Name: 優れた眼溝の動脈分布胚発生中に可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚における優れた眼溝（SOS）の可視化プロトコル。発生生物学と神経科学の研究に活用でき、脊椎動物の眼形成メカニズム解明に貢献します。

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この作品は、カナダ研究所の健康研究 (機構)、自然科学と工学研究会 (レベル)、アルバータ州の革新技術先物と女性と子供の健康研究所 (WCHRI) によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは、アルバータ州動物ケアおよび使用委員会の大学によって承認されています。
1 実体と差動干渉の対照 (DIC) のイメージングを使用して SOS のプロトコル 1: 可視化
<ol><li>胚のコレクション<ol>
<li>脱塩素水のタンクに、女性ゼブラフィッシュと男性ゼブラフィッシュを組み合わせることで夕方には+/- gdf6aゼブラフィッシュの十字架を準備します。必ず時間の小さな範囲内で胚が誕生していることを確認する分周器を使用して、女性から男性を分離してください。</li>
		<li>次の朝、区分線を引っ張ると 30 分収集ゼブラフィッシュ予約12に記載されている E3 メディアでペトリ皿で胚よりももはやのために繁殖するゼブラフィッシュを許可し、28.5 ° C の定温器に入れます。</li>
		<li>未受精卵や死んだの胚は、白と不透明に表示される削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>準備とゼブラフィッシュ胚のライブ イメージング<ol>
<li>20 で hpf、E3 メディア含む 0.004 %1-フェニル-2-チオ尿素 (PTU) 色素の生産を防ぐためには、置換 E3 メディア。 注: 22-24 hpf などの少し後の timepoint に PTU の添加はイメージングの時に胚の早期の年齢のための実験を妨害する可能性があります。しかし、SOS のイメージングを妨げることができます背の眼は、色素沈着のバンドがあるので完全に色素沈着を防ぐために初期胚を治療することをお勧めします。</li>
		<li>観察時間に至るまでのさまざまなポイントで正しい発達段階ですべての胚が確実します。どの体節数はキンメルら13のとおり明らかに目に見える段階でこれはそれをお勧めします。ある発達成熟したものを削除します。</li>
		<li>注意深く引いて離れて微細鉗子を用いた絨毛膜解剖顕微鏡および dechorionate の下で胚の胚を配置します。背の眼の SOS を視覚化します。SOS が目の背側縁にインデントとして表示され、行は背の眼にまたがって表示される必要があります。通常の SOS 閉鎖のため周りで胚を観察 20 23 hpf。遅延 SOS 閉鎖表現型の検討、28 で胚を観察 hpf またはそれ以降。</li>
		<li>しないから SOS 閉鎖遅延を示す胚を並べ替えます。</li>
		<li>解剖顕微鏡を用いたこれらの胚の写真、E3 で 1% の agarose を含むシャーレを用意してください。胚は、アガロースに置かれたときに座ることができる胚の卵黄で浅い穴を作成する agarose の中心に軽く刺します。これは、時に、胚が斜めの角度で撮影されている保証されます。</li>
		<li>E3 の場所に横に agarose 0.003 %tricaine を持つ胚を麻酔します。</li>
		<li>化合物、または共焦点顕微鏡を用いた胚をイメージする 35 mm 非ゲル 1% 低融点ポイントの agarose E3 での小さな塊を含むペトリ皿に胚を転送 (w/v)。すぐに横方向に細かい釣り糸またはまつげを使用して胎児の位置、冷却する agarose を待ちます。Agarose がしっかりと、皿、アガロースをカバーするために十分な E3 を注ぐ。詳細については、ディステル ・ コスターの14を参照してください。 注: 倒立顕微鏡を使用している場合、胚ガラス coverslip 底皿のガラスに対して配置でき標準 20 × 対物レンズで結像されます。</li>
		<li>水浸漬 20 倍の対物レンズを使用して、複合顕微鏡で SOS を視覚化します。可視化、次には、優しく胚からアガロースを抜くと 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の修正か、開発を継続することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 ラミニンの全体マウント 2 のプロトコル: 蛍光抗体染色
<ol><li>全体マウント ラミニンの免疫蛍光染色: 日 1<ol>
<li>Dechorionate 胚はすでに行われていないステップ 1.2.3 で記述されています。たて 4% に必要な timepoint で微量遠心チューブに胚を修正 2 時間室温 (22-25 ° C) シェーカーの PFA。1 で洗って 5 分、4 回の x PBST。 注: 次の原腸形成において、胚が dechorionation 後より良い修正されます。</li>
		<li>5 分インキュベーション時間は胚を固定する発達段階に依存のために室温で 10 mg/mL プロティナーゼ K の胚を permeabilize (Thisse および Thisse を参照してください15)。</li>
		<li>1 で洗って 5 分、4 回の x PBST。</li>
		<li>5% ヤギ血清および 2 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) の室温シェーカーで 1-2 時間の 1xPBST の溶液中の胚をブロックします。</li>
		<li>ブロック溶液中で 1: 200 希釈ウサギ抗ラミニン抗体を希釈して一次抗体溶液を準備します。</li>
		<li>4 ° C のシェーカーで一晩一次抗体を抗ラミニンの胚孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>全体マウント ラミニンの免疫蛍光染色: 日 2<ol>
<li>1 で洗って 5 回、15 分間 x PBST。</li>
		<li>1 ヤギ抗うさぎ Alexa Fluor 488 抗体を希釈して二次抗体溶液を準備 x PBST 1: 1000 希釈します。 注: 異なる二次抗体を使用して利用可能なリソースに実験者に合わせてこの手順を適応することが可能です。</li>
		<li>4 ° C のシェーカーで一晩二次抗体に胚を孵化させなさい。この手順以降から可能な限り光から保護します。</li>
		<li>1 洗浄 4 回、15 分間 x PBST。必要に応じて、最大 1 週間、4 ° C で胚を格納できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>郭清と萌芽期目の取り付け<ol>
<li>に応じて、小さなシャーレに胚を配置、1 で胚を deyolk x PBST。優しく微細鉗子で卵黄を中断すると卵黄嚢のマイルド削りから卵黄のセルを削除するには、これを行います。</li>
		<li>マイクロ遠心チューブ用の PBS グリセロール シリーズ ・ ソリューションの次の濃度の準備: PBS で 30%、50%、70% のグリセリン。30% グリセロール/PBS ソリューションとできるだけ以前のソリューションのほとんどとして転送の上に胚を置くことを確かめるには、胚を転送します。胚はチューブの底に沈むことを待ちます。</li>
		<li>胚は、底に沈んでいるとき、50% グリセロール/PBS に転送します。繰り返し、70% グリセロール/PBS に転送します。</li>
		<li>胚は、70% グリセロール/PBS に沈んでいる、一度解剖の小さなプラスチックの皿に移動します。</li>
		<li>後脳の後方の胚を断つし、必要に応じて遺伝子型、後部組織を使用します。</li>
		<li>可能な限り少しグリセリンとして転送するスライド ガラスに頭を移動します。しがみついて頭を静止した保つために後端鉗子やその他細かい解剖ツールを使用します。そっと頭の左右半分を切り離すことを下げ、前方から前脳室に挿入し罰金 minutien ピンやその他の細かい解剖ツールを使用します。移動しながら後方中脳と菱脳の心室に本質的に正中線を頭を fileting、この手順を繰り返します。これは、目の周囲の組織、SOS は無傷のまま手動操作を最小限に抑えます。</li>
		<li>目を頭の正中線の両側をマウントします。4 コーナー (使用される coverslip の離れて適切な距離) で真空グリースの記事、サンプルに接触、coverslip まで各記事を順番に押し下げてガラス coverslip でカバーします。グリセロールは、coverslip とスライド間の空間を充填、下に引っ張られるように、カバーガラスの端の 70% のグリセロールをピペットします。</li>
		<li>日以内マニキュア マニキュア液が乾燥した後のみの画像サンプルと coverslip の周りのシール画像のサンプル。4 ° C で暗闇の中で保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. プロトコル 3: 視覚化の SOS を用いた eGFP ・ カァシュ mRNA
<ol><li>EGFP ・ カァシュ mRNA の合成<ol>
<li>37 ° C で 4 時間 pCS2 eGFP-・ カァシュ プラスミド16ノッティと 40 mL の反応量 1 mg をリニア化します。</li>
		<li>RNase フリー 10 mL の水、10 %sds の 2.5 mL、2.0 mL を追加、制限のダイジェストの反応を停止する 10 mg/mL, プロテイナーゼ K</li>
		<li>50 ° C で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>次の反応に追加 (合計量 200 mL) し、次のステップに進みます: RNase フリー 50 ml、20 mL 3 M ナトリウム酢酸 pH 5.2 と 75.5 RNase フリー mL 水 注: RNase フリーの水は、ナトリウムのアセテートの過度の希釈を防ぐために 2 つの別々 の機会に追加されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DNA のフェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿法による浄化<ol>
<li>200 mL フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコールと渦の追加 20 s. 別 5 分 18,000 × g で遠心分離を水溶液と有機相。</li>
		<li>水性上層を下層有機の転送を避けるために確認して、新しい微量遠心チューブに転送します。新しいチューブにクロロホルムの等しい量を追加します。 注: クロロホルムの付加はオプションですが、サンプルからフェノールの完全な除去を確実にお勧め。</li>
		<li>20 s. 別 5 分 18,000 × g で遠心分離を水溶液と有機相の渦。</li>
		<li>以前のように、上方の水層を底の有機層の転送を避けるために確認して、新しい微量遠心チューブに転送します。</li>
		<li>3 M ナトリウム酢酸 pH 5.2 の 1/10 ボリュームを追加します。</li>
		<li>4 ° C で 20 分 18,000 × g で 15 分遠心分離機の-20 ° C で 100 %rnase フリー エタノールと寒さの 3 つのボリュームを追加することで DNA を沈殿させるペレットは見えるはずです。上清をデカントします。</li>
		<li>70% エタノール/RNase フリー水 100 mL でペレットを洗浄します。4 ° C で 15 分間 18,000 × g で遠心分離機のペレットを緩い破ること軽く混合後ペレットは見えるはずです。上清をデカントします。</li>
		<li>5 分のペレットを風乾、水 7 mL に DNA を再懸濁します。 注: ペレット利用の気流によって 5 分以上乾燥する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>転写と eGFP ・ カァシュ mRNA の精製<ol>
<li>RNase フリーの方法の in vitro転写反応精製線形プラスミッド ステップ 3.2 で得られた DNA の約 1 mg を使用して、市販の Sp6 RNA ポリメラーゼ キットを準備します。37 ° C で 2 時間インキュベートします。 注: Sp6 RNA ポリメラーゼは、mRNA キャップの生産のため使用する必要があります。</li>
		<li>DNase の 1 mL を追加 (2 U/mL;RNase フリー) 37 ° C で 30 分間インキュベートし、</li>
		<li>あらゆる市販の RNA 精製キットと mRNA を浄化します。繰り返しの凍結融解を回避し、-80 ° C で保存する mRNA の約数</li>
	</ol>
</li>
	<li>注射と可視化<ol>
<li>プロトコル 1.1 で説明したように、胚を取得します。</li>
		<li>1 細胞期で eGFP ・ カァシュ mRNA の 300 pg を注入するマイクロインジェクション装置を使用して。</li>
		<li>明るい蛍光性の立体鏡を使用して目の eGFP 発現と胚の画面。</li>
		<li>1.2 プロトコルで説明されているように、胚をイメージします。</li>
		<li>また、dechorionate と胚の修正 4% に必要な timepoint を 4 時間室温でまたは一晩 4 ° C で PFAまだ施行されていない場合 pbst; 5 分、4 回、dechorionate、× 1 で胚を洗います。目を解剖し、プロトコル 2.3 で説明されているようにスライドにそれらをマウントします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Percival, S. M., Parant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+Mitotic+Division+and+Dynamics+in+a+Live+Zebrafish+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo.</a> J. Vis. Exp. (113), e54218(2016).</li>
</ol>

著者は宣言する利害の対立があります。

ゼブラフィッシュ胚の SOS を観察するプロトコルの標準化されたシリーズを紹介します。閉鎖遅延表現型を決定するには、私達のプロトコルが脈絡裂閉鎖遅延を可視化するための技術と同様、目の背側鼻と時空間背側の側面の 2 つの離散葉の分離を区別する能力に焦点を当てています。腹側の目の表現型。
これらの可視化技術は、抑制や SOS の閉鎖での役割を研究するある特定の遺伝子の発現を誘導する効果を研究するさまざまな遺伝子操作技術と組み合わせて使用できます。我々 は我々 は以前それを示されているように、 gdf6a-/-の胚を使用してこれらのプロトコルその損失、SOS の適切な閉鎖に影響を与えることができますが、操作として任意の遺伝子の発現の効果を研究するプロトコルを使用することができますを選択しました必須。背の眼に任意の形態学的変化が解剖顕微鏡を用いた観察と事前に調査されることをお勧めします。彼らはより時間がかかり、低いスループット、最初のリンクが決定的に確立される、別のテクニックを使用する必要があります。
<p class="jove_conte...

脊椎動物の目の形成は、注意深く管弦楽に編曲された細胞間シグナル伝達経路が組織の種類を確立し、地域のアイデンティティ1指定の非常に節約されたプロセスです。眼の形態形成に対する摂動論に重大な欠陥に目のアーキテクチャと2まばゆいばかりの頻繁。1 つのような病気は眼杯3の腹側で脈絡眼裂を閉じます失敗に起因します。眼のコロボーマとして知られる、この障害は 4 5000 出生数と目4の中央に瞳孔から下方に突き出ている鍵穴のような構造としてけんしょう一般、小児失明の原因 3 11% から 1 で発生すると推定されます。 5,6。脈絡裂の機能は、後に割れ目の両側が船7を囲むヒューズ光カップに成長初期の血管のエントリ ポイントを提供することです。
眼のコロボーマは、古代から知られている中、目のスーペリアー/背側面に影響を与える組織の損失を最近小説欠損の患者のサブセットを同定しました。私たちの研究室の最近の研究は、我々 は優れた眼溝 (SOS) または上裂8として参照するゼブラフィッシュの背の眼の眼の構造の発見につながっています。構造が溝と割れ目の両方の特性を持っていることに注意してくださいすることが重要です。溝と同様に、鼻腔から一時的な網膜にまたがる継続的な組織の層です。さらに、構造の閉鎖しない基底膜に反対の 2 つの融合による、細胞により、構造が読み込まれます形成プロセスを要求する表示。ただし、割れ目と同様に、それは形作る基底膜と背の眼の鼻および時間的な側面を分離するという構造。一貫性を保つのため我々 が参照してくださいそれを SOS としてこのテキストで。
SOS は脊椎動物、魚、ニワトリ、イモリ、マウス8眼の形態形成時に見え間で保存されました。20 〜 60 時間後受精 (hpf) ゼブラフィッシュから存在する脈絡裂と対照をなして SOS 高速な過渡 20 23 hpf から簡単に見えること、欠席 26 hpf8で。当研究室における最近の研究は、脈絡裂と同様に、SOS 役割を果たしている目形態8血管ガイドで発見しました。形成と SOS の閉鎖を制御する要因は、まだ完全に理解されていないが我々 のデータはパターン化する遺伝子8背腹目の役割を強調しました。
ゼブラフィッシュは、SOS を研究する優秀なモデル生物であります。モデル システムとしていくつかの目の開発を勉強の利点を提供します: それは脊椎動物のモデル;各世代展示クマネズ (~ 200 胚);そのゲノム配列されている完全に、遺伝的操作を容易にします。ヒトの遺伝子の約 70% があることを人間の病気9,10の理想的な遺伝学に基づくモデルに少なくとも 1 つのゼブラフィッシュ細胞。最も重要なは、その開発が行われる外部から母親とその幼虫は透過的、相対的な容易さ11開発の目の可視化が可能です。
この一連のプロトコルでは、ゼブラフィッシュの幼虫で、SOS を視覚化できる手法について述べる。このレポートで使用されている可視化技術のさまざまなは、通常目の開発中に SOS の明確な観測だけでなく、SOS 閉鎖欠陥を検出する能力になります。Gdf6 の調査を特色にする私達の例のプロトコル、BMP は、背側にローカライズされた目と SOS 閉鎖の知られているレギュレータ。さらに、これらの技術は、遺伝的要因や適切な SOS 形成と開閉口挙動に影響を与える薬剤を識別する実験的操作と組み合わせることができます。さらに、我々 含まれている、すべての細胞膜の蛍光イメージングが可能、プロトコル SOS を周囲の細胞形態学的変化を観察する実験者を許可します。私たちの目標は、この新規開発の目の構造に新たな洞察を提供する科学のコミュニティで使用できる標準化されたプロトコルの設定を確立することです。

<table><tbody><tr><td>1-フェニル 2-チオ尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>100 mm シャーレ</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>35 mm シャーレ</td><td>Corning</td><td>CLS430588</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>AGA001.1</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>DIC /蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>AxioImager Z1</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡カメラ</td><td>Qimaging</td><td>MicroPublisher 5.0 RTV</td><td></td></tr><tr><td>ダウ コーニング 高真空グリース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩 (トリカイン)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A5040-25G</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ アレクサ フルーア 488</td><td>アブカム</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>画像キャプチャソフトウェア</td><td>ツァイス</td><td>ZEN</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>VWR</td><td>モデル 1545</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス(22 mm x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td></td></tr><tr><td>Minutien pin</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール pH 6.7 +/- 0.2</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1752-100</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ抗ラミニン抗体</td><td>ミリポアシグマ</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Dnase (2 U/&micro;L)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>超高純度低融点アガロー</td>ス <td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>超高純度ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Invitrogen</td><td>15525017</td><td></td></tr></tbody></table>

優れた眼溝の動脈分布胚発生中に可視化

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

先天性眼のコロボーマは、通常不完全な脈絡裂閉鎖に起因する目の下面に裂として注目されている遺伝的疾患です。最近、虹彩、網膜、小説構造の発見につながったレンズの優れた側面に欠損を持つ個人の識別と呼ばれる優れた裂または一過性の背側に存在する優れた眼溝 (SOS)、脊椎動物の目の開発中に光カップの側面。この構造体は、マウス、ニワトリ、魚、イモリを渡って節約は、SOS の私達の現在の理解は限られています。その形成と閉鎖に寄与する要因を解明するためにそれを観察し、SOS の閉鎖の遅れなど、異常を識別することができることが不可欠です。ここでは、私たちは標準化された一連の免疫蛍光染色や mRNA など一般的な分子生物学の技術で広く利用可能な顕微鏡技術を組み合わせることで効率的に SOS を視覚化するために使用できるプロトコルを作成に着手します。過剰発現。この一連のプロトコルは SOS 閉鎖の遅延を観察する能力に焦点を当てて、それは実験者のニーズに適応可能であるし、簡単に変更することができます。全体的に、我々 はを通じて、脊椎動物の目の開発の現在の知識を展開する SOS の私達の理解を進めることができる親しみやすいメソッドを作成してほしい。

ゼブラフィッシュ SOS 表示 20 で推定背側網膜8で hpf。幅広いインデント位置にその初期の狭いアーキテクチャから 23 の hpf SOS 遷移、26 それはもはや目に見える8hpf。したがって、通常のゼブラフィッシュ眼開発中に SOS を調べる、胚は 20-23 hpf 間遵守されなければなりません。この期間中に SOS は解剖顕微鏡を使って、(図 1) の開発の網膜の鼻と時間の半分を分ける背の眼の細い線として DIC イメージングによる観察です。さらに、微妙なインデントが目 (図 1) の背側の境界に表示されます。次のラミニンの免疫蛍光染色、基底膜 (図 1) に細い線を確認できます。
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ここでは、標準化された一連の優れた眼溝を観察するプロトコルを提案する脊椎動物の目で最近識別される、進化的に保存されている構造。ゼブラフィッシュ幼虫を用いて形成と眼肺尖の閉鎖に寄与する要因を識別するために必要な技術を示します。

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

この標準化プロトコルのセットは、優れた眼のサルカス、またはSOS、発達中の目の最近発見された構造に新しい洞察を提供するために使用することができます。これらのプロトコルは、世界中の実験者がゼブラフィッシュの目の開発中にSOSを明確に視覚化することを可能にします。ヘテロ接合性成長分化因子6 Aオスとメスのゼブラフィッシュを、ペアリングの前の晩にデフラリン水のタンクの仕切りの別々の側面に置くことから始めます。翌朝、仕切りを取り除き、魚が30分以下繁殖できるようにします。繁殖期間の終わりに、28.5度のインキュベーターでインキュベートするためにE3培地を含むペトリ皿に胚を集める。受精後20時間で上清を0.004%1-フェニル-2-チオ尿を補充したE3培地に置き換え、色素産生を防ぎ、光顕微鏡で胚を調べ、それらがすべて適切な発達段階にあることを確認する。サンプルを解剖顕微鏡の下に置きます。発達期の未熟な胚を捨て、細かい鉗子を使って穏やかに結び目を引き離します。目の裏の余白にインデントまたは線として表示される SOS を視覚化します。次に、SOS閉鎖遅延を示す胚をそうでない胚から並べ替えます。解剖顕微鏡を用いてこれらの胚を撮影するには、E3培地に1%アガロースを含むペトリ皿を準備し、アガロースの中心を軽く刺して、胚の黄身を置くことができる浅い穴を作ります。次いで、麻酔した胚をアガロースの上に横に置く。化合物または共焦点顕微鏡を使用して胚を画像化するには、ゲル化されていない1%低融点アガロースの小さなボーラスを含む35ミリメートルのペトリ皿に胚をE3培地に移し、細かい釣り糸を使用して胚を横位置に素早く配置する。アガロースが冷却されたら、アガロースをカバーするのに十分なE3培地を皿に注ぎ、SOSを視覚化するために20倍の水浸し対物レンズを使用します。イメージングの後、胚からアガロースをそっと引っ張り、4%パラホルムアルデヒドで組織を固定するか、ゼブラフィッシュがその発達を続けることを可能にする。蛍光mRNA発現によりSOSを可視化するために、マイクロインジェクション装置を用いて、1細胞段階で300個の強化されたGFP-CAX mRNAを胚に注入する。次に、蛍光ステレオスコープを使用して、明るい強化されたGFP発現を有する胚をスクリーニングし、実証された画像化方法の1つによって胚の画像を得る。胚性ゼブラフィッシュラミニンの全実装免疫蛍光染色の場合、デモンストレーションされたように胚をデコールニオンさせ、室温シェーカーで2時間調製したばかりの4%パラホルムアルデヒドでマイクロ遠心分離チューブに胚を固定する。固定の終わりに、PBSプラストゥイーン(PBST)で胚を洗浄ごとに5分間洗浄し、1回で1ミリリットル当たり10マイクログラムのパーメアビレーション、室温でプロテイナーゼKを5分間洗浄します。ペルメアナイズされた胚をPBSTで4回洗浄し、室温シェーカーでPBSTの5%ヤギ血清および1ミリリットル当たり2ミリグラムのウシ血清アルブミンをブロックする。ブロッキングインキュベーションの終わりに、一晩の震える上で摂氏4度で目的の一次抗ラミニン抗体の胚をインキュベートする。翌朝、PBSTで胚を1回15分間5回洗浄し、光から保護されたシェーカーの摂氏4度で一晩適切な二次抗体で組織にラベルを付けます。翌朝、PBSTで1回15分間胚を4回洗い、新鮮なPBSTを含む小さなペトリ皿に胚を入れます。細かい鉗子を使用して、卵黄を穏やかに破壊し、黄身嚢の軽度の擦り傷を通して黄身細胞を取り除く。脱ヨルク胚をPBSで新たに調製した30%グリセロールに移し、胚を溶液の上に置き、以前の溶液をできるだけ少なく移し、胚がチューブの底に沈むのを待ちます。胚が容器の底に達したら、ちょうど示したように、PBS溶液中の逐次50%および70%のグリセロールに移します。胚が70%グリセロール容器の底に沈んだ後、サンプルを小さなプラスチック皿に移して分離し、後部の胚を後脳に切断する。細かい解剖ツールを使用して、できるだけ少ないグリセロールでガラススライドに1つの頭を移動し、内側から前脳心室に細かいミヌティエンピンをそっと挿入し、頭の右半分と左半分を互いに分離するために下に押します。ヘッドが完全に正中線に充填されたら、ヘッドの各側を正中線下に、目側を上に取り付けます。SOSは、受精後20〜23時間の解剖顕微鏡を通して、そして発達中の残り線の鼻と側頭の半分を分離する背側眼の細い線として差動干渉コントラストイメージングを介して観察可能である。さらに、目の裏の境界に微妙なインデントが見える場合があります。ラミニンの免疫蛍光染色に続いて、細線を原膜として確認することができる。SOS閉鎖が遅れると、その長期の存在は、解剖顕微鏡の下で眼の側側の顕著な裂け目として観察することができる。この特徴は、微分干渉コントラストイメージングを用いて複合顕微鏡で観察した場合、SOSによって分離された眼の鼻側と側頭側と、後眼の線としてはっきりと見える場合に、さらに顕著である。野生型ゼブラフィッシュの受精後28時間までに、ラミニン染色はSOSが完全に閉鎖されていることを明確に示し、裂け目閉鎖の遅延を監視するための理想的な段階です。強化されたGFP-CAX mRNAの注入はSOS閉鎖につながる細胞の形態の変化を追跡するために生きているかまたは固定胚の細胞膜の視覚化を可能にする。SOS の視覚化は狭く一時的であるため、難しい場合があります。ただし、後で終了の遅延を評価する場合は、一貫性のあるスコアリング方法を維持することが不可欠です。これらの技術は、適切なSOSの形成および閉鎖に影響を与える遺伝的要因または薬理学的薬剤を同定するための実験的操作と組み合わせることができる。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は段階的な準備をする手順を説明...

ホールマウントの胎児神経系の可視化ショウジョウバエ胚

ここでは、ステンドグラスの取り付けプロトコルを提示...

の直立イメージングショウジョウバエ胚

ソース: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp.

蛍光顕微鏡法を用いたショウジョウバエの蛹眼のライブイメージング

出典:Jeong, S. Visualization of the Axonal projection pattern of the Embryonic motor neurons in Drosophila.J. Vis. Exp.

ショウジョウバエにおける胚性運動ニューロンの軸索投影パターンの可視化

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

このプロトコルは、生きたショウジョウバエの蛹の眼神経上皮をイメージングするための効率的な方法を提供します。この方法は、組織の動きと不均一なトポロジーを補正し、複数のGFPタグ付き接合タンパク質を使用して細胞境界の視覚化を強化し、簡単に組み立てられるイメージングリグを使用します。...

のライブイメージングショウジョウバエ蛹アイ

ライトシート蛍光顕微鏡は、胚発生をイメージングするための優れたツールです。これにより、生理学的に近い状態で生きた胚の長時間のタイムラプス動画を記録できます。私たちは、広い時空間スケールでのゼブラフィッシュの眼の発達のイメージングへの応用を実証し、マルチビューデータセットの融合とデコンボリューションのパイプラインを提示します。...

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。...

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

免疫組織化学、西部の分析、および RNA 抽出のための組織の処理のためのプロトコル、ショウジョウバエ蛹網膜を解剖するための手術方法を提案する.

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

ここでは、市販のライトシート顕微鏡および画像処理ワークステーションを用いて眼形態形成のタイムラプスイメージングを行い、得られたデータを解析するためのプロトコルが提供される。このプロトコルは、胚麻酔、低融解温度アガロースへの埋め込み、イメージングチャンバ内の懸濁、イメージングパラメータの設定、および最後に画像解析ソフトウェアを使用したイメージングデータの分析の手順を詳述しています。...

rx3:GFPトランスジェニックゼブラフィッシュを用いたライトシート顕微鏡による眼の形態形成の可視化

ここで説明するプロトコルは、生後5日のゼブラフィッシュ幼虫の頭蓋顔面軟骨を染色および解剖するための簡単で従いやすい手順を示しています。さまざまな発達条件下でのこれらの構造の解剖学的構造、形状、サイズを研究するために使用できます。...

アルシアンブルー染色時のゼブラフィッシュ頭蓋顔面組織の解剖

学ぶゼブラフィッシュ胚における優れた眼溝（SOS）の可視化プロトコル。発生生物学と神経科学の研究に活用でき、脊椎動物の眼形成メカニズム解明に貢献します。

優れた眼溝の動脈分布胚発生中に可視化

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