Name: 無呼吸性遺伝子検査用半導体シーケンシング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: 学ぶ半導体シーケンスによる無呼吸性遺伝子検査法。胚の染色体異常を迅速かつ低コストでスクリーニングし、サンプル受付から報告書発行まで5日間で完了する再現性の高い手法です。

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この研究は、広西省科学技術財団の主要研究計画である中国国家自然科学財団(Ref No.81860272)である香港の一般研究基金(Ref No.14162417)の支援を受けた。AB16380219)、および中国から中国ポストドクター科学財団助成金(Ref No. 2018M630993)。

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<li>Barbash-Hazan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+aneuploid+embryos+undergo+self-correction+in+correlation+with+their+developmental+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential.</a> Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).</li>
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<li>Fiorentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next-generation+sequencing+technology+for+comprehensive+aneuploidy+screening+of+blastocysts+in+clinical+preimplantation+genetic+screening+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles.</a> Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).</li>
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<li>Harton, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESHRE+PGD+consortium+best+practice+guidelines+for+amplification-based+PGD%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD.</a> Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).</li>
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</ol>

著者は何も開示していない。

他のシーケンシング化学品とは異なり、ここで説明するシーケンサーは、ヌクレオチドの検出に半導体を使用します。チップ自体は、ポリメラーゼ駆動ベース組み込み17により水素イオンを検出する電子デバイスであり、プロトンプログラムの2〜4時間シーケンシング時間を可能にする。また、このチップは、他のシーケンサープロバイダーによるフローセルシーケンシング化学とは異なる1つの標的分子の局在化を可能にするマイクロウェルチップです。このプロトコルは、PGT-Aの適用に最適化された改変プロトコルです。最適化には、汚染の可能性を減らすために超音波処理の代わりに酵素法による増幅DNAの断片化が含まれており、サイズ選択とPCRシステムは、より低コストでより良いパフォーマンスを実現します。さらに、臨床設定では、バリアント呼び出しに検証済みの社内パイプラインを使用しました。
演習中に注意する必要がある重要な手順があります。精製用エタノールは、高濃度のエタノールが汚染されたDNAの洗浄不足を引き起こし、低濃度では標的DNAの損失を引き起こすため、実験前に新たに準備する必...

補助生殖における転移のための正常な染色体コピー番号(ユーロイド)を持つ良好な生存胚を選択することは、妊娠の結果を改善するのに役立ちます。伝統的に、確立された形態グレーディングシステムは、その容易な可用性と非侵襲的な性質のために胚の評価のために広く使用されています。しかし、形態学的評価は、胚の質1および移植電位2に関する限られた情報しか提供できることが示されている。根本的な理由の一つは、胚の染色体組成を評価できないことである。
染色体異性体(染色体の異常コピー数)は、胚発生停止、移植不全または妊娠喪失につながる主な原因の一つである。無気腫の発生はヒト胚において十分に文書化されており、胚盤胞5では切断段階胚3、4および50%−60%で60%−70%を占めている。これは、ある程度、体外受精(IVF)治療の妊娠率の改善におけるボトルネックに寄与しており、これは約35%−40%6、7で維持されている。したがって、移植のためのユーロイド胚を選択することは、妊娠の結果を改善するために有益であると考えられている。この目的のために、移植前遺伝子検査(PGT-A)は、遺伝的アプローチを用いて胚の生存率を調べるためにさらに開発された。PGT-Aの重要な役割をサポートする無作為化対照試験およびコホート研究の数が増加している。PGT-Aの適用は流産率を減少させ、臨床妊娠率および移植率8、進行中の妊娠率および出生率9を増加させることを証明した。
歴史的に、PGT-Aには、その場所ハイブリダイゼーション(FISH)、比較ゲノムハイブリダイゼーション(CGH)、アレイ-CGH、単一ヌクレオチド多型(SNP)マイクロアレイなどの異なる方法が適用されてきました。これまでの研究では、FISHによる切断段階胚に対するPGT-Aは、59273array-CGHまたは59273array-CGHを用いた対応する胚盤胞の包括的な染色体スクリーニング(CCS)によって得られたものと一致しない結果を得るSNP-マイクロアレイ5927310.これらの不一致は、染色体モザイク、FISH技術アーティファクト、または開発11の間に染色体分離エラーの胚自己補正に起因しうる。アレイCGHやSNPマイクロアレイなどのアレイベースのPGT-Aに胚盤胞性栄養細胞(TE)生検を用いることは、胚10、12における染色体不均衡の同定に有効であると広く認識されている。近年、単細胞次世代シーケンシング(NGS)は、遺伝子解析のための高スループットと費用対効果の高いアプローチを提供し、PGT-A 13,14,15の臨床的応用性を示しています。現在利用可能な方法に代わる有望な方法です。
ここでは、ヒト胚における無気球体のスクリーニングのための高速、堅牢、低コストの半導体シーケンシングベースのNGS法を提示する。ワークフローの最初のステップは、生検胚標本の全ゲノム増幅(WGA)であり、単一細胞WGAキットを使用して、シーケンシングライブラリの構築、および半導体シーケンシングシステム上でのその後のシーケンシングを行います。
DNA鎖合成時に各デオキシリボヌクレオシド三リン酸から放出されるH+イオンを検出することにより、半導体元素によって捕捉された化学信号(pH変化)を転送し、デジタルデータを導くDNA配列情報にさらに解釈されます。高価な光学検出および複雑なシーケンシング反応のための条件を除去し、この簡単なシーケンシング化学は総試薬の費用を削減し、2-4時間16にシーケンシングの実行時間を短縮する。さらに重要なのは、製造元のパフォーマンス仕様に基づいて、半導体シーケンシングプラットフォームは、実行あたり最大15 GBのシーケンスデータ(ライブラリの品質に依存)を生成でき、他のシーケンサーよりも大幅に高い約 3−4 GBのデータ(2 x 75 bpの読み取り長)17を生成します。PGT-Aの臨床応用では、このプラットフォームは、最大8,000万回の読み取り17回、各サンプルの少なくとも100万回のユニークな読み取り値を生成するチップあたり24サンプルを達成することができます。読み取り深さは各サンプルが少なくとも0.05x全体のゲノムカバレッジを有することを保障できる。このプラットフォームの上記の利点は、理想的なスクリーニング方法を作り、したがって、PGT-A18でその広いアプリケーションを容易にします。

<table><tbody><tr><td>PCR チューブ、0.2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02D-C</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA、pH 8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4、Ca2+ および Mg2+ フリー</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M NaOH (1.0N) 溶液</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S2567</td><td>メルトオフ溶液用。分子グレード</td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind チューブ、1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-791</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 M&Omega; water system</td><td>ThermoFisher</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Amplification buffer</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>SurePlex DNA Amplification System(カタログ番号:PR-40-415101-03)で置き換えることができます。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 増幅酵素</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>SurePlex DNA Amplification System(カタログ番号:PR-40-415101-03)で置き換えることができます。</td></tr><tr><td>Ion OneTouch 増幅プレート</td><td></td><td></td><td>キット内:Ion OneTouch 2 サプライ(部品番号 A26367)。シート5の拡張キットコンポーネント</td></tr><tr><td>Ion PI アニーリングバッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MyOne ビーズ キャプチャーソリューション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 バイオアナライザー機器</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch Breaking Solution (ブラックキャップ)</td><td></td><td></td><td>キット内: Ion PI Hi?Q OT2ソリューション200(部品番号A26429)。シート5</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td><td>ThermoFisher</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 細胞抽出バッファー</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td> の拡張キットコンポーネント <td>これは、SurePlex DNA増幅システム、カタログ番号:PR-40-415101-00に置き換えることができます。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 細胞抽出酵素</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>これは、SurePlex DNA増幅システム、カタログ番号:PR-40-415101-03に置き換えることができます。</td></tr><tr><td>Ion PI Chip Kit v3</td><td>ThermoFisher</td><td>A26771</td><td></td></tr><tr><td>Ion Chip Minifuge, 230 V</td><td>ThermoFisher</td><td>4479673</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dATP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dCTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dGTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>ThermoQ&ndash;温度ドライバス</td><td>TAMAR</td><td>HB-T2-A</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348L</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI dTTP</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch 2 Instrument</td><td>ThermoFisher</td><td>INS1005527</td><td>ThermoFisher カタログ番号:4474778.</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Ion One Touch ES</td><td>ThermoFisher</td><td>8441-22</td><td>カタログ番号:4469495.シート5</td></tr>エ<tr><td>タノール</td>の拡張キットコンポーネント <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>51976</td><td>これは、任意のブランドの分子グレードの無水エタノールに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 抽出酵素希釈バッファー</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>これは、SurePlex DNA増幅システム、カタログ番号:PR-40-415101-01に置き換えることができます。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA 抽出酵素希釈バッファー</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>これは、SurePlex DNA増幅システム、カタログ番号:PR-40-415101-02に置き換えることができます。</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td>このモデルは、Qubit 4 Fluorometer(カタログ番号:Q33226)に置き換えられました。</td></tr><tr><td>Qubit ds DNA HS Assay kit</td><td>ThermoFisher</td><td>M2002-02</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Assay Tubes</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Foaming Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Index for barcoding of libraries</td><td>BaseCare</td><td></td><td>これは、社内で調製したインデックスです。ユーザーは、ThermoFisher Ion Xpress バーコード アダプター キット (Cat.No. 4474517)</td></tr><tr><td>Ion PI ローディングバッファー</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>4389764</td><td></td></tr><tr><td>Agencour AMPure XP Kit</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット (磁気ラック)</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI Master Mix PCR buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge</td><td>Micro 17</td><td>75002430</td><td></td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9922</td><td>これは他のブランドに置き換えることができます。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA ヌクレアーゼフリー水</td><td>ルビコンゲノミクス</td><td>R30050</td><td>SurePlex DNA増幅システム(カタログ番号:PR-40-415101-03)に置き換えることができます。</td></tr><tr><td>Ion OneTouch オイルボトル</td><td></td><td></td><td>Ion PI Hi?Q OT2ソリューション200(部品番号A26429)。Extended kit component in Sheet 5</td></tr><tr><td>Ion Plus Fragment Library Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>Extended kit component in Sheet 3</td></tr><tr><td>double-strand DNA standard</td><td></td><td></td><td>これは、ライブラリの定量前にQubitをキャリブレーションするための社内調製DNAスタンダードです。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Preamplification buffer</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>SurePlex DNA Amplification System(カタログ番号:PR-40-415101-03)で置き換えることができます。</td></tr><tr><td>PicoPLEX WGA Preamplification enzyme</td><td>Rubicon Genomics</td><td>R30050</td><td>これは、SurePlex DNA増幅システム、カタログ番号:PR-40-415101-03に置き換えることができます。</td></tr><tr><td>ライブラリ増幅プライマーミックス</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>拡張キットコンポーネント シート 3</td></tr> イオン <tr><td>OneTouch 反応フィルター</td><td></td><td></td><td>拡張キットコンポーネント シート 5</td></tr><tr><td>リカバリールーター</td><td></td><td></td><td>拡張キットコンポーネント シート 5</td></tr> の<tr><td>リカバリーチューブ</td><td></td><td></td><td>拡張キットコンポーネント シート 5</td></tr><tr><td>の ISP 再懸濁ソリューション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イオンプロトン</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーDA8600</td><td>このモデルは、サーモフィッシャーから中山大学のダアンジーン株式会社によって輸入され、中国食品薬品監督管理局によって臨床応用が認定されています。ThermoFisherのカタログ番号は4476610です。</td></tr><tr><td>イオンPIこんにちは?Q シーケンシング ポリメラーゼ</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>シーケンサー用</td><td>Ion</td><td></td> PI Sequencing プライマーサーバー Lenovo T260 <td></td></tr><tr><td>Ion PI Sphere Particles Platinum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR SuperMix High Fidelity</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td></td></tr><tr><td></td> Nalgene 25mm シリンジフィルター ThermoFisher 724-2045 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>細孔径:0.45μm.特に水性流体用。</td></tr><tr><td>イオンPIこんにちは?Q W2 Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion PI 1X W3 Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td></td></tr><tr><td>Ion OneTouch Wash Solution C1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The Ion PGM Hi?Q View シーケンシングキット</td><td>ThermoFisher</td><td>A30044</td><td>シート 2 の拡張キットコンポーネント</td></tr><tr><td>Ion Plus フラグメントライブラリキット</td><td>ThermoFisher</td><td>4471252</td><td>シート 3 の拡張キットコンポーネント</td></tr><tr><td>Ion PI Hi-Q シーケンシング 200 キット (初期化ごとに 1 回のシーケンシング実行)</td><td>ThermoFisher</td><td>A26772</td><td>シート 4</td></tr><tr><td>Ion PI Hi?Q OT2 200 キット</td><td>ThermoFisher</td><td>A26434</td><td>拡張キット コンポーネント シート 5</td></tr></tbody></table>

無呼吸性遺伝子検査用半導体シーケンシング

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

染色体異性体は、胚発生停止、移植不全、または妊娠喪失につながる主な原因の1つであり、ヒト胚において十分に文書化されている。移植前遺伝子検査(PGT-A)は、胚の染色体異常を検出することによって生殖結果を有意に改善する遺伝子検査である。次世代シーケンシング(NGS)は、遺伝子解析のための高スループットと費用対効果の高いアプローチを提供し、PGT-Aの臨床的応用性を示しています。ここでは、胚における無気不変のスクリーニングのための迅速かつ低コストの半導体シーケンシングベースのNGS法を提示する。ワークフローの最初のステップは、生検胚標本の全ゲノム増幅(WGA)、続いてシーケンシングライブラリの構築、および半導体シーケンシングシステム上のシーケンシングです。一般に、PGT-A アプリケーションの場合、各チップに 24 個のサンプルをロードし、150 塩基対の平均読み取り長で 60-8000 万の読み取りを生成します。この方法は、テンプレートの増幅とシーケンシング ライブラリの強化を行うための洗練されたプロトコルを提供し、PGT-A検出を再現可能、高スループット、コスト効率、および時間節約にします。この半導体シーケンサーの稼働時間はわずか2~4時間で、サンプルの受け取りからレポートの発行までの所要時間を5日間に短縮します。これらすべての利点は、このアッセイを胚から染色体異性体を検出し、したがって、PGT-Aでの広い適用を容易にする理想的な方法を作る。

この改変プロトコルに基づき、半導体シーケンシングプラットフォームは初めてPGT-Aに適用されました。切断段階の胚盤胞と胚盤胞期胚の両方からの生検について試験した。生検細胞は、DNAの分解を防ぐために、できるだけ早くWGAを受けることが示唆される。以前の研究では、異なるWGAメソッドの性能を比較し、ここで説明した方法は、100 KB20のビンサイズで最高の均一性を持っていることを示しました。均一性と中央値絶対対方向差(MAPD)21の両方の性能を考慮して、このWGA法は半導体シーケンサーを用いてPGT-Aに選択した。186の切断段階と1135個の胚盤胞期胚に関する遡及的統計分析を通して、WGAの成功率は胚盤胞サンプルで95.4%、胚盤胞サンプルで96.9%であったことが分かった(図1)。サイズ選択手順としてのライブラリ構築前の精製工程は、大きなDNA断片を捕捉して品質をシーケンシングするために重要でした。さらに、ライブラ...

ここでは、短い所要時間、低コスト、高スループットの利点を有する、異性化症(PGT-A)の移植前遺伝子検査用半導体シーケンシング法を紹介する。

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

私たちがここに提示するプロトコルは、胚の無数性をスクリーニングするための迅速かつ低コストのセミコンダクター、シーケンシングベースの方法です。テンプレートの増幅を行うための洗練されたプロトコルとシーケンシングライブラリの配置により、PGTA検出は再現性、高スループット、コスト効率と時間の節約になります。この半導体シーケンサーの実行時間はわずか2〜4時間です。サンプルの受信からレポートの発行までの所要時間を 5 日間短縮します。この方法は、異数化スクリーニング、コピー数変動、および一塩基多型呼び出しのためのゲノムシーケンシングを提供する。異なるシーケンシング化学のために、このプロトコルによって準備されたライブラリは、他のシーケンスシステム上で直接配列することはできません。しかし、同じシーケンサーは、異なるライブラリ調製物であるが、非侵襲的な出生前スクリーニングを行うことができる。この手順のデモンストレーションは、当研究室の技術者であるシャンチュン・グオです。シーケンシングを開始するには、各希釈されたライブラリを渦巻き、毎回3秒間ミニ遠心分離機で4回短時間回転します。次いで、各ライブラリーの5マイクロリットルを取り、核を含まない、5ミリリットルチューブを1点にプールする。混合ライブラリを渦巻き、3秒間ミニ遠心分離機で短時間回転します。2つの新しい回収管に、壊れた溶液の150マイクロリットルを加えます。新しい回復管、回復用ルータおよび増幅版を取付けなさい。オイルボトルを3回反転して混ぜます。オイルと回収液の両方が少なくとも3分の2満杯であることを確認してください。30秒間、マスターミックスPCRバッファーをボルテックスし、3秒間ミニ遠心分離機で短時間スピンします。球体粒子と混合ライブラリを1分間渦巻きし、ミニ遠心分離機で3秒間短時間回転します。次に、2400マイクロリットルのライゲーションミックスを調製し、172マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水、8マイクロリットルの混合ライブラリー、120マイクロリットルの酵素ミックス、および100マイクロリットルの球体粒子を、マスターミックスPCRバッファーの2000マイクロリットルを含むチューブに加える。ピペットを800マイクロリットルにセットし、サンプルポートを通して反応フィルターにライゲーションミックスをロードします。オイルボトルを3回反転し、P1000ピペットを使用して反応フィルターに200マイクロリットルの反応油を加えます。プログラム Proton を選択し、モニターの指示に従ってデバイスが正しくセットアップされていることを確認するために、補助ボタンを選択します。次へをクリックしてプログラムを起動します。エマルジョンPCR製品サンプルの100マイクロリットル、洗浄ビーズの130マイクロリットル、ES洗浄液の300マイクロリットル、および300マイクロリットルの溶融溶液を8つのチューブストリップにロードします。8本のチューブストリップを濃縮システムに配置します。ピペットチップと新しいゼロポイント2ミリリットルチューブをインストールし、プログラムを開始します。遠心分離器は、ゼロ点2ミリリットルチューブを15で、500倍Gで5分間行う。上清を捨て、濃縮製品の10マイクロリットルを保管してください。200マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をチューブに加え、渦を混ぜて混ぜます。再びゼロ点2ミリリットルチューブを遠心分離する。上清を捨て、濃縮製品の10マイクロリットルを保管してください。ヌクレアーゼフリー水90マイクロリットルをチューブに加え、渦を混ぜて混ぜます。テンプレートを準備するには、ポジティブコントロールを渦を出して、短時間スピンします。濃縮製品の100マイクロリットルに正のコントロールの5マイクロリットルを追加します。ボルテックスと遠心分離機を15,500倍Gで5分間行う。上清を捨てて、テンプレートの10マイクロリットルを保管してください。次に、シーケンシングプライマーの20マイクロリットル、および15マイクロリットルのアニーリングバッファーをテンプレートチューブに加えます。チューブを渦巻きし、3秒間ミニ遠心分離機で短時間回転します。加熱された蓋を用いて、チューブをサーマルサイクラーにインキュベートします。次に、10マイクロリットルの荷重バッファーをチューブに加えます。上下にピペットを入れ、混ぜます。55マイクロリットルのサンプルを上下にピペットで混ぜ、サンプルをチップのローディングウェルにロードします。使用するピペットチップとゼロポイント2ミリリットルPCRチューブを保管してください。チップにサンプルが入ったら、チップをチップミニ遠心分離機に置きます。位置を確認し、チップを10分間遠心します。500マイクロリットルのアニーリングバッファーと500マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を1点5ミリリットルチューブに加えて50%アニールバッファーを調製します。洗浄液を調製し、500マイクロリットルのアニーリングバッファーと500マイクロリットルの100%2-プロパノールを1点5ミリリットルチューブに加えます。次いで、発泡混合物を調製し、50%焼鈍緩衝液の49マイクロリットル及び発泡液の1マイクロリットルを2つの新しい1点5ミリリットルチューブに加えた。ピペット空気を発泡混合物の1つに、そして120マイクロリットルの気泡を装填井戸に積み込む。過度に排出された液体を出口からローディングウェルに移し、チップミニ遠心分離機でチップを30秒間遠心します。2 番目の発泡混合物のプロセスを繰り返します。50%アニールバッファーの 55 マイクロリットルをゼロポイント 2 ミリリットルチューブに加えます。ピペットチップを使用して、ピペットを上下にします。アニーリングバッファーの 55 マイクロリットルをすべてロードウェルにロードします。指定されたチップミニ遠心分離機でチップを30秒間遠心分離します。100マイクロリットルのフラッシュ溶液をチップローディングウェルにロードし、排出された液体を出口井戸から捨てます。このロード手順を 1 回繰り返します。50%アニールバッファの100マイクロリットルをチップローディングウェルに積み込みます。このロード手順を合計 3 回繰り返します。50%アニールバッファーの 60 マイクロリットルとシーケンシング酵素の 6 マイクロリットルを新しい 1 ポイント 5 ミリリットルチューブに加えます。上下にピペットを入れ、混ぜます。この混合溶液の65マイクロリットルをチップローディングウェルにゆっくりとピペットし、気泡を避けます。チップを光から遠ざけ、室温で5分間インキュベートします。最後に、インキュベーションの後、すぐにシーケンサーにチップをロードし、シーケンス実行を開始をクリックしてシーケンスを開始します。186の切断段階および1135個の胚盤胞期胚に関する遡及的統計分析は、両方のタイプのサンプルにおいて95%以上のWGA成功率をもたらした。シーケンシング品質管理の失敗率は、切断段階群で3.4%、胚盤胞期群ではわずか1.9%であった。非効率法の他に、シーケンスデータを他の分析に使用できます。たとえば、サイズが 5 メガベース未満の数値のバリエーションや、シーケンスの深さと品質に応じて mycondrial DNA 分析をコピーします。コピー数の呼び出しの改善により、研究者はヒト初期胚における染色体モザイク化の将来をさらに調査することができます。

semiconductor-sequencing-for-preimplantation-genetic-testing-for

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

この記事では、シングルセルFISH、割球の核の拡散技法、およびin...

着床前遺伝子診断のためのFISH

亜硫酸塩の突然変異誘発は、DNAメチル化を解析するためのゴールドスタンダードです。私たちの変更されたプロトコルは、単一細胞レベルでのDNAメチル化解析を可能にし、特に個々の卵のために設計されました。また、開裂段階の胚に使用することができます。...

単一の卵重亜硫酸塩の突然変異誘発

脳室周囲結節性異 (PNH) は、成人期の皮質発達 (MCD) の奇形の最も一般的な形式が、その遺伝的基盤はほとんど散発的ケースで不明のまま。我々 は最近 MCDs...

脳奇形の原因となる遺伝子を識別するアレイ CGH、全エキソーム配列と齧歯動物の子宮にエレクトロポレーションを組み合わせた新たな戦略

次世代シーケンス (NGS)、プラットフォーム (~0.5–2.0%) の高い誤り率によって制限されるゲノム解析の強力なツールです。NGS のエラーレートを未然に防ぐし、バリアント アレル分 0.0001 のようにまれに突然変異を検出するエラー修正のシーケンスの我々...

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

このプロトコルの目的は、胚を犠牲にすることなく、胃形成中に海アネモネネネメテラステッラベクテンシスを遺伝子入力することです。...

初期開発におけるアネモネのジェノタイピング

本研究は、使用済み培地を使用したヒト胚の染色体スクリーニングのプロトコルを報告し、胚生検を回避し、NGSを使用して染色体倍数性を同定できるようにします。本稿では、培地の調製、全ゲノム増幅(WGA)、次世代シーケンシング(NGS)ライブラリの調製、データ解析など、詳細な手順を紹介します。...

使用済み培地を用いたヒト着床前胚の染色体スクリーニング:サンプル採取と染色体倍数性解析

このプロトコルは、半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォーム上での異数性に対する移植前遺伝子検査に必要なラボ内の全体的な手順を提示します。ここでは、全ゲノム増幅、DNA断片選択、ライブラリ構築、テンプレート調製、シーケンシング作業フローの詳細なステップを代表的な結果とともに紹介します。...

半導体ベースの次世代シーケンシングプラットフォームにおける異数性のための移植前遺伝子検査

このプロトコルは、イオン半導体シーケンシングプラットフォームに基づいて、胃がんサンプルの一塩基多型を検出するために必要な全体的な実験室手順を提案します。ターゲット配列、ライゲーティングアダプター、ライブラリの増幅と精製、および品質管理基準についても詳しく説明します。...

イオン半導体シーケンシングプラットフォームに基づく胃癌における多遺伝子一塩基多型検出

ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。...

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

ここでは、遺伝子欠失効率を改善するためのYarrowia lipolytica...

再生可能バイオ燃料および生化学的生産のための独創的な酵母の遺伝子工学

学ぶ半導体シーケンスによる無呼吸性遺伝子検査法。胚の染色体異常を迅速かつ低コストでスクリーニングし、サンプル受付から報告書発行まで5日間で完了する再現性の高い手法です。

無呼吸性遺伝子検査用半導体シーケンシング

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