Name: キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶCAR-T細胞の抗腫瘍機能評価法。グリオブラストーマ細胞との共培養と反復的腫瘍細胞投与により、T細胞活性化・疲弊・記憶表現型を解析し、CD4とCD8 CAR-T細胞の相互作用を明らかにする。

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この作品は、カリフォルニア州研究所 (CIRM) グラント TR3 05641 NIH 助成金 P30 CA33572 (コア) からの助成金によって支えられました。社殿は、NCI の交わり 1F99CA234923-01 によってサポートされます。

当院では、このプロトコルのレビューは必要ありません。市の希望病理部がコーディングされてから破棄された新鮮な膠芽腫腫瘍サンプルをいただいて、私たちの研究室は、キーへのアクセスを得ることができません。識別データのない、生検・切除の時に前の治療や病気の状態にのみデータを標本をいただいています。
1. メディアの準備
<ol><li>主な糸球体基底膜の細胞を培養するため神経幹細胞メディアの準備: DMEM:F12、1:50 B27、5 μ g/mL ヘパリンと 2 ミリ モル/L L-グルタミン;週 2 回 20 ng/mL 上皮成長因子 (EGF) と 20 ng/mL 塩基性繊維芽細胞成長因子 (FGF) 補われる (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>T 細胞のメディアの準備: 10% 牛胎児血清 (FCS); を含む X VIVO 15(材料の表を参照してください) すべての 48 h 70 IU/mL 以上より 2 と 0.5 ng/mL 以上より 15 を補充しました。</li>
	<li>共培養メディアを準備: EGF と FGF のサプリメントなしメディアを神経幹細胞を取り出して、10% の FCS を追加。</li>
	<li>染色液 (FSS) FACS を準備: HBSS の 2% の FCS ナン3 (0.5 g/500 mL)。</li>
</ol>2. GBM の腫瘍細胞の調製
<ol><li>4 分の 300 × gで遠心分離によって低通過 GBM の腫瘍球 (TSs) を収穫し、上澄みを廃棄します。 注:神経幹細胞メディア、37 ° C で 5% CO2インキュベーター22,23,24を前述のように腫瘍を切除され、GBM の腫瘍から生成される球体 (TSs)</li>
	<li>あらかじめ 37 ° C の水浴の共培養メディアを温めます。</li>
	<li>GBM TSs に冷たい accutase の 1 つの mL を追加、30-60 秒のピペッティングによる TSs を切り離して考えるし、暖かい共同培地 5 mL を追加することで解離を停止します。 注:5 分以上 accutase 上 GBM TSs に保持されませんする必要があります。</li>
	<li>4 分の 300 × gで遠心分離によって糸球体基底膜の細胞を採取、培養上清を破棄し、2 mL の共培養培地で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>細胞生存率のカウンターを使用してセルの濃度を決定します。 注:セル実行可能性がある必要があります > 70%。</li>
</ol>3. 車 T 細胞の作製
<ol><li>試金、前に 24 h 未満流れ cytometry チューブに車 T 細胞の 100 μ L を取るし、FSS の 2 mL を加えます。 注:車 T 細胞は11,21を前述のように生成され、T 細胞培地で培養しました。</li>
	<li>4 分及び破棄上澄みの 300 x gで遠心分離します。</li>
	<li>洗浄セル、300 x gで 4 分間遠心する FSS の 2 mL を追加し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>4 ° c 30 分車式を示す適切な抗体で細胞を染色します。 注:たとえば、IL13Rα2 ターゲットの車が記載されている場合以前25 , アンチ IL13 抗体で染色し、.</li>
	<li>FSS の 2 mL で 2 回洗浄し、フローサイト車 exn を分析します。</li>
	<li>図 1Bに示すようにゲートの戦略を使用して T 細胞に車 % を決定します。</li>
	<li>共培養の日 4 分の 300 × gで遠心分離によってすべての車 T 細胞を収穫、上清を捨てる、2 mL の共培養培地で細胞を再懸濁します。</li>
	<li>細胞生存率のカウンターを使用してセルの濃度を決定します。 注:セル実行可能性がある必要があります > 70%。</li>
</ol>4. 腫瘍を設定-T 細胞共培養
<ol><li>腫瘍細胞共培養メディアで 16 万/mL の濃度に希釈します。</li>
	<li>車 % に基づいて、車 T 細胞共培養メディア 4 万の車+細胞/mL の濃度に希釈します。 注:たとえば、車は 50%、T 細胞濃度が 40 万/mL 4 万車+細胞/mL の最終的な集中を取得する 1:5 希釈を行います。</li>
	<li>96 ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに 100 μ L の希釈した腫瘍細胞のピペットします。</li>
	<li>腫瘍細胞とのミックスを含むを各ウェルに 100 μ L の希釈車 T 細胞のピペットします。 注:4 の時点で各腫瘍 T 細胞共培養を分析します。たびに異なる分析に基づいてポイント 4-6 レプリケートが必要と可能性がありますが、< 時間ポイントごと 3 複製はお勧めできません。代表的な platemap の表 1を参照してください。</li>
	<li>37 ° C、5% CO2インキュベーターでプレートを維持します。</li>
</ol>5. 腫瘍細胞の再投与
注:2、4、6 日後初期培養セットアップ (図 1A) での再投与が行われます。
<ol><li>収穫し、(手順 2.1 2.6) 上記のように GBM TSs を切り離して考えます。</li>
	<li>64 万/mL の濃度で GBM 細胞を再懸濁します。</li>
	<li>再投与を必要とする共培養井戸を決定する (表 1参照)、各ウェルの上から 50 μ L メディアを慎重に取り外します。</li>
	<li>各ウェルに GBM 細胞懸濁液 50 μ L を追加し、ミックスも、プレートを 37 ° C、5% CO2インキュベーターに戻します。</li>
</ol>6. サンプルの収穫し、フローサイトメトリー法による解析
注:サンプルは、1、2、3、4 で、初期培養セットアップ ラウンド腫瘍の挑戦、それぞれ 1、3、5、7 日後に収穫されます。
<ol><li>事前洗浄器 37 ° C で 0.05% トリプシン EDTA 溶液を温めます。</li>
	<li>井戸および収穫を必要とする新しい丸底 96 ウェル プレートにメディアを転送を決定します。</li>
	<li>37 ° C、5 分で残りの腫瘍細胞を消化する井戸にトリプシン-EDTA の 50 μ L をピペットします。</li>
	<li>顕微鏡で細胞を底からデタッチを確認します。</li>
	<li>剥離細胞を再懸濁しますトリプシン-EDTA の丸底 96 ウェル プレート対応する井戸に戸建のセルを含むを転送しても下周りのピペットします。</li>
	<li>遠心分離機 300 × g、4 分の 4 ° C で丸底の 96 ウェル プレート、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>200 μ L/ウェルの細胞, 300 × gで遠心分離, 4 ° C、4 分を洗浄する FSS を追加し、上清を捨てます。</li>
	<li>100 μ L/ウェル FSS 含む抗体 (材料の表を参照してください)、細胞を再懸濁し、4 ° C、30 分で細胞の汚れ。</li>
	<li>300 × g、4 分の 4 ° C で遠心し、破棄上清、セルを 100 μ L/ウェル FSS を追加します。</li>
	<li>200 μ L/ウェルの細胞, 300 × gで遠心分離, 4 ° C、4 分を洗浄する FSS を追加し、上清を捨てます。</li>
	<li>500 ng/ml の DAPI、FSS の 100-200 μ L/ウェルの細胞を再懸濁します、フローサイトメトリーによるサンプルを分析します。</li>
</ol>7. 機能とフェン Otypic 車 T 細胞解析
<ol><li>流れの cytometer からデータ ファイルを取得し、すべてライブ (DAPI) 細胞 (図 1C) をゲートします。</li>
	<li>ゲート、CD45 による腫瘍細胞を定量化する-の人口とゲート、CD45 による車 T 細胞+車 + 人口 (図 1C)。 注:場合は腫瘍細胞は CD45 表現 (例えばらじおリンパ腫細胞) の腫瘍細胞から T 細胞を区別するために使用することができます抗 CD3 染色します。</li>
	<li>腫瘍細胞と車 T 細胞数時間コースをプロットします。</li>
	<li>4-1 bb と CD69 の共発現による T 細胞の活性化を識別します。 注:これらの表面のマーカーは、T 細胞活性化 6 24 h ポスト初期培養を分析する使用できます。</li>
	<li>ティム 3、ラグ 3 PD 1 の式によって T 細胞の枯渇を識別します。</li>
	<li>CD45RO と CD62L の式によって T 細胞メモリ ステータスを識別します。</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+T+cells+persist+and+induce+sustained+remissions+in+relapsed+refractory+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), (2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> The New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>Lee, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+expressing+CD19+chimeric+antigen+receptors+for+acute+lymphoblastic+leukaemia+in+children+and+young+adults%3A+a+phase+1+dose-escalation+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial.</a> The Lancet. 385 (9967), 517-528 (2015).</li>
<li>Yong, C. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR+T-cell+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">CAR T-cell therapy of solid tumors.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (4), 356-363 (2017).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li>
<li>Priceman, S. J., Forman, S. J., Brown, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart+CARs+engineered+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Smart CARs engineered for cancer immunotherapy.</a> Current Opinion in Oncology. 27 (6), 466-474 (2015).</li>
<li>Fesnak, A. D., June, C. H., Levine, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+T+cells%3A+the+promise+and+challenges+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (9), 566-581 (2016).</li>
<li>Esensten, J. H., Bluestone, J. A., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Therapeutic+T+Cells%3A+From+Synthetic+Biology+to+Clinical+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Engineering Therapeutic T Cells: From Synthetic Biology to Clinical Trials.</a> Annual Review of Pathology. 12, 305-330 (2017).</li>
<li>Lim, W. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Principles+of+Engineering+Immune+Cells+to+Treat+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer.</a> Cell. 168 (4), 724-740 (2017).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+IL13Ralpha2-Targeted+Chimeric+Antigen+Receptor+T+Cells+for+Improved+Anti-tumor+Efficacy+against+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of IL13Ralpha2-Targeted Chimeric Antigen Receptor T Cells for Improved Anti-tumor Efficacy against Glioblastoma.</a> Molecular Therapy. , (2017).</li>
<li>Long, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-1BB+costimulation+ameliorates+T+cell+exhaustion+induced+by+tonic+signaling+of+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors.</a> Nature Medicine. 21 (6), 581-590 (2015).</li>
<li>Cherkassky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CAR+T+cells+with+cell-intrinsic+PD-1+checkpoint+blockade+resist+tumor-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human CAR T cells with cell-intrinsic PD-1 checkpoint blockade resist tumor-mediated inhibition.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 3130-3144 (2016).</li>
<li>Priceman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-stimulatory+signaling+determines+tumor+antigen+sensitivity+and+persistence+of+CAR+T+cells+targeting+PSCA%2B+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Co-stimulatory signaling determines tumor antigen sensitivity and persistence of CAR T cells targeting PSCA+ metastatic prostate cancer.</a> Oncoimmunology. 7 (2), 1380764(2018).</li>
<li>Eyquem, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+a+CAR+to+the+TRAC+locus+with+CRISPR%2FCas9+enhances+tumour+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection.</a> Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+full+effector+function+in+vitro+paradoxically+impairs+the+in+vivo+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Acquisition of full effector function in vitro paradoxically impairs the in vivo antitumor efficacy of adoptively transferred CD8+ T cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 115 (6), 1616-1626 (2005).</li>
<li>Malandro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+Abundance+of+Tumor-Specific+CD4%28%2B%29+T+Cells+Potentiates+Efficacy+and+Alters+Susceptibility+to+Exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Clonal Abundance of Tumor-Specific CD4(+) T Cells Potentiates Efficacy and Alters Susceptibility to Exhaustion.</a> Immunity. 44 (1), 179-193 (2016).</li>
<li>Gattinoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+arrests+effector+T+cell+differentiation+and+generates+CD8%2B+memory+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling arrests effector T cell differentiation and generates CD8+ memory stem cells.</a> Nature Medicine. 15 (7), 808-813 (2009).</li>
<li>Klebanoff, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+memory+self%2Ftumor-reactive+CD8%2B+T+cells+confer+superior+antitumor+immunity+compared+with+effector+memory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Central memory self/tumor-reactive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (27), 9571-9576 (2005).</li>
<li>Gattinoni, L., Klebanoff, C. A., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths+to+stemness%3A+building+the+ultimate+antitumour+T+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paths to stemness: building the ultimate antitumour T cell.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (10), 671-684 (2012).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-targeted+CD4%2B+CAR+T+cells+mediate+superior+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-targeted CD4+ CAR T cells mediate superior antitumor activity.</a> JCI Insight. 3 (10), (2018).</li>
<li>Kahlon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+recognition+and+killing+of+glioblastoma+multiforme+by+interleukin+13-zetakine+redirected+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Specific recognition and killing of glioblastoma multiforme by interleukin 13-zetakine redirected cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 64 (24), 9160-9166 (2004).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+killing+of+brain+tumor+stem-like+initiating+cells+by+CD8%2B+cytolytic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Recognition and killing of brain tumor stem-like initiating cells by CD8+ cytolytic T cells.</a> Cancer Research. 69 (23), 8886-8893 (2009).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stem+cells+derived+from+glioblastomas+cultured+in+bFGF+and+EGF+more+closely+mirror+the+phenotype+and+genotype+of+primary+tumors+than+do+serum-cultured+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.</a> Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).</li>
<li>Brown, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+Glioblastoma+after+Chimeric+Antigen+Receptor+T-Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regression of Glioblastoma after Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (26), 2561-2569 (2016).</li>
<li>Salter, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomic+analysis+of+chimeric+antigen+receptor+signaling+reveals+kinetic+and+quantitative+differences+that+affect+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomic analysis of chimeric antigen receptor signaling reveals kinetic and quantitative differences that affect cell function.</a> Science Signaling. 11 (544), (2018).</li>
<li>Rossi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preinfusion+polyfunctional+anti-CD19+chimeric+antigen+receptor+T+cells+are+associated+with+clinical+outcomes+in+NHL%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preinfusion polyfunctional anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells are associated with clinical outcomes in NHL.</a> Blood. 132 (8), 804-814 (2018).</li>
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<li>Fraietta, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+TET2+promotes+the+therapeutic+efficacy+of+CD19-targeted+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of TET2 promotes the therapeutic efficacy of CD19-targeted T cells.</a> Nature. 558 (7709), 307-312 (2018).</li>
</ol>

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この反復的な腫瘍細胞の挑戦アッセイは、生体内で腫瘍モデルに関連付けられている高い腫瘍負荷を繰り返す体外のセットアップを使用して車 T 細胞機能効力を評価するための便利な方法を提供します。この 7 日間の試金中、車 T 細胞腫瘍チャレンジ (初期培養と再投与 x 3) の 4 つのラウンドを受ける疲れ T 細胞が強力な初期応答にもかかわらず腫瘍チャレンジに応答する能力を失う可能性があります環境を作成します。腫瘍細胞の除去と車 T 細胞伸長を表す車の T 細胞の表現型は T 細胞の活性化を示す表面や細胞内のマーカの汚損によって簡単に分析できる一方この分析から得ることができる 2 つの基本的な読み出し疲労やメモリ。この試金はまた車 T 細胞トランスクリプトーム、プロテオームまたは蛍光体プロテオーム21,26,27臨床反応を予測するために採用されている T 細胞 polyfunctionality の非バイアスの分析と結合する便利です。さらに、腫瘍細胞は、サイトカイン分泌28など T 細胞免疫に対する彼らの適応応答のテストもできます。サンプルは、複数の時点で収穫され、以来このアッセイにより静的なだけでなく、車 T 細胞挙動の動的解析のため、腫瘍細胞の過剰な数に応答するとき。
試金はエフェクター効力同じ抗原をターゲット車 T 細胞が異なるデザインの比較および/または製造工程で威力を発揮します。その CD4 を識別するためにこの試金を使用している+車 T 細胞 CD8 より優れた長期的なエフェクター機能を仲介することができた+細胞21。またその生体内での車の有効性はさらに体外トン車電池評価用反復的な腫瘍の課題を使用しての必要性を強調、このアッセイ中後時点 (D5 D7) で細胞毒性と相関を示した。糸球体基底膜細胞が標的細胞をここでの例として使用された、このアッセイは、簡単に異なる T 細胞腫瘍の組み合わせに採用される可能性が。特に、車の T 細胞の挙動は異なる抗原密度と車認識29時に順次分子でき事を調査するためのツールを提供対象となる抗原のさまざまなレベルを表現するためのエンジニア リングのがん細胞にも変更できます。したがって、このアッセイは、異なるターゲットに対して特定の車の T 細胞の活性化パターンを調べるまた悪用できます。
それは実行可能なとすべての共培養を開始する重要なターゲット セル実行可能性と車 T 細胞伸長はこの試金の 2 つの先行読み出しであるので (> 70%)腫瘍と T 細胞。再投与プロセスを実行すると、腫瘍と細胞数の不要な変更を導入することの順序で、井戸の底に T 細胞吸引メディア (手順 5.3) のアクションが邪魔しないでください。懸濁液ターゲット細胞ラインのこの分析を実行すると、腫瘍細胞の再投与前に遠心分離によって残りのセルを収穫する勧めします。
この試金の制限の 1 つは、セットアップ パラメーター (初期培養と再投与の E:T 比率) が異なる車腫瘍の組み合わせに基づいて調整する必要することです。例えば、腫瘍細胞は、免疫抑制分子 (例えば PD L1) のかなりのレベルを表す場合、E:T 比率が高いをお勧め与えられたこと全体的な効率を殺害、障害 PD L1 低腫瘍細胞と比較して。新しい車腫瘍組み合わせにアッセイを適用する前にパイロット研究お勧めします最適条件を決定する最も強力な車 T 細胞除去するために試金のテスト通常ことができます > 終了時点で腫瘍細胞の 80%。腫瘍細胞が蛍光標識なら車を殺す T 細胞を介するため直接細胞接触が必要なので、フローサイトメトリーによる解析のパネルがそれに応じて調整する必要があります (例: 腫瘍細胞が GFP 標識、それから、FITC 結合になら抗体使用しないでください)。
車 T 細胞 B 細胞悪性腫瘍に対しての臨床活動は、2 つの FDA 承認薬につながっています。しかし、応答は、異なる患者27,30,31, 車製品30の表現型特性との相関を解明されたの間で実質的な変動を示しています。この in vitro における反復的な腫瘍の挑戦の試金はさらに機能的表現型特性の測定とサイトカイン産生 polyfunctionality に加えて車エフェクター効力をテストするためのアプローチを提供し、高スループット スクリーニングでは、予測の忠実度を保持したまま体内の腫瘍モデルと比較して臨床的製品。全体的にみて、この試金は、T 細胞機能試験車 T セル設計、前臨床・臨床開発される可能性があります。

キメラ抗原受容体 (車) を用いた免疫療法-設計された T 細胞は、B 細胞悪性腫瘍1,2,3,4, 他の腫瘍を対象の可能性の中から有望な結果を見ています。厳密な調査5,6,7下を続けています。素晴らしい進歩車構築、製造プロセスと患者の事前投与レジメン6,7、8を最適化するためには、合成生物学のアプローチは増加すると予想、永続性、安全性と腫瘍特異性9,10。しかし、難しく、適切な臨床的翻訳のための最良の選択をガイドするために車の T 細胞の治療の可能性を評価するために労働集約的だった。ベアリング車 T 細胞の抗腫瘍効果の検討方法と滴定されたセル用量11,12時に比べてという腫瘍免疫不全マウスにおける車 T 細胞機能を評価するため、これまで最も確立されたモデル,13,14,15. これらの生体内でのマウスの研究は手間と時間がかかり、スクリーニングのパラメーター数が多い場合は特に。さらに、生体内での研究は、マウス系統、動物医療と動物処理技術のアクセシビリティによって拘束することができます。したがって、これらの T 細胞の生体内での抗腫瘍機能も忠実に反映するエフェクター活性の迅速な読み出しを可能にするより便利な試験管内アッセイを開発する必要があります。
T 細胞の生体外の細胞毒性を決定する従来の方法は、脱顆粒反応、サイトカイン産生、放射性同位元素標識標的細胞 (すなわち、クロム リリース試金) を溶解する能力の検出に焦点を当てています。これらの試金は車の T 細胞の特異性とリダイレクトのターゲット認識の定義のために有益、彼らはしばしば改変 T 細胞12,13,16性の生体内で抗腫瘍性を反映するように失敗します。特定のケースで体外を体内の抗腫瘍機能16と逆相関示した短期的アッセイの活動を殺します。このような矛盾は枯渇17になりやすい車 T 細胞製品を区別するために使用これらの生体外の試金、従ってことができない高いエフェクター: 目標 (E:T) 率の結果が。対照的に、in vivo がん撲滅 T の間に細胞は通常対応により、複数回殺し、その後 T 細胞分化と枯渇18,19,を運転の大きな腫瘍負荷に対して20トン車による効果的な腫瘍クリアランスに対する主要な障壁の 1 つである細胞12,13です。一方、臨床反応4車 T 細胞治療患者における車 T セル拡張容量の相関が強いに対し、最も短期の in vitro における殺害アッセイまた T 細胞増殖における読み出し差分ではないを行います。したがって、適切な in vitro アッセイは T 細胞の枯渇の誘導高い腫瘍負荷の条件を要約する必要があります、T 細胞伸長の読み出しが可能になります。
ここで反復的な腫瘍の可能性について、簡単な生体外の培養アッセイを殺す車 T 細胞を評価するための戦略について述べる。異なる T 細胞エフェクター アクティビティのパラメーターは、ターゲット セル殺害、車 T セル拡張メモリまたは枯渇関連など、同時に検査することが。この分析から生成された結果は、車 T 細胞の生体内での抗腫瘍効果との相関し、車 T 細胞製品の効力を評価するために悪用することができます。プライマリ GBM 行21に対して IL13Ra2 対象車 T 細胞を評価する試金を記述する中、は、あらゆる車の T 携帯プラットフォームに容易に適合できます。

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin/0.53mM EDTA in HBSS without Calcium and Magnesium</td><td>Corning</td><td>MT25051CI</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Irvine Scientific</td><td>9319</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Cambrex Bio Science</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩 (DAPI) - FluoroPure grade</td><td>Invitrogen</td><td>D21490</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Aldesleukin Proleukin (rhIL-2)</td><td>Novartis Oncology</td><td>NDC 0078-0495-61</td><td></td></tr><tr><td>抗CD137、PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555956</td><td>4B4-1</td></tr><tr><td>抗CD19、PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557835</td><td>SJ25C1</td></tr><tr><td>抗CD3、PERCP</td><td>BD Biosciences</td><td>340663</td><td>SK7</td></tr><tr><td>抗CD4、FITC</td><td>BDバイオサイエンス340133</td><td></td><td>SK3</td></tr><tr><td>抗CD45、PERCP</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>340665</td><td>2D1</td></tr><tr><td>抗CD45RO、PE</td><td>BD Biosciences</td><td>561137</td><td>UCHL1</td></tr><tr><td>抗CD62L、APC</td><td>BD Biosciences</td><td>559772</td><td>DREG-56</td></tr><tr><td>抗CD69、APC</td><td>BD Biosciences</td><td>340560</td><td>L78</td></tr>抗<tr><td>CD8、APC-Cy7</td><td>BDバイオサイエンス348793</td><td></td><td>SK1</td></tr><tr><td>Anti-IL-13, PE</td><td>BD Biosciences</td><td>340508</td><td>JES10-5A2</td></tr><tr><td>Anti-LAG-3, PE</td><td>eBiosciences</td><td>12-2239-41</td><td>3DS223H</td></tr><tr><td>Anti-PD-1, APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>329921</td><td>EH12.2H7</td></tr><tr><td>Anti-TIM-3, APC</td><td>eBiosciences</td><td>17-3109-42</td><td>F38-2E2</td></tr><tr><td>B-27 Serum-Free Supplement (50x)</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 Well Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile (Product #3596)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine serum,HI IR</td><td>Hyclone Labs</td><td>SH30070.03IH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 50:50 (1x) Glutamine</td><td>MediaTech, Inc.</td> なし<td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Gluc w/o L-Glu, Na Pyr 1 L</td><td>Invitrogen 11960051</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Ham's F12 50:50 L-グルタミンと 15 mM HEPES の混合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10092CV</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Irvine Scientific</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Heat-Inactivated FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium(1,000 U/mL)</td><td>アメリカ医薬品</td><td>401811B</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant</td><td>ミルテニ・バイオテック株式会社</td><td>BIS013220&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x W / CAとMG</td><td>Irvine Scientific</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>PBS、1 mM EDTA(Ca2+またはMg2+なし)</td><td>VWR Scientific Products</td><td>PB15009A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human EGF</td><td>R&D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトFGF</td><td>R&D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>rhIL-15 作業希釈 (10 ng/&micro;L)</td><td>CellGenix, US Operations</td><td>tF0297</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R</td><td></td><td></td> Thermo Scientific 41693700 <td></td></tr><tr><td>TC-HEPES BUFFER (1 M) SOLN 100ML&nbsp;</td><td>IRVINE SCIENTIFIC CORP</td><td>6472</td><td></td></tr><tr><td>Tecnol Procedure Mask</td><td>Kimberly-Clark</td><td>47117</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15</td><td>ロンザ</td><td>BW04-744Q</td><td></td></tr></tbody></table>

キメラ抗原受容体の t 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

キメラ抗原受容体 (車) T 細胞療法の分野を改善車設計、遺伝子工学的アプローチおよび製造の最適化を進めます。しかし、これらの開発努力のための 1 つの課題はしっかり体内治療成功のための最適な車 T 細胞製品の選択を知らせることができる試験管内アッセイの確立をされています。標準的な体外腫瘍溶解アッセイは、比較的短い培養時間と腫瘍比高の T 細胞による車の T 細胞の本当の抗腫瘍性潜在性を反映するようにしばしば失敗します。ここでは、高い腫瘍のセルの負荷の可能性を殺す車 T 細胞再帰を評価する体外培養法について述べる。この試金、長期的な細胞傷害性機能車 T 細胞の増殖能力が検討体外 7 日間培養一日おきに投与追加腫瘍ターゲットを持つ。この試金プロファイリングの T 細胞の活性化、疲労、メモリ表現型と組み合わせて利用できます。この試金を使用して、我々 は正常に CD4 の機能と表現型の違いを区別して+および CD8 神経膠芽腫に対する+車 T 細胞 (GBM) 細胞、同所性同種でその差分生体内で抗腫瘍活性を反映して異種移植モデル。このメソッドは、車の T 細胞の効力を評価するために、車の T 細胞の異なる製品間での機能のバリエーションを明らかにする安易なアプローチを提供します。

上記の試金を使用して、差分エフェクター効力を識別していくと CD4 を介したダイナミクスを殺す+および CD8+車 T 細胞。ここで示された結果は、CD4 の違いを示す+および CD8+車 T 私たちの以前の文書21の独立した健康なドナーから生成された細胞。
標準脱顆粒試験を通して観察すること両方ができた CD4+および CD8+車 T CD107a と細胞内サイトカインの発現によって示されるように細胞になった標的抗原を発現する GBM 細胞に対して均等に活性化(図 2A)。しかし、反復的な腫瘍の挑戦の試金を使用して、分かった CD4+ない CD8 が+車 T 細胞が複数ラウンド殺害 (図 2B) の能力を展示します。CD4+車 T 細胞もこの試金 (図 2C) 中に cd8 陽性細胞と比較して達成良い展開。車の T 細胞サブセット間の拡張の違いのみ観察された D3 から腫瘍の挑戦 (1時 12分 E:T) の 2 つのラウンド後腫瘍の挑戦 (1時 20分 E:T) の 3 つのラウンド後の D5 から始まって、ことを示す細胞毒性の差は認め短期的な試金は車 T 細胞の異なる製品の効力の違いを解明できませんでした。CD4 を 1:1 で混合するとき+および CD8+車 T 細胞は、この試金に適用された、彼らは CD8 をアウトパ フォームする発見された+ない CD4 が+車 T 細胞に対して長期的な細胞毒性 (図 2B)。CD8 の拡大+車 T 細胞による共同応用 CD4 一方 CD4、+の細胞 CD8 の存在下で+車 T 細胞増殖は抑制された+細胞 (図 2C)。
CD4 間エフェクター活性を区別するメカニズムを説明する+および CD8+車 T 細胞、我々 はまず確認の頭文字の後その 24 h 共培養、CD4+および CD8+車 T 細胞が比較的活性 (図 3 A)。一方、CD45RO と CD62L 式、両方の CD4 によって示される+および CD8+車 T 細胞は中央のメモリからの転移を示した (CD45RO+、CD62L+) エフェクター メモリーに (CD45RO+、CD62L-) 表現型反復的な腫瘍の挑戦 (図 3B)。我々 は、このアッセイの D3 のセルを特徴とし、車の T 細胞サブセットの機能的な違いを表示する開始前に時間。T 細胞の枯渇は抑制性受容体 PD-1、3-ラグとティム 315、21、示したの共発現によって示されたその CD8+車 T 細胞が CD4 と比較して疲労困憊になりやすい+車 T 細胞 (図 3C). さらに、差は認められなかった CD8 に+共同応用 CD4 の有無で車 T 細胞枯渇+細胞 (図 3C) を示すその cd4 陽性誘導 CD8+車 T 細胞の拡大ではないです。良いエフェクター機能に関連付けられています。
一緒に、このアッセイの結果識別 cd4 陽性+車の T 細胞には敵わなかった CD8+は具体的に長期的な細胞毒性細胞します。同じような短期的な細胞毒性 (1-3 日、一度 rechallenged) CD4 にもかかわらず+車 T 細胞 CD8 中の反復的な腫瘍挑戦時に持続的なエフェクター機能+細胞なり疲れ、腫瘍細胞の増殖を制御するために失敗しました。2 つのサブセットに混合された、CD4+車 T 細胞 CD8 の拡張を促進した+車 T 細胞、CD8 の枯渇状態が+セルいない、2 つのグループ間の相乗効果の欠如の結果軽減されました。CD4 の同様の違い+および CD8+車 T 細胞は生体内でモデルで前述21と見られていた。確かに、CD8+車 T 細胞抗原陽性再発; 後、短期的な腫瘍クリアランスを仲介することができました対照的に、CD4+車 T 細胞治療は、長期的な腫瘍の撲滅21, 再投与の in vitro アッセイを用いた繰り返し殺害潜在性を思い浮ばせるであります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig1.jpg"> 図 1: 繰り返し挑戦アッセイのスキーマと分析戦略。(A) スキーマおよび反復的な腫瘍の挑戦アッセイのタイムライン。各ウェル車 T 細胞で最初共同 PBT030 2 GBM 細胞 (4,000 車 + 細胞、16,000 の腫瘍細胞) の培養、32,000 の腫瘍細胞 (D2、D4 と D6) 一日おき再挑戦します。腫瘍細胞車 T 細胞数と車の T 細胞の表現型の分析は、D1、D3, D5 と D7 で実施します。(B) 共同文化を設定する前に細胞のゲーティング T 車 % を決定する戦略です。(C) 反復課題分析から生きた細胞、腫瘍細胞と T 車の戦略をゲートします。(D) 腫瘍細胞数の untransduced の T 細胞と共培養の再投与法の異なった時に。誤差 = ±SEM.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig2.jpg"> 図 2: 反復的な挑戦のアッセイは、CD4 の殺害と増殖能の違いを明らかにする+および CD8+車 T セル。(A) 脱顆粒や細胞内サイトカイン染色 CD4+および CD8+車 T 細胞 GBM 細胞との共培養の 5 時間後 (E:T = 1:1)。(B) CD4+、CD8+または混合 (CD4:CD8 = 1:1) 反復的な課題分析に適用された車 T 細胞と腫瘍細胞の定量を行った。p &lt; 0.05 * *p &lt; 0.01 * * * CD4 と比較してp &lt; 0.001+、一方向の分散分析を用いたボンフェローニの多重比較法。(C) CD4+および CD8+反復的な腫瘍の挑戦アッセイ中車 T 細胞伸長。(左右から) の比較 CD4+ vs CD8+、1 つのサブセット。CD4+ vs CD8+、「混合」グループ内CD4+、単一の対の混合;CD8+、単一の対の混合します。p &lt; 0.05 * *p &lt; 0.01 * * *p &lt; 0.001 独立スチューデントのt検定を使用します。誤差 = ±SEM.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59275/59275fig3.jpg"> 図 3: 反復課題分析中に T 細胞表現型の分析。(A) 4-1 bb と CD69 アッセイの D1 で車 T 細胞に染色します。(B) CD45RO CD62L 染色と車 T 細胞の試金 (入力) を再投与時に適用する前に、D3、アッセイの D7。(C) 共発現の PD-1、3-ラグとティム-3 車 T 細胞アッセイの D3 で。(Top)1、2 または 3 の抑制性受容体を発現する T 細胞を識別するための戦略をゲートします。(下)比較: CD4+セル (単一のサブセット)、CD8+セル (単一のサブセット)、CD8 細胞 (「混合」のグループ) 内の+ 。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59275/59275fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/59275/59275table1.jpg"> 再投与セットアップの表 1: 代表的なプレート マップ。

ここでは、抗腫瘍 T 細胞の活動の表現型および機能解析を可能にする T 細胞を腫瘍をターゲットとした再帰的に挑戦、体外培養法について述べる。

キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

このプロトコルは、反復的な腫瘍細胞チャレンジを介して、キメラ抗原受容体、またはCAR T細胞の評価のための長期の、インビトロ、機能的な方法を提供する。この技術は、真の抗腫瘍効果の正確な表現を達成しながら、インビボCAR T細胞機能評価よりも時間がかかり、労働集約的ではない。このインビトロ技術は、CAR T細胞抗腫瘍力の高スループットスクリーニングおよび分化を可能にする。これは、CAR T細胞製品の臨床的有効性を評価するための潜在的なアプリケーションを有する。神経膠芽腫腫瘍球を神経膠芽腫腫瘍球培養から解離することから始める。冷たいアキュターゼの1ミリリットル、およびピペットの30〜60秒で。腫瘍球が破壊されたら、5ミリリットルの温かい共培養培地で反応を止める。そして遠心分離による腫瘍細胞懸濁液をペレット化する。神経膠芽腫細胞を、新鮮なコ培養培地濃度のミリリットル当たり1.6倍から5番目の腫瘍細胞に再懸濁し、CAR T細胞培養から採取したT細胞を、共培養培地濃度のミリリットル当たり適切な割合のCAR陽性T細胞に希釈した。次に、96ウェルフラットボトム組織培養プレートの各ウェルに希釈腫瘍細胞の100マイクロリットルを加える。そして、100マイクロリットルのCAR T細胞を、穏やかな混合を伴う腫瘍細胞の各ウェルに入る。その後、プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素インキュベーターに入れる。培養の2日目、4日目、および6日目に、腫瘍細胞の各ウェルから50マイクロリットルの培地を慎重に除去し、T細胞共培養プレートは表に従って再挑戦を予定している。次いで、50マイクロリットルの新鮮な神経膠芽腫細胞懸濁液を加え、ちょうど実証したように調製したが、初期共培養の細胞数を2倍にして穏やかな混合を行う。そして、細胞培養インキュベーターにプレートを戻す。1日目、3日目、5日目、7日目の共培養は、表に従って新しい96ウェルラウンドボトムプレートに収穫される各ウェルから上澄み物を移し、50マイクロリットルのプリウォームド0.5%トリプシンEDTAを各培地によく枯渇させた。摂氏37度で5分後、軽い顕微鏡検査で各ウェルの底から細胞が剥離していることを確認し、各ウェルの底部の周りに酵素溶液を穏やかにピペットして細胞を再懸濁させる。取り外された細胞懸濁液を新しい96ウェルプレートの適切な対応する井戸に移す前に。ペレット細胞を遠心分離により、200マイクロリットルの蛍光を用いて細胞を活性化し、細胞選別放置溶液、またはFFS当たり2回目の遠心分離で洗浄する。100マイクロリットルの目的の抗体カクテルを1ウェルあたり100マイクロリットルのSSSで100マイクロリットルでペレットを再懸濁し、摂氏4度で30分のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりは、逐次100および200マイクロリットルFSSの水解によって任意の非結合抗体を除去し、DAPI核染色およびFSSの100〜200マイクロリットルで細胞を再中断する。次に、標準的なフローサイトメトリック解析プロトコルに従って細胞を解析する。腫瘍細胞共培養後のCAR T細胞の機能的およびフェノティピック分析のために、フローサイトメーターからデータファイルを取得し、生きたDAPI陰性細胞のすべてをゲートする。腫瘍細胞を定量化するには、CD45陰性集団をゲートする。CAR T細胞を定量化するために、CD45陽性CAR陽性集団をゲートする。次に、実験の経時に腫瘍およびCAR T細胞数をプロットし、41BB、およびCD69の共発現によりT細胞活性化を同定する。T細胞は、PD1、LAG3、TIM3、T細胞記憶状態LAG3、およびTIM3、CD45ROによるT細胞記憶状態、およびCD62リガンド発現によるT細胞の枯渇を示す。CD45RO、およびCD62リガンド発現によって。CD4陽性、およびCD8陽性CART細胞は共に、CD107aおよび細胞内サイトカイン発現によって示されるように標的抗原を発現する神経膠芽腫細胞に対して等しく活性化される。しかし、反復性腫瘍チャレンジSA、CD4陽性、CD8陽性ではなく、CAR T細胞によって評価されるように、CAR T細胞は複数のラウンド殺傷が可能である。CD4陽性CAR T細胞はまたより強い拡大を達成する。CD4陽性、およびCD8陽性CAR T細胞が1対1の比率で混合されると、この細胞組み合わせはCD8陽性を行うが、CD4陽性CAR T細胞は長期細胞傷害性の点で行わない。また、CD4陽性T細胞の添加によりCD8陽性CART細胞の増殖が誘導される。CD4陽性CAR T細胞の増殖はCDa陽性細胞の存在下で阻害される。最初の共培養の24時間後に、CD4陽性およびCD8陽性CAR T細胞の両方が同様に活性化される。繰り返し腫瘍チャレンジ中、CD4陽性およびCD8陽性CAR T細胞の両方がCD45RO陽性、CD62リガン陽性中央記憶表現型からCD45RO陽性CD62リガンネガティブエフェクター記憶表現型への移行を示す。CD8陽性CAR T細胞はまた、3日間の共培養後にPD1、LAG3、TIM3発現によって評価されるCD4陽性CAR T細胞に比べて疲労を起こしやすい。また、CD4陽性T細胞の存在下または存在の有無においてCDa陽性CAR T細胞の枯渇に見られる違いはなく、CD4誘導CD8陽性CAR T細胞拡張が、より良いエフェクター機能と関連していないことを示す。このエッセイは、T細胞を並べ替えて共培養を行い、トランスクリプトム、プロテオミクス、および関心のある特定の遺伝子に対してさらなる分析を行うこともできる。この繰り返しの腫瘍チャレンジは、CAR T細胞腫瘍認識後の生物学的事象を調査するためのプラットフォームとしても使用できる。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、腫瘍細胞負荷が高い場合のCAR-T細胞の反復腫瘍死滅の可能性を評価するための反復腫瘍チャレンジアッセイを実演します。さらに、CAR-T細胞をフローサイトメトリーを使用して分析し、サンプル中のCAR-T細胞のさまざまな亜集団を決定することができます。...

Repetitive Tumor Challenge Assay:キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の反復腫瘍死傷能を評価するためのIn vitro培養アッセイ

このビデオは、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞をex...

キメラ抗原受容体T細胞を作製するex vivo技術

このビデオは、腫瘍抗原特異的キメラ抗原受容体(CAR)T細胞のex...

腫瘍特異的キメラ抗原受容体T細胞を作製するためのex vivo技術

このビデオは、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞の活性を検証するためのin vitroアッセイを示しています。CD19抗原を発現するB細胞リンパ腫細胞および細胞質ルシフェラーゼをCD19特異的CAR-T細胞と共培養します。CARが腫瘍上のCD19に結合すると、CAR...

腫瘍特異的CAR-T細胞の抗腫瘍活性を評価するためのin vitroアッセイ

液体および固形腫瘍細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞の効力を評価する定量的なインビトロ細胞質アッセイシステムを説明する。このプロトコルは、他の免疫エフェクター細胞、ならびに組み合わせ治療を評価するために拡張することができる。...

固体および造形癌細胞を標的とするキメラ抗原受容体T細胞のリアルタイム効力アッセイ

このプロトコルは、正形外科膵腫瘍の外科的生成と、新たに単離されたマウス膵腫瘍の急速な消化について説明する。消化後、生存可能な免疫細胞集団は、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン検出のためのT細胞のex生体内刺激を含むさらなる下流分析に使用することができる。...

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

ここでは、急性リンパ芽球性白血病患者由来の異種移植片モデルを、CD19標的キメラ抗原受容体T細胞関連毒性を評価および監視するための戦略として使用するプロトコルについて説明します。...

急性リンパ芽球性白血病患者由来異種移植マウスモデルを用いたキメラ抗原受容体T細胞関連毒性の評価

単一の腫瘍の抗原を目標とするキメラ抗原の受容器(CAR)を表現するJurkatのセルによって量的な腫瘍の細胞の殺害を評価するプロトコル。このプロトコルは末梢血得られたT細胞の確認の前にCARの蝶番の構造の急速な最適化のためのスクリーニングのプラットホームとして使用することができる。...

蛍光イメージングを用いたキメラ抗原受容体を発現するJurkatの迅速 in vitro 細胞毒性評価

ここでは、1つのT細胞とがん標的細胞を内包したダブルエマルジョン液滴を作製し、細胞死を1細胞レベルで調べる方法について述べる。この方法により、大規模なT細胞集団内の細胞傷害性分子と標的細胞のアポトーシスの両方を二重に定量できます。...

キメラ抗原受容体T細胞を単一細胞レベルで評価するための液滴ベースの細胞毒性アッセイ

このプロトコルは、回復し、単一細胞レベルの分子遺伝学的解析の非対象の背景セルの混合物から珍しいターゲット セルを準備することです。DNA の品質は非処理の単一細胞であるし、により、単一セルに適用 (両方のスクリーニング...

単一のセル下流解析のターゲット細胞前濃縮と全体のゲノム増幅

学ぶCAR-T細胞の抗腫瘍機能評価法。グリオブラストーマ細胞との共培養と反復的腫瘍細胞投与により、T細胞活性化・疲弊・記憶表現型を解析し、CD4とCD8 CAR-T細胞の相互作用を明らかにする。

キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

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