Name: そのまま線虫の酸素消費量の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶ 線虫Caenorhabditis elegansの酸素消費量測定法。ミトコンドリア機能を生きた状態で評価し、遺伝変異がミトコンドリア健康に与える影響を解明する実験プロトコルです。

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著者は、ラボでタツノオトシゴ XFp の確立に彼の指導の博士ケビン Bittman を認めたいと思います。健康の国民の協会は、GM088213 はこの仕事を支えたを付与します。

注:図 2は、完全なプロトコルの図式的な概観を提供します。
1. 成長と線虫密度9,10の同期
<ol><li>必要な遺伝的背景の L4 幼虫を転送 (例えば、N2 [野生] および sel 12 動物) 線虫成長メディア (NGM) 板 (レシピの表 1を参照) を新鮮な芝生の大腸菌(OP50)11のシードに。各緊張に少なくとも 2 つの 100 mm または 3 つの 60 mm プレートを使用します。3-4 日のため、またはプレートに卵や妊娠ワームの数が多いと集中しているまでは、適切な成長温度 (15-25 ° C) の間にワームを孵化させなさい。</li>
	<li>卵と約 6 mL の M9 のバッファーを使用して皿のワームを洗う (レシピの表 1を参照) 線虫、伝達の 100 mm プレートあたりには各緊張に個々 の 15 mL 遠沈管にパスツール ピペットをガラスします。X g と動物の卵のペレットだけを保持、M9 バッファーを吸引 6,180 3 分のこれらの管をスピンダウンします。</li>
	<li>漂白剤溶液の 3-4 mL を追加 (レシピの表 1を参照) 各管と断続的に各管を埋めると 1 分 6,180 x g でスピンし、上清を吸引 6 分追加 M9 バッファーの渦に。M9 でこの洗浄を 3 回繰り返すし、卵ペレットを約 9 mL の M9 のバッファーを含む新しい 15 mL チューブに移動します。</li>
	<li>1.5 分 6,180 x g でダウンならびに 16-48 スピンのための 20 の ° c によってふ化ワームこれらのチューブを同期し、NGM ウエディング OP50 の芝生と新鮮なシード同期 L1 動物を置く (板 100 mm につき約 6,000-10,000 動物)20 ° C で</li>
	<li>これらの動物は L4 仔稚魚期 〜 42 h 後に達する。この時点で OP50 にプラチナ ピックを使用して L4 幼虫シード NGM 移動プレート 0.5 mg/mL 5-フルオロ-2'-デオキシウリジン (FUdR) の子孫の生産からそれらを防ぐために。 注: 実験の内で、すべての株が時間の同量のため同期を確認します。FUdR 治療は動物を殺菌し、OCR に影響を与えることができる卵を敷設し、子孫生産を防ぐことができます。これらの滅菌動物試金のための次の日 (1 日目 〜 66 h で大人動物) を分析します。FUdR は、生理学と特定の突然変異体のワームの寿命に影響する報告されています。したがって、これは殺菌12,13,14に薬を使用する場合を考慮した取られるべき。ワームには、fem-1(hc17) や fem-3(e2006) などの突然変異の女性化を妨害する手段も滅菌できること。ただし、これらの突然変異は、ミトコンドリアの機能を影響可能性があります。</li>
</ol>2. 注入する化合物と水和反応プローブの準備
注: 試金の実行中に、線虫の両方の基底と最大呼吸速度が測定されます。ミトコンドリアの膜電位を妨げる連結を解くイオノフォアとこうしてプロトンを輸送することによって ATP 合成カルボニル シアン化物-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP) の添加によって動物で最大呼吸が起動されます。ミトコンドリア膜プロトン ポンプ、しながら電子伝達と酸素消費量4,15を続行する非 ATP 合成 (図 1) から。分析の最後の手順は、アジ化ナトリウム (NaN3) の付加を含む複合体 IV および V 非ミトコンドリア呼吸16 (図 1) を決定すること等を阻害する薬。次の手順は、実際の試金実行の前日を実行できます。
<ol><li>1 mL、FCCP の貯蔵液の準備 (ジメチルスルホキシド [DMSO] 10 mM: 最終的な試験濃度 x 1000) ナン3 (dH2o: 10 最終測定濃度 x 400 mM) と-20 ° C でストア 注: は、FCCP の濃度を最適化する濃度曲線は各計測器と実験室の設定の最大の OCR の応答を引き出すために必要なを実行します。</li>
	<li>センサー プローブが dH2O および室温で一晩保管に浸漬を確保すること、プレートの各ウェル (と周辺の貯水池) に dH2O の 200 μ L を追加することによってセンサー カートリッジをメタンハイド レートします。 注: 最大 72 時間浸漬プローブを残すことができるカートリッジが長期水和の場合プレート パラフィン フィルムで包まれるべきであるし、4 ° C で保存一晩水分補給できない場合センサー カートリッジは分析する前に、少なくとも 4 時間のため水和する必要があります。</li>
	<li>計インターフェイス内の発熱を切り、一晩に動物の試金の実行中の過熱を防ぐために装置内のより低いコア温度 15 ° C インキュベーター内部機器を格納します。 注: 工場加熱要素が装備が冷却することはできません。15 ° C の定温器内呼吸度計c. の elegansメンテナンスのため健康的な温度では 18-22 ° C 間の安定した温度でお越し。</li>
</ol>3. 医薬品の読み込みとカートリッジの平衡
<ol><li>ピペットのうち、dH2水和物のセンサーに使用される O プローブおよび calibrant 溶液 (pH 7.4) 各ウェルの 200 μ L で交換を破棄します。100 μ M FCCP dH2O に FCCP 原液を希釈し、センサー カートリッジの注入ポート a の希釈液 20 μ L を追加します。セニョール カートリッジのポート B に 400 mM アジ化ナトリウムの 22 μ L を追加します。</li>
	<li>呼吸度計をオンしてホーム画面を選択する開始にテンプレート ページが表示されます。[テンプレート] ページで、空白または以前にデザインされたテンプレートを選択します。グループのページが表示されます。[グループ] ページで、背景の井戸と井戸 A と H を選択し、実験計画に従って、適切なグループに残り 6 井戸を割り当てます。</li>
	<li>プロトコルのページに移動する右下隅の矢印を押してください。[プロトコル] ページで、 Equilibrate、基底と注射の 1 と 2のボタンが選択されていることを確認します。このページで (後で注入 1 FCCP) 最大 OCR と同様、基底の OCR の測定値の数と非ミトコンドリア調整 (アジ化ナトリウム投与 2) 後 OCR。 注: 各測定の組合せによって前し、待機のステップと、これらのパラメーターの時間枠を表 2に示します。</li>
	<li>右下隅にある矢印を選択し、センサー カートリッジ プレートをロードするプロンプトが表示されます。アラーム入力画面の指示に従って、正しい方向にセンサー カートリッジ プレートがロードされていることを確認します。呼吸度計は今カートリッジを平衡させ。 注: この平衡セル板の適切な井戸に試金するのに動物を配置する十分な時間を提供します。</li>
</ol>4. ワーム プレートと試験の準備を実行します。
<ol><li>各細胞の版 8 の井戸のと周囲の井戸貯水池に M9 バッファーの 200 μ L を追加します。</li>
	<li>シードされていない NGM プレートの上に各株から 100 ~ ワームをピックアップし、M9 バッファーと 2-3 分ウェット プラチナ選択の最後の残りの部分し、井戸 B G、A と H のバック グラウンド井戸を空のままに 20 歳同期動物を選択できるように。 注: 読み込み後それぞれ、待って約 2 分、ウェルの底に解決する動物を許可します。ワーム数曲線がワームも各楽器と実験室の設定の数を最適化するために実行することをお勧めします。</li>
	<li>今では、呼吸度計を校正する必要があります、画面に[ok]をクリックすると、校正バッファーを含むプレートを取り出して、内部センサー カートリッジ滞在中、呼吸から削除できます。動物を含むプレート calibrant プレートを交換してください。プレートを読み込む続行を押すことでドアを閉めるし、実行する分析を許可します。</li>
</ol>5. 後実験データ解析
<ol><li>試金の実行が完了すると、画面上の指示に従ってセル板を外し、センサー カートリッジと .war 形式で実行のデータを保存する USB ポートにフラッシュ ドライブを挿入します。センサー カートリッジを取り外し、約 2 分置く解剖顕微鏡ステレオの下のセル版の井戸の底に沈殿し、井戸ごとのペット数を数える動物を許可します。</li>
	<li>コンピューターで解析ソフトウェアを開き、動物数に OCR を正規化する正規化] タブを開きます。[修正] タブのさまざまなグループでの適切なラベルを適用し、さらなる分析のためのプリズム ファイルとしてファイルをエクスポートします。 注: FCCP の付加である基底の OCR、FCCP 追加は最大の OCR 後の 5 つの測定値の平均、前に最初の 5 つの測定の平均と (最低 2 つの測定を行なうべき) 最後の 5 つの測定値の平均ナトリウムのアジ化物添加非ミトコンドリア呼吸後です。アッセイは、再現性を確保するため 3 回繰り返す必要があります。</li>
</ol>

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<li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12%2C+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer%27s+disease+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li>
<li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+Ca2%2B+in+the+regulation+of+cellular+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ミトコンドリアの呼吸はミトコンドリア機能; の洞察力に富んだインジケーターです。したがって、体外か体内かどうか生物学的システムの酸素消費量を測定することは非常に貴重です。Respirometers 酸素または酸素分圧に比例した流れ電気の世代に依存する電流検出型酸素センサーを介して取得急冷したポルフィリンの蛍光体を使用して酸素レベルを感じる。クラーク電極は後者のカテゴリに分類、特に線虫の呼吸を分析しながら、文学で広範囲に使用されています。しかし、大規模なサンプル サイズと一度に 1 つ以上のサンプルを評価することができないことの必要性は非効率的にアンペロ メトリックの酸素センサーをなります。
このプロトコルは、ミトコンドリア、ミトコンドリア膜電位に影響を与える可能性があるプロセスになり、OCR を孤立させることがなくライブ、そのままc. の elegansの OCR を測定する簡単なガイドを提供します。考えると動物は、様々 なライフ ステージによって異なる OCR を展示、このプロトコルで使用される動物は時代の同期をする必要があります。若い動物があ...

アデノシン三リン酸塩 (ATP)、細胞のエネルギーの主要なソースは、ミトコンドリアの電子輸送鎖 (ETC) 内のミトコンドリアの膜にある酵素によって生成されます。ピルビン酸は、ミトコンドリアの ATP の生産に利用されている主要代謝物は、ベタニン脱炭酸アセチル補酵素 A (CoA) を生成する、ミトコンドリア マトリックスにインポートされます。その後、アセチル CoA はクエン酸ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) キー電子キャリア分子の生成に終ってを入力します。NADH から電子が酸素に ETC 経由で渡されるとき、プロトンは膜間で電気化学的勾配の世代で結果ミトコンドリアの膜間スペースに蓄積します。これらのプロトンは、ATP 合成酵素、ATP1 (図 1) の合成とその回転を運転のプロトン通過孔を介してミトコンドリア マトリックスに戻って、この電気化学的勾配にわたって膜間腔からフローさせます。
ミトコンドリアの機能はエネルギー生産に限定されていませんがカルシウムの恒常性、活性酸素種 (ROS) 清掃、アポトーシス、個体の健康2に批判的に位置決めの機能に重要なも。ミトコンドリアの機能は、様々 なアッセイ、ミトコンドリアの膜電位を測定解析、ATP と ROS レベル、およびミトコンドリアのカルシウム濃度に限らずを使用して評価できます。ただし、これらの試金はミトコンドリア機能の単一のスナップショットを提供する、したがってミトコンドリア健康の包括的なビューを提供可能性があります。ATP の生成中に酸素消費量は逐次反応の無数に依存して、のでそれはミトコンドリア機能の優れた指標として役立ちます。興味深いことに、ミトコンドリア機能障害3,4、5の結果として酸素消費量の変化が観察されています。
2 つのグループに大別することができます技術を使用して生体試料の酸素消費量 (OCR) を測定することができます: アンペロ メトリック酸素センサー、酸素6で急冷することができますしたポルフィリンの蛍光体。電流検出型酸素センサーは、メジャー OCR 培養細胞、組織、や線虫などのモデル システムに広く使用されています。ただし、respirometers を含むポルフィリンを用いた蛍光体は、次の利点を所有している: (1) 彼らは、3 通、2 つのサンプルの横に並べて比較 (2) 彼らが必要なサンプル サイズを小さく (など 〜 2、000−5、対ウェルあたり 20 ワーム 000 ワーム、商工会議所)7、および (3) 呼吸度計をプログラムすることで 4 つの異なる化合物注射を行う目的の手動でのアプリケーションの必要性を除去する実験の実行の時刻。
このプロトコルではライブ、そのままc. の elegansのメジャー OCR にポルフィリンを用いた酸素センサー計の使用に関連する手順が記述されていた.大判、高スループット計8の使用のための書かれたプロトコルがこのプロトコル詳細予算友好的、アクセスと小さくスケール計測器で使用するために対応しています。このプロトコルは、2 株が高スループット スクリーニングは必須ではありませんあり、その使用が過度の OCR の違いを評価する場合に特に便利です。

<table><tbody><tr><td>100 mm、60 mm ペトリ皿</td><td>Kord-Valmark Labware 製品</td><td>2900、2901</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 遠心分離管</td><td>Globe Scientific</td><td>6285</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 &times; 22 mm カバーガラス</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-10</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐管</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD、バクト</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>バクトトリプトン</td><td>BD、バクト</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>バクト酵母抽出</td><td>物BD、バクト</td><td>212705</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>ジェネリック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物(CaCl2&middot;2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>シアン化カルボニル 4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン (FCCP)</td><td>Abcam</td><td>ab120081</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Fisher Scientific</td><td>C314-500</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水 (dH2O)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C987Y85</td><td></td></tr><tr><td>ガラスパスツールピペット</td><td>Krackeler Scientific</td><td>6-72050-900</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物(MgSO4&middot;7H2O)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP213-1</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>二塩基性カリウム(K2HPO4)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP363-1</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>一塩基性カリウム(KH2PO4)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水ナトリウム(Na2HPO4)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>タツノオトシゴXFpアナライザー</td><td>アジレント</td><td></td><td></td></tr>タ<tr><td>ツノオトシゴXFpフラックスパック</td><td>アジレント</td><td>103022-100</td><td></td></tr>ア<tr><td>ジ化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S2002</td><td></td></tr></tbody></table>

そのまま線虫の酸素消費量の測定

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

最適なミトコンドリアの機能は、これら神経系および筋のような高いエネルギー需要を持つセルを中心に、健康な細胞の活動にとって重要です。一貫性のある、このミトコンドリア機能障害は無数の神経変性疾患と一般的に高齢化に関連付けられています。線虫は、ミトコンドリア機能の多くの複雑さを解明するための強力なモデル システムをされています。ミトコンドリアの呼吸はミトコンドリア機能の強力な指標と最近開発された respirometers は、細胞内呼吸を測定する最新のプラットフォームを提供します。このプロトコルでは、ライブ、そのままc. の elegansの解析手法を提供します。このプロトコルは 〜 7 日間の期間にわたる、(1) 成長と注入する化合物の線虫、 (2) の合成とプローブ、(3) 薬剤の読み込みとカートリッジの平衡、ワームの分析の準備 (4) 水和の同期するための手順が含まれていますプレートと分析を実行すると、(5) の後の実験データ解析。

プロトコルを使用して記載、OCR の野生型動物と 3 つの異なるsel 12変異株と判断されました。sel 12プレセニリン17 c. の elegansオーソログをエンコードします。人間プレセニリン変異が家族性アルツハイマー病18の開発に関連付けられている最も一般的な遺伝的異常です。私たちの研究は野生型動物3と比較して変異動物で、 sel 12のミトコンドリア カルシウム濃度を示しています。Sel 12変異体と野生型の動物で OCR をsel 12突然変異の影響を調べるため測定したのでカルシウムの調節不全は、変更されたミトコンドリア機能3,19、20...

ミトコンドリアの呼吸は生物の生存にとって重要ですしたがって、酸素消費量は、ミトコンドリアの健康の優れた指標です。このプロトコルでは基底を測定する市販の呼吸の使用を述べるし、最大酸素消費量のライブ、線虫そのまま・自由に運動。

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

ミトコンドリア機能は細胞恒常性に重要であり、酸素消費率はミトコンドリアの健康の決定的な指標です。このプロトコルは、C.elegansの酸素消費量率を分析するための詳細な指示を提供します。このプロトコルは、ミトコンドリア機能の法的測定を提供するライブ、モバイルC.elegansを利用しています。ミトコンドリアを分離する必要性を高める, 潜在的にそれが整合性に影響を与える可能性のあるステップ.まず、望ましい遺伝的背景のL4幼虫を、ネマトデ成長培地またはNGMプレート上の大腸菌の新種の芝生に移す。各株に少なくとも2つの100 mmまたは3つの60 mmプレートを使用してください。3〜4日間、またはプレートが多数の卵とグラビッドワームで濃縮されるまで、適切な成長温度でワームをインキュベートします。卵とワームを、線虫の100ミリメートルプレートあたり約6ミリリットルのM9バッファーを使用してプレートから洗い流します。ガラスの牧草地のピペットを使用して、卵とワームを各株の個々の15ミリリットル遠心分離管に移します。6、180gで3分間、3分間、本管を下ろします。遠心分離後、動物および卵ペレットのみを保持するM9緩衝液を吸引する。各チューブに3〜4ミリリットルの漂白剤溶液を加え、断続的に渦を6分間加えます。次に、M9バッファーを加え、各チューブを充填し、1分間6、180gでスピンします。上清を吸引し、M9で3回この洗浄を繰り返します。洗浄後、約9ミリリットルのM9バッファーを含む新鮮な15ミリリットルのチューブに卵ペレットを移動します。16〜48時間摂氏20度で、孵化したてのワームを同期させます。これらのチューブを6、180gで1.5分間回転させた後、同期したL-1動物をOP50の新しい播種された芝生の上に個々のNGMプレートに置きます。約42時間後に動物がL-4幼虫段階に達するまで、プレートを摂氏20度に保ちます。このとき、プラチナピックを使用して、FUdRの1ミリリットル当たり0.5ミリグラムを含むOp50播種NGMプレートにL4幼虫を移動させ、子孫を産生するのを防ぎます。200マイクロリットルの蒸留水をプレートの各ウェルに加えてセンサーカートリッジを水和し、センサープローブが水没していることを確認します。プレートを室温で一晩保管します。レスピロメーターインターフェース内の発熱体をオフにします。機械を15°Cのインキュベーターの中に保管すると、機械内のコア温度が下がり、アッセイ中に動物が過熱するのを防ぎます。一晩のインキュベーションの後、ピペットを取り出し、センサープローブを水和するために使用される蒸留水を捨て、各ウェル内の200マイクロリットルのキャリバーラント溶液に交換します。蒸留水で100マイクロモルFCCPにFCCPストック溶液を希釈します。次に、希釈溶液の20マイクロリットルをセンサーカートリッジの注入ポートAに加える。センサーカートリッジの注入口Bに400ミリモルナトリウムアジドの22マイクロリットルを加えます。さて、呼吸数計をオンにします。ホーム画面で[開始]を選択すると、テンプレートページが表示されます。テンプレートページで、空白」または以前にデザインされたテンプレートを選択します。グループ ページが表示されます。グループページで、ウェルAとHをバックグラウンドウェルとして選択し、残りの6つの井戸を実験計画に従って適切なグループに割り当てます。右下の矢印をクリックしてプロトコルページにアクセスし、平衡、基底、および注入の1および2ボタンが選択されていることを確認します。基礎OCRの読み取り値の数だけでなく、最大OCRと非ミトコンドリアOCRを調整します。右下隅の矢印を選択します。センサーカートリッジプレートをロードするように求めるプロンプトが表示されます。リマインダープロンプト画面の指示に従って、センサーカートリッジプレートが正しい方向にロードされていることを確認します。レスピラメーターがカートリッジを平衡化します。8つのウェルとセルプレートの周囲の貯水池のそれぞれにM9バッファーの200マイクロリットルを追加します。各株から約100個のワームをシードなしのNGMプレートに取り込み、2〜3分間休ませます。その後、M9バッファーでプラチナピックの端を濡らし、20歳の同期動物をGを通してウェルBに選び、バックグラウンドウェルAとHを空のままにします。ここで、ソフトウェアの「OK」をクリックして、キャリブレーションバッファを含むプレートを取り出します。センサーカートリッジを器具の中に残して、レスピロメーターからプレートを取り外します。キャリブラントプレートを動物を含むプレートに交換します。プレートをロードし、続けて押してドアを閉め、アッセイを実行させます。アッセイの実行が完了したら、画面の指示に従ってセルプレートとセンサーカートリッジを取り外します。USB ポートにフラッシュ ドライブを挿入して、実行データの戦争形式を保存します。センサーカートリッジを取り外し、動物が約2分間井戸の底に落ち着くようにします。細胞板をステレオ解剖顕微鏡の下に置き、井戸当たりの動物数を数えます。分析ソフトウェアを開き、その後に正規化タブを開き、酸素消費率を動物数に正規化します。「変更」タブの下の様々なグループに適切なレベルを適用し、さらなる分析のためにプリズムファイルとしてファイルをエクスポートします。最初の5つの測定の平均は基底OCRである。FCCPの付加の後の5つの測定の平均は最も大きいOCRである。最後に、アジドナトリウム添加後の最後の5回の測定値の平均は、非ミトコンドリア呼吸率である。カルシウム調節不変性はミトコンドリア機能の変化をもたらす可能性があるため、sel-12変異体と野生型動物の両方でOCRを測定し、ミトコンドリア機能および健康に対するsel-12突然変異の影響を調べた。野生型動物は一貫してワームあたり毎分5ピコモール以下の基底OCR率を示した。セル-12突然変異体の3つの株はすべてOCRを有意に上昇させたが、1分間に約7ピコモールの、ワーム当たり。FCCPの添加に際して、期待通りに野生型のOCR、ならびにsel-12変異体の増加があった。野生型動物は、ワームあたり1分間に約7ピコモールの最大OCRを示した。sel-12変異体は1分間に約10ピコモールのOCRを持っていたが、ワームあたり。このアッセイでは、生きて、よく餌を与えられ、非同期の動物を使用し、アッセイ井戸への卵または死体の移動を避けてください。さらに、器械の内部温度は摂氏25度を超えてはなりません。漂白剤、FCCP、FUdR、およびアジドナトリウムは有毒です。したがって、在庫液および薬物ローディングの準備中に保護手袋を着用するよう注意する必要があります。

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Biology

生物学

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細菌クリアランスの測定による 線虫 の食物摂取量の定量化

学ぶ 線虫Caenorhabditis elegansの酸素消費量測定法。ミトコンドリア機能を生きた状態で評価し、遺伝変異がミトコンドリア健康に与える影響を解明する実験プロトコルです。

そのまま線虫の酸素消費量の測定

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