骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル
April 12th, 2019
骨肉腫 (OS) の骨細胞外マトリックス (BEM) モデルは、よく確立され、表示をここでです。原発腫瘍の成長の in vitro真似をして OS の組織学的および cytogenic の多様性を研究するための理想的なモデルを提供するため、適切な足場として使用できます。
この方法は、骨腫瘍研究のための機能的な足場を調製するための効率的な戦略を提供する。骨外細胞化マトリックスを脱細胞化し、骨肉腫細胞の生存および活動に対する可変的な血清相溶性を示した。この技術の主な利点は、骨由来マトリックス中の骨肉腫細胞培養が臨床骨肉腫組織病理学と同様に非常に異種形態を示していることである。
この方法は、骨肉腫、ユーイング肉腫、および骨への転移の他の悪性腫瘍などの骨腫瘍の発達、薬物感受性の進行を調査するための理想的なモデルを提供する。まず、4〜6週齢のBALB/cマウスを得て、無菌手術用ハサミを使用してマウスを安楽死させた後、後肢から新鮮な脛骨、脛骨、大腿骨を切断する。ピンセットの助けを借りて、上皮組織を剥がし、できるだけ多くの軟部組織を取り除きます。
無菌10 mM PBS溶液で脚の骨を2回洗い流し、6センチメートルの皿の中の血液を取り除きます。骨を75%エタノールで3分間皿に浸し、PBSで2回洗いすます。清潔な骨を無菌の50ミリリットル遠心管に保管し、滅菌PBSチューブを摂氏80度で保存します。
凍った骨を室温で解凍し、摂氏80度で再び1時間凍結します。骨を細胞のリシスと組織の分解のための2つ以上の凍結融解サイクルに服従させる。その後、0.5正常なHClで満たされた無菌50ミリリットル遠心管に骨を入れ、骨の完全かつ均等なカバレッジを確保するために穏やかな揺れで軌道シェーカーの室温で一晩インキュベートします。
脱灰後、塩酸溶液を完全に脱栓し、流水の下で骨を1時間リンスします。その後、蒸留水を使用して、軌道シェーカーで1回15分間骨を2回洗浄します。ソリューションを完全にデカンスします。
脱塩した骨の脂質を抽出するには、メタノールとクロロホルムの1:1混合物で50ミリリットル遠心管に骨を入れます。クロロホルム分解防止のため、チューブをスズ箔で包み込んで光を避けます。そして、1時間軌道シェーカーにチューブを置きます。
その後、ピンセットを使用して、30分間スズ箔でメタノールの別のチューブに骨を移します。メタノールを完全に取り出し、眼窩シェーカーで蒸留水を15分間2回洗います。デカント最終洗浄水と滅菌条件下で進みます。
滅菌PBSで6センチメートルの皿で骨を3分間洗いすみます。無菌0.05%TE溶液40ミリリットルを50ミリリットルの遠心管に加え、37°Cの二酸化炭素インキュベーターで23時間骨をインキュベートします。TE溶液を廃棄し、90 g/mLアンピシリンと90 g/mLカナマイシンをオービタルシェーカーでそれぞれ15分間補充した滅菌PBSで2回リンスします。
最終洗浄を完全にデカントした後、抗生物質で滅菌PBSの40ミリリットルで再び補充する。多孔質空間の効果的な滅菌を達成するために穏やかな揺れで室温で24時間十分に洗います。次に、抗生物質で滅菌PBSで満たされた50ミリリットル遠心分離管に骨を移す。
調製された骨細胞外マトリックスは、摂氏4度で2ヶ月間保存することができる。BEMを75%エタノールに入れ、30秒間手で軽く振ります。その後、PBSで30秒間、2回リンスします。
BEMを清潔な6ウェル細胞培養プレートに移します。各ウェルに完全な培養培地の2ミリリットルを追加します。37°Cの二酸化炭素インキュベーターでBEMを一晩インキュベートします。
標識フェノールレッドを含む予め温めたPBSの100マイクロリットルでヒトOS細胞株を得る。ピペットを使用して、およそ10倍から5日までの濃度のOS細胞を一時停止します。BEMが培地に完全に浸漬された後、近位または遠位の骨端から、針をBEMの髄腔に穿孔し、OS細胞をBEMに注入する。
37°Cの加湿された5%の二酸化炭素雰囲気で最低2時間、OS-BEMモデルをインキュベートし、注入された細胞がBEMにしっかりと付着するようにします。次に、インキュベーターからプレートを取り出します。プレートに1ミリリットルの培養培地を加え、一晩インキュベーターに保管してBEM培養物の表面を完全にコーティングします。
OS-BEMモデルを滅菌用トゥイザー付きの6ウェルプレートの新しいウェルにそっと移し、1ミリリットルの新鮮な培養培地を再供給します。インキュベーターで14日間モデルを培養する。14日間のインキュベーション中は、中色をモニタリングし続けてください。
メディアがオレンジ色、あるいは黄色に変わったら、古い媒体の半分を捨てて新しい媒体を追加して、すぐにメディアをリフレッシュして、OSセルの健全な環境を維持します。反転蛍光顕微鏡下で細胞の状態を監視し続けます。OS細胞がプレートに膨張したら、OS-BEMモデルを滅菌ピンセットで別の新しいウェルにそっと移します。
14日間培養した後、PBSでOS-BEMモデルをそっとすすいで培養液を除去します。その後、15ミリリットル遠心分離管に移し、組織学的同定のために10%緩衝ホルマリンを加える。脱塩・脱細胞化後、BEMはネイティブマウスの骨に比べて強い弾力性と粘り強さを持つ半透明であるように見えます。
髄腔の空間に少し筋残渣が明確に観察される。天然骨および脱細胞化BEMの明視野イメージングは、細胞核の徹底的な除去を示す。コラーゲンネットワーク配置における自然多孔質構造は、脱細胞化BEMにおいて十分に維持される。
さらに、コラーゲンIおよびコラーゲンIVの免疫ヒストリカル染色は、細胞外マトリックスの主成分が脱細胞化後にマウス脛動物に保存されていることを示す。14日間の培養中、骨膜とエンドステウムの両方がOS細胞の増殖によって浸透する。細胞化されたBEM上のOS細胞は、OSセクションの細胞病理学的特徴と同様に、非常に異種の形態を示す。
14日間のBEMモデルで培養した後の免疫学的分析は、長期培養において大きな利点を示す。また、OS細胞およびBEM培養は、骨マトリックス糖タンパク質を高度に発現し、これは、骨マトリクスに特異的である。このin vitroの3次元モデルは、表現型の異質性と骨肉腫脱分化の調節メカニズムを実証するために使用されています。
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概要
骨細胞外マトリックス（BEM）モデルは、骨肉腫（OS）の原発腫瘍の成長を模倣するための適切な足場として確立されています。このモデルは、OSの組織学的および細胞遺伝学的多様性の研究に役立ちます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 骨腫瘍研究
- 骨肉腫
- 組織病理学
背景
- BEMモデルは骨肉腫の理解に不可欠です。
- 脱細胞化された骨細胞外マトリックスは様々な血清適合性を示します。
- 骨肉腫細胞はこのモデルで多様な形態を示します。
- このモデルは臨床的な骨肉腫の組織病理を反映しています。
研究目的
- 骨腫瘍の発展と進行を調査すること。
- 骨肉腫および関連腫瘍における薬物感受性を評価すること。
- in vitro 研究のための機能的な足場を提供すること。
使用された方法
- 脱細胞化された骨細胞外マトリックスの調製。
- 骨由来マトリックスで骨肉腫細胞の培養。
- 骨サンプルの取得のためのBALB/cマウスの利用。
- 組織準備のための外科的技術。
主要な結果
- BEMモデルで培養された骨肉腫細胞は多様な形態を示します。
- このモデルは骨肉腫の臨床的組織病理を模倣します。
- 様々な血清適合性が細胞の生存と活性をサポートします。
- 薬物感受性と腫瘍進行に関する洞察を提供します。
結論
- BEMモデルは骨肉腫の研究に効果的です。
- in vitro 研究のための現実的な環境を提供します。
- この方法は骨腫瘍の生物学の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The three-dimensional bone extracellular matrix (BEM) model provides a physiologically relevant scaffold for osteosarcoma (OS) research, enabling the study of tumor heterogeneity and phenotypic plasticity in vitro. By preserving the native bone microenvironment, this model supports mechanistic de-risking in target validation and preclinical evaluation of bone-tumor therapeutics. It offers translational continuity from discovery to lead identification by recapitulating clinical histopathology and genetic regulatory mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through phenotypic heterogeneity that mirrors clinical OS specimens.
- Operational Value: Supports biological de-risking by maintaining extracellular matrix components critical for tumor-stroma interactions.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking morphological diversity to genetic alterations and regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible 3D culture system for consistent compound screening across OS phenotypes.
- Operational Value: Enables quantitative readouts via immunohistochemical staining for collagen I/IV and bone matrix glycoprotein to assess matrix deposition and osteoid formation.
- Scalability: Compatible with multi-well plate formats and long-term culture (14 days) for dose-response and time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Maintains disease-relevant system fidelity by recapitulating the histologic complexity of human OS.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by modeling OS cell infiltration into periosteal and endosteal compartments.
- Mechanistic De-risking: Allows visualization of dedifferentiation pathways and association with underlying regulatory networks.
Pipeline & Workflow Integration
The BEM model functions as a discovery-phase tool that bridges target validation and lead identification by providing a disease-relevant system for phenotypic screening and mechanistic interrogation of OS.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on tumor-stroma interactions and phenotypic plasticity in a native bone-derived matrix.
- Screening: Delivers assay-ready scaffolds with quantitative outputs for evaluating drug sensitivities and tumor progression.
- Analytics: Enables comparative analysis through immunohistochemical staining and bright-field imaging of morphological and molecular phenotypes.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by preserving collagen network architecture and supporting long-term OS cell culture.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable platform for studying primary bone tumors and bone metastases across multiple oncology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through recapitulation of OS histopathology and heterogeneous morphology.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via decellularized bone matrix with preserved extracellular matrix composition.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in bone-tumor models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on phenotypic response in a clinically relevant 3D system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, sterile cell culture, and histological processing.
- Dependent on access to animal bone sources and equipment for freeze-thaw cycles, decalcification, and lipid extraction.
- Necessitates cross-team standardization for BEM preparation, sterilization, and OS cell seeding protocols.
- Adaptation considerations include variability in bone source quality and potential residual marrow components affecting consistency.
- Practical limitations include the 24-hour antibiotic wash requirement and two-month storage constraint at 4°C.
