エッジ検出、流域アルゴリズムなど、画像内の小胞を自動的に識別するアルゴリズムとして、しきい値に代わるいくつかの選択肢を提供します。 注:粒子凝集体は、AFM画像に存在する場合、マスクされ、解析から除外され得る。</li>
	<li>グレインズメニューからアクセス可能な分布アルゴリズムを使用して、識別されたEVの幾何学的および寸法的な特性解析を実行します。 注:Gwyddionは、水和または乾燥状態で固定化されたEVのスカラー値、アール、体積、およびその他の特性の分布を評価するためのツールを提供します。スカラー値プロパティの例を図 9に示し、識別された各エキソソームのフットプリント内の最大高さの分布を示します。</li>
	<li>他の計算ツールやカスタムコンピュータプログラムによる特殊な分析のためにGwyddionからAFMデータをエクスポートします。</li>
</ol>

<ol><li>Chernyshev, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+shape+characterization+of+hydrated+and+desiccated+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).</li>
<li>Ramirez, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+challenges+of+working+with+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Technical challenges of working with extracellular vesicles.</a> Nanoscale. 10, 881-906 (2018).</li>
<li>Skliar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins+significantly+restrict+exosome+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins significantly restrict exosome mobility.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).</li>
<li>Parisse, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+analysis+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles.</a> European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).</li>
<li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Cell+Prediction+of+Exosomes+Using+Morphological+Features+on+Solid+Surfaces+Analyzed+by+Machine+Learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning.</a> Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).</li>
<li>Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascent+of+atomic+force+microscopy+as+a+nanoanalytical+tool+for+exosomes+and+other+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles.</a> Nanotechnology. 29, 132001(2018).</li>
<li>Meyer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilisation+of+living+bacteria+for+AFM+imaging+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions.</a> Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).</li>
<li>Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).</li>
<li>Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+isolation+for+proteomic+analyses+and+RNA+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750(2019).</li>
<li>Weng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+isolation+of+exosomes+with+polyethylene+glycol+from+cell+culture+supernatant+for+in-depth+proteome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling.</a> The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).</li>
<li>Nečas, D., Klapetek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gwyddion%3A+an+open-source+software+for+SPM+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Physics%22%5BJournal%5D)">Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis.</a> Open Physics. 10, 181-188 (2012).</li>
<li>Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+nanoscopic+surface+measurements+of+nickel-modified+Mica+for+single-molecule+DNA+sequence+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).</li>
<li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+released+by+human+umbilical+cord+mesenchymal+stem+cells+protect+against+cisplatin-induced+renal+oxidative+stress+and+apoptosis+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4, 34(2013).</li>
<li>Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-infected+cells+regulate+the+release+of+exosomes+with+distinct+ultrastructural+features%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features.</a> FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).</li>
<li>Briegel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+architecture+of+bacterial+chemoreceptor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).</li>
<li>Akagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Chip+Immunoelectrophoresis+of+Extracellular+Vesicles+Released+from+Human+Breast+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells.</a> PLOS ONE. 10, e0123603(2015).</li>
<li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural-mechanical+characterization+of+nanoparticle+exosomes+in+human+saliva%2C+using+correlative+AFM%2C+FESEM%2C+and+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy.</a> ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).</li>
<li>Radeghieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+amniocytes+express+hTERT%2C+which+is+distributed+between+nucleus+and+cytoplasm+and+is+secreted+in+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).</li>
<li>Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Isolation+Methods+on+a+Nanoscale+Surface+Structure+and+Its+Effect+on+the+Size+of+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Circulating+Biomarkers%22%5BJournal%5D)">The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes.</a> Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11(2016).</li>
<li>Deegan, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+flow+as+the+cause+of+ring+stains+from+dried+liquid+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops.</a> Nature. 389, 827-829 (1997).</li>
<li>Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+Charged+Latex+Particles+on+Mica+Studied+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).</li>
<li>Pastré, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+DNA+to+Mica+Mediated+by+Divalent+Counterions%3A+A+Theoretical+and+Experimental+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study.</a> Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).</li>
<li>van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification%2C+functions%2C+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

生体液からのEVの固定化、表面スキャン、画像解析は、液体中のEVのAFM特性解析のために開発されたプロトコルの重要なステップです。AFMイメージングに適した小胞の数は、画像化された表面積および基板上に固定化された小胞の表面濃度と共にスケールする。EVやエキソソーム18の負のゼータ電位を考えると、液体サンプルからAFM基板へのEVの静電固定を提唱する。固定化は、表面が正に充電されたときに有効です。EV固定化の前に、正の表面電荷は、マイカの場合のように基板に付与する必要があり、マイカの場合と同様に、一般的な式KAl 2(AlSi3O10)(OH)2を含む層状ケイ酸塩鉱物である。新たにcleavecmicaの表面は完全に平坦に近く、AFMによるナノ粒子のイメージングに最適ですが、表面電荷は負であり、したがって、修正する必要があります。このプロトコルは、AFM基板に正の表面変化を与える手順について説明する。代表的な結果は、生体流体から修飾マイカ基板へのEV固定の顕著な改善を示した。 
  水和小胞を...

細胞外小胞(EV)は、血液、尿、唾液、牛乳、羊水を含むすべての体液に存在する。エキソソームは、エンドソーム生体形成、エンドソーム経路のマーカー、およびすべてのEVの中で最小サイズによって他のEVと区別されるEVの地区クラスを形成します。エキソソームの大きさは、多くの場合、研究間の実質的な変動で報告されます。サイジング結果は、EVサイズ1、2を推定する異なる分析技術によって採用される物理原理の違いを反映して、方法依存性であることが判明した。例えば、最も広く使用されているサイズ特性解析技術であるナノ粒子トラッキング解析(NTA)は、EVのサイズを流体力学的直径として推定し、溶液中のEVのブラウンモビリティに対する耐性を特徴付けます。小胞のより大きい流体力学の直径は液体の低い移動性を意味する。小胞の周りの冠状層は、表面タンパク質および膜表面に固定または吸着された他の分子からなる、実質的に移動性を阻害し、EVの流体力学的サイズを増加させる。相対的に見て、この増加は、図1に示すように、エキソソーム3に対して特に大きい。
低温透過電子顕微鏡(cryo-TEM)イメージングは、小胞の大きさと形態を水和状態で特徴付ける決定的な技術です。しかし、計測器のコストが高く、それを正しく使用するために必要な専門知識は、水和されたEVを画像化できる代替技術の探求を動機づけます。取得したクライオ-TEM画像で観測または特徴付けられた比較的少数のEVは、この技術のもう一つの顕著な欠点です。
原子力顕微鏡(AFM)は、水和または乾燥したEV4、5、6の3次元地形を可視化し、基板全体のプローブをスキャンして表面上の粒子の画像をラスター化する。本研究では、AFMによってEVを特徴付けるプロトコルの本質的なステップについて概説する。小胞を液体中で撮像する前に、機能性表面へのテザリング、フィルタ内の捕捉、または静電引き付け7によって基板上に固定化されなければならない。正に帯電した基板上の静電固定は、負のゼータ電位を有することが知られているエキソソームの固定化のための特に便利なオプションである。しかし、表面上の細胞外小胞を固定するのと同じ静電力もその形状を歪め、ポストイメージングデータ解析が不可欠です。この点を詳しく説明するには、表面に固定化されたエキソソームの歪んだ形状に関するAFMデータに基づいて、溶液中の球状小胞の大きさを推定するアルゴリズムを説明する。
開発されたプロトコルでは、小胞の堅牢な静電固定化の手順が提示され、水和または乾燥状態で原子力イメージングを実行するために必要な手順が続きます。固定化された小胞の表面濃度に影響を与える因子が同定される。このガイダンスは、溶液中のEV濃度が異なるサンプルに対して静電固定を実行する方法について説明します。十分に多数の固定化小胞に基づく異なる生物物理特性の経験的確率分布の推定を可能にする実験条件の選択が議論される。AFMデータのポストイメージング分析の例が示される。具体的には、固定化されたEVのAFM特性に基づいて溶液中の小胞の大きさを決定するためのアルゴリズムが記載されている。代表的な結果は、凍結TEMイメージングの結果とAFMによる小胞サイジングの一貫性を示す。

<table><tbody><tr><td>AFM/STMコントローラー&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>Multimode Nanoscope V</td><td>このAFMコントローラーは、液体および空気中の生体サンプルのイメージングをサポートします。</td></tr><tr><td>AFM/STM金属試料ディスク(10mm)</td><td>TedPella</td><td>16207</td><td>マイカディスクを両面テープなどで取り付けた金属試料ディスクです。</td></tr><tr><td>AFM/STMマイカディスク(10mm)</td><td>TedPella</td><td>50</td><td>最高級グレードV1マイカ、厚さ0.21mm(0.0085インチ)。インターリーブ、10個入りパッケージ。AFM/STMディスクへの搭載が可能。</td></tr><tr><td>空気中でのイメージング用の</td>4つの直径のAFMプローブで利用可能 <td>Bruker</td><td>TESP-V2</td><td>タッピングモードと空中スキャン用の非接触モード用の高品質エッチングシリコンプローブ。</td></tr><tr><td>液体中のソフトサンプルイメージング用AFMプローブ</td><td>Bruker</td><td>MLCT</td><td>窒化ケイ素チップ付きソフト窒化ケイ素カンチレバーで、液体操作に適しています。&nbsp;力定数の範囲により、ユーザーは接触モードで非常に柔らかいサンプルをイメージングできるだけでなく、高負荷対距離分光法でもイメージングできます。</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>Spectrum</td><td>360-77705</td><td>マイカディスクを金属試料ディスクに固定するために使用されます。</td></tr><tr><td>ExoQuick-TC</td><td>System Biosciences</td><td>EXOTC50A-1</td><td>ExoQuick-TCは、組織培養培地からのエキソソーム単離用に設計された独自のポリマーベースのキットです。</td></tr><tr><td>液体ブルカーでのイメージング用ガラスプローブAFMホルダー</td><td></td><td>&nbsp;MTFML-V2</td><td>このガラスプローブホルダーは、マルチモードAFMで流体中をスキャンできるように設計されています。このホルダは、ピークフォースタッピングモード、コンタクトモード、タッピングモード、フォースモジュレーションで使用できます。プローブは、より大きな振幅変調のために、独立したピエゾ発振器によって音響的に駆動されます。&nbsp;ホルダーには、2つのポート、必要なフィッティング、および液体を追加および除去するためのアクセサリキットが付属しています。</td></tr><tr><td>グウィディオン</td><td>チェコ計測研究所。</td><td>バージョン2.52</td>走<td>査型プローブ顕微鏡技術によって得られたデータフィールドの視覚化と分析のためのオープンソースソフトウェア。</td></tr><tr><td>糸くずの出ないあぶらとり紙</td><td>GEヘルスケア ワットマン&nbsp;</td><td>グレードGB003あぶらとり紙</td><td>このあぶらとり紙を使用して、マイカの基板の改質後にNiCl2を除去します。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>糸くずの出ないクリーンルーム用ワイプ</td><td>Texwipe</td><td>AlphaWipe TX1004</td><td>表面の清掃には、これらのポリエステル製ワイプを使用してください。&nbsp;</td></tr><tr><td>塩化ニッケル (II) (NiCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td> DI 水リン酸緩衝生理食塩水<td>中で 10 mM NiCl2 を製造するために使用される粉末</td></tr><tr><td>(1x)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>PBS、pH 7.4</td></tr></tbody></table>

原子間力顕微鏡による細胞外小胞のイメージング

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

エキソソームおよび他の細胞外小胞(EV)は、脂質膜小胞、膜タンパク質および他の分子による表面装飾、およびRNAを含む親細胞から受け継がれた多様な発光含有量からなる分子複合体であり、タンパク質、および DN。小胞の大きさや表面装飾によって形成される冠状層に依存するEVの流体力学的サイズの特性化は、日常化している。EVの最小であるエキソソームの場合、流体力学と小胞のサイズの相対的な差は重要です。低温透過電子顕微鏡(cryo-TEM)イメージングによる小胞サイズの特性解析は、金の標準的な技術であり、機器のコスト、サンプル調製、イメージングおよびおよびデータ分析、および画像で観察される粒子の数が少ない。広く利用可能でアクセス可能な代替手段は、原子力顕微鏡(AFM)であり、3次元幾何学、サイズ、および細胞外小胞の他の生物物理学的特性に関する多目的なデータを生成することができる。開発されたプロトコルは、この分析ツールを利用するユーザーを導き、水和または乾燥した形でEVをイメージングするためのサンプル準備を含むAFMによるEVの分析のためのワークフローを概説し、静電固定基板上の小胞、データ取得、分析、および解釈。代表的な結果は、変更されたマイカ表面上のEVの固定が予測可能でカスタマイズ可能であり、ユーザーが多数の小胞のサイジング結果を得ることを可能にすることを示しています。AFMデータに基づく小胞サイジングは、クライオ-TEMイメージングと一致することがわかった。

EVの表面固定は、イメージングシーケンスの重要なステップです。負のゼータ電位を有することが知られているエキソソームの静電表面固定化は、マイカの基板が正の表面電荷を有するように修飾された後に強く起こるであろう。NiCl2による処理を行わずに表面変化を良好に付与すると、基板上のEVの固定化は効果がないことが判明した。図10Aの高さ画像は、PBSのmL当たり2.59x1010小胞を含むMCF-7エキソソームサンプルの後に空気中で取得し、新たに切り分けたマイカの未改変表面上で12時間インキュベートし、上に残存する非常に少ない小胞を示すDI水で洗浄した後の表面。図10Aに見える小胞は、最も可能性の高い、DI水の不完全な吸引の結果であり、表面に固定されていない小胞を再懸濁し、蒸発するにつれて基板上に沈化させた。
塩化ニッケルで表面電荷を修正した後、処理後に表面に汚染物質が含まれであることを確認することをお勧めします...

液体試料からのエキソソームおよび細胞外小胞の標識フリー固定化および原子間力顕微鏡(AFM)によるイメージングに関するステップバイステップの手順について説明する。AFM画像は、溶液中の小胞のサイズを推定し、他の生物物理学的特性を特徴付けるために使用されます。

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

このプロトコルは、水和および乾燥した形態における細胞外小胞のAFMイメージング、静電固定化、表面スキャン、ベシカル同定、およびデータ分析および解釈のための簡単な準備を概説する。この技術の主な利点は、皮膚表面上の小胞の便利な静電気固定と、固定化によって生じる形状の歪みを考慮したポストイメージング解析です。得られた小胞のサイジング結果は、コストがかかり、挑戦的な技術のままゴールドスタンダードCryoTEMイメージングと一致しています。AFM の新規ユーザーの場合は、まず乾燥サンプルの特性評価から始めてから、水和サンプルに進みます。水和サンプルの取得に影響を与える可能性のある追加の要因が数多く存在するため。まず、付随するテキストプロトコルに記載されているように、生体液から細胞外小胞を分離する。次に、磁気ステンレス製の試料ディスクにマイカディスクをしっかりと取り付けます。材料の新しい層を公開するために鋭いカミソリを使用してマイカディスクを切断します。室温では、10ミリモルニッケルII塩化溶液の100マイクロリットルで10秒間、マイカの上面を処理します。これにより、サーフェスの電荷が負から正に変化します。リントフリーワイプまたはブロッティングペーパーでニッケルII塩化液をブロットします。その後、水を脱イオン水でマイカ表面を3回洗い、乾燥窒素の流れで乾燥させます。アタッチされた表面修正マイカとAFM標本ディスクをシャーレに入れます。次に、エキソソームをPBSで希釈し、溶液1ミリリットル当たり40億粒子から400億粒子の濃度を得る。ナノ粒子追跡解析を用いて、希釈粒子濃度を検証します。ピペットから希釈したエキソソーム溶液の100マイクロリットルを空にすることによって、マイカの表面にセスシルドロップを形成します。その後、シャーレに蓋を置き、パラフェンフィルムで密封してサンプルの蒸発を減らします。冷蔵庫で12時間インキュベートします。インキュベーション後、試料の80〜90%を表面を乱すことなく慎重に吸引する。この時点で、エキソソームは、マイカ基板上に静電固定化される。水和サンプルをイメージングする場合は、PBSで表面を3回リンスします。リンスプロセス全体を通してサンプルを水分補給してください。PBSでマイカ表面を洗浄した後、液体の80〜90パーセントを取り除き、サンプルをカバーするために新鮮なPBSのピペット40マイクロリットルを除去する。水和サンプルは、イメージングの準備ができています。脱熱したEVを撮像する際、脱イオン水で基板を3回リンスして表面から塩を取り除きます。できるだけ多くの液体を吸引した後、表面に触れることなく、残りを乾燥窒素の流れで乾燥させる。乾燥した細胞外小胞を画像化するには、タップおよび非接触イメージングモードで空気中をスキャンするように設計された片持ち体を選択し、プローブホルダーに取り付けます。サンプルを AFM ステージに配置します。磁気ステンレス鋼の標本ディスクはステージ上のサンプルを固定する。プローブホルダーをAFMに入れる。準備とステージが熱的に平衡化する時間を待ちます。タップモードを使用して、512 本のラインでラスター化された 5x5 ミクロンのエリアを、1 つのヘルツのスキャンレートでスキャンします。高さと位相の両方の画像を取得し、サンプルの地形と表面特性に関する無料の情報を提供します。スキャン時間は、画像領域と画像を形成するために選択されたラインの数によって増加しますが、スキャン速度に応じて減少します。高速スキャン速度はイメージ品質に影響を与える可能性があるため、ラスタリングの速度は取得時間と画質のバランスをとる必要があります。水和小胞を画像化するには、柔らかい水和サンプルをスキャンするのに適した片持ち面を選択し、液体中のスキャン用に設計されたプローブホルダーに片持ち体を取り付けます。PBSで片持ちレバーの先端を濡らし、スキャン中に液体に気泡を導入する可能性を減らします。次に、サンプルをAFMステージに固定化します。サンプルが熱的に平衡したら、水和したマイカ表面をタッピングモードで画像化します。高さと位相の両方の画像を取得します。撮影した画像を分析するには、まずデータプロセスの選択 SPM モードに移動し、次に「ヒント」を選択し、サンプルのスキャンに使用するジオメトリとチップの寸法を選択し、OK をクリックして、サーフェスの再構築を実行してチップの腐食アーティファクトを修正します。画像を開きます。メニューから[データ処理]を選択し、[SPMモード]を選択してから[チップ]を選択し、[OK]を選択して[次へ]をクリックし、[データプロセス]を選択して[レベル]を選択し、[平面レベル]を選択して、イメージング平面を整列させ、スキャンデータから基板の傾きを取り除いて実験室のXY平面に一致させます。[データプロセス]の[次に正しいデータ]を選択して画像内の行を整列し、[行を整列]を選択し、各スキャンラインの平均高さを検出してデータから減算するアルゴリズムである中央値を含む複数の整列オプションを使用できます。次に、データプロセスの後に[修正データ]に移動し、[傷跡を取り除く]を選択し、これは「スカーズ」と呼ばれる一般的なスキャンエラーを削除し、マイカサーフェスをゼロの高さに揃えるには、[データプロセス]メニューに移動し、[レベル]ドロップダウンメニューで[ベースを平坦化]を選択します。「グレインズ」メニューに移動し、「閾値によるマーク」を使用して、スキャンした表面上の余分な細胞小胞を特定する'このアルゴリズムは、ユーザーが選択した閾値を超える高さによってゼロ表面基板から突き出た粒子として表面固定化エキソソームを識別します。1 ナノメートルから 3 ナノメートルまでの範囲でしきい値を選択します。これにより、バック グラウンド干渉の大部分が排除されます。最後に、Grainsメニューからアクセス可能な分布アルゴリズムを使用して、同定された小胞の幾何学的および次元的特性を実行します。他の計算ツールやカスタムコンピュータプログラムによる特殊な分析のためにGwyddionからAFMデータをエクスポートします。塩化ニッケル表面改質は時間依存性の細胞外小胞の固定化をもたらす。固定化された小胞の表面濃度は、24時間のインキュベーション後に過度に密度が高く、12時間のインキュベーションは正確に分析しやすいエキソソームおよびスキャンデータを少なくする。このAFM画像は、改変マイカ表面に静電に固定化された水分補給MCF7エキソソームを示す。対応するAFM位相画像は、高さ画像の粒子が膜小胞に期待されるように軟ナノ粒子であることを確認します。同じ線に沿った 3 つの小胞の高さデータを次に示します。これらのプロファイルは、変性マイカの正電荷面へのエキソソームの静電引力によって引き起こされる平坦化形状を示す。形状の歪みは、固定化された小胞とその断面の拡大図で明らかである。溶液中のエキソソームの球状サイズを推定するために、上で固定化された表面および球状膜エンベロープによって囲まれた体積を一致させることができる。溶液中の球状小胞のサイズ分布は、561固定化小胞のAFMデータから決定した。クライオテム画像の小胞サイズは、AFMの結果と一致しています。ヒュルド化されたエキソソームをイメージングする前に、PBSで表面を十分に洗いすがることが重要です。これにより、インバウンドエキソソームが削除され、AFM チップへの添付ができなくなります。乾燥エキソソームを撮像する際には、必ず基板を上昇させるためにDI水を使用してください。DI洗浄は、基材が乾燥するにつれて表面に塩結晶が形成されるのを防ぎます。もし存在すれば、塩結晶は画像処理を困難な作業にする。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

出典: Biller, SJ, et al.シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性化J. Vis.

透過型電子顕微鏡を用いたシアノバクテリア細胞外小胞の可視化

このビデオでは、細胞外小胞またはEVの細胞内取り込みを視覚化し定量化するアッセイを実演します。このアッセイは、共焦点顕微鏡を用いた3D蛍光イメージングを利用し、細胞表面に付着したEVと内在するEVを区別することができます。...

細胞外小胞取り込みアッセイ:3D蛍光イメージング技術を使用して細胞外小胞の細胞取り込みを可視化および定量化する方法

このビデオは、蛍光標識捕捉抗体-磁性ナノ粒子コンジュゲートを使用した細胞外小胞の免疫捕捉を示しています。このプロセスには、複雑な形成、蛍光標識検出抗体による染色、磁気分離、抗原特性評価のためのフローサイトメトリー分析が含まれます。...

抗体特性評価のための細胞外小胞の免疫捕捉およびフローサイトメトリー(英語)

出典: Lunelli, L., et.al. 原子間力顕微鏡で脳ポリソームを覗き込む. J. Vis.

原子間力顕微鏡を用いたマウス脳から単離されたポリソームのイメージング

このプロトコルでは、否定的な汚損、詳細な構造と免疫金エクソソームの特定の蛋白質の位置を判断するための極薄断面透過型電子顕微鏡に必要な様々...

サンプル準備および透過電子顕微鏡によるエクソソームのイメージ投射

細胞外小胞(EV)は細胞生物学と細胞間コミュニケーションに貢献します。細胞の取り込みEVを可視化・定量化するための実用的なアッセイが必要です。現在のプロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスによるEV単離に続く共焦点顕微鏡 による 3次元蛍光イメージングを利用してEV取り込みアッセイを提案している。...

共焦点顕微鏡イメージング解析による細胞外小胞取り込みアッセイ

直接確率的光学再構成顕微鏡(dSTORM)は、光顕微鏡の典型的な回折限界をバイパスし、ナノメートルスケールでエキソソームを見るために使用されます。エキソソームを特徴付けるために2次元と3次元の両方で採用することができます。...

細胞外小胞の直接確率的光学再構成顕微鏡

我々は、癌性尿路上皮細胞に由来する細胞外小胞(EV)の単離および凍結破砕のためのプロトコルを提示する。凍結破壊技術は、EVの直径と形状、そしてユニークな特徴としてEV膜の内部組織を明らかにしました。これらは、EVがレシピエント膜とどのように相互作用するかを理解する上で非常に重要です。...

細胞外小胞分析のための凍結破壊電子顕微鏡

最新世代のEV特性評価ツールは、複数のパラメータにわたる単一のEV解析を同時に行うことができます。ナノフローサイトメトリーは、標識なしで45...

ナノフローサイトメトリーによる単一細胞外小胞膜貫通タンパク質の特性評価

この論文は、細胞外小胞サブセットの特性評価のためのスループットを向上させた新世代のマルチパラメトリック分析プラットフォームを提案します。この方法は、多重化されたバイオセンシング法と、原子間力顕微鏡による計量学的および形態力学的分析とラマン分光法の組み合わせに基づいており、マイクロアレイバイオチップにトラップされた小胞ターゲットを認定します。...

細胞外小胞サブセット解析のための多重化表面プラズモン共鳴イメージングチップ上のマルチモーダル解析プラットフォーム

学ぶ原子間力顕微鏡による細胞外小胞のラベルフリーイメージング手法。電気的固定化と形状補正解析により、高分解能なサイズ測定と生体物理学的特性評価を実現します。

原子間力顕微鏡による細胞外小胞のイメージング

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