Name: 侵襲性外科生検に対する脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学ぶ侵襲性外科生検前後の脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング法。マウスモデルで単一細胞レベルの移動・浸潤・増殖を可視化し、外科処置が腫瘍動態に与える影響を詳細に解析する手法です。

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著者らは、アンコ・デ・グラフとハブレヒト・イメージング・センターのイメージング・サポートと、原稿の校正と編集に対するエレン・ウェーレンスとハンナ・ジョンソンに感謝しています。

<ol><li>Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+cancer+genome+diagnostics+for+routine+clinical+use%3A+overcoming+the+roadblocks+to+personalized+cancer+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine.</a> Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).</li>
<li>van Malenstein, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+obtained+by+needle+biopsy+gives+additional+information+on+the+prognosis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology+Research%22%5BJournal%5D)">Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).</li>
<li>Kretschmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+in-transit+metastases+after+sentinel+node+biopsy+in+patients+with+melanoma+%28Br+J+Surg+2004%3B+91%3A+1370-1371%29%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371).</a> British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).</li>
<li>Alieva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+inflammation+inhibits+biopsy-mediated+changes+in+tumor+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior.</a> Scientific Reports. 7, 7529(2017).</li>
<li>Hobson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammation+induced+by+the+biopsy+of+mouse+mammary+tumors+promotes+the+development+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+Treatment%22%5BJournal%5D)">Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis.</a> Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).</li>
<li>Weil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microtubes+convey+resistance+to+surgical+lesions+and+chemotherapy+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas.</a> Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).</li>
<li>Parsa, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+intracranial+dissemination+of+glioblastoma+multiforme+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults.</a> Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).</li>
<li>Zomer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cancer+stem+cell+plasticity+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors.</a> Stem Cells. 31, 602-606 (2013).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4, 158ra145(2012).</li>
<li>Schreurs, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Multi-Parametric+Magnetic+Resonance+Imaging+of+Tumor+Response+to+Photodynamic+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy.</a> PLOS ONE. 11, e0165759(2016).</li>
<li>Nielsen, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+tumor+neovascularization+in+a+transgenic+mouse+model+with+a+novel+64Cu-DOTA-knottin+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide.</a> Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).</li>
<li>Alieva, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+therapy+with+cytotoxic+mesenchymal+stromal+cells+optimized+by+bioluminescence+imaging+of+tumor+and+therapeutic+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response.</a> PLOS ONE. 7, e35148(2012).</li>
<li>Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendra2+photoswitching+through+the+Mammary+Imaging+Window%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window.</a> Journal of Visualized Experiment. (28), e1278(2009).</li>
<li>Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNoordmans%2C+HJ+%22Registration+and+analysis+of+in+vivo+multispectral+images+for+correction+of+motion+and+comparison+in+time%22">Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time</a>. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).</li>
<li>Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+to+1.6-mm+depth+in+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex.</a> Journal of Biomedical Optics. 16, 106014(2011).</li>
<li>Kirkpatrick, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-rate+resonant+scanning+multiphoton+microscopy%3A+An+emerging+technique+for+intravital+imaging+of+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment.</a> IntraVital. 1, (2012).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ここでは、生体検などの侵襲的外科的処置に応じて、生体動物の脳における単一細胞レベルでの腫瘍細胞行動の変化を研究する方法について述べた。慢性CIWの外科的移植との縦方向多光子イメージングの組み合わせは、同じ動物4における生検前後の腫瘍細胞移動、侵入、増殖の定量を可能にする。生物発光イメージング12、MRI 10、PET/CT11などの腫瘍多日モニタリングに使用される他のアプローチと比較して、この方法は腫瘍を単一の細胞レベルで一意に可視化し、したがって、細胞行動に関する洞察を提供します。基礎となる腫瘍の進行。
このメソッドを正常に実行するには、いくつかの手順を習得する必要があります。このプロトコルの最も重要なステップは、CIWの移植と交換です。これらのステップの技術的な複雑さは着実な訓練によって得られる精密および外科技術を要求する。脳表面を覆う出血などのCIW手術中の合併症は、その後のイメージングに対して困難であることが証明される可能性がある。滅菌ツールや環境の欠如、ならびに脳表面を完全に密封する失敗は、脳表面(カバースリップの下の白い液体)に感染を引き起こす可能性があり、画像を問題にし、結果として生じる結果を強く損なう解釈。このプロトコルのもう一つの一般的な問題は、タイムラプスイメージング中の動物の動きです。実験後はxyzシフトを修正できますが、情報の損失を防ぐために、各タイムポイントの前に各位置の座標を修正することをお勧めします。組織の変形は、反転顕微鏡でイメージングする際に見られる追加の問題です。マウスをサフィンの位置に置くと、脳組織は圧迫に苦しむ。組織変形の程度に応じて、腫瘍細胞追跡は、細胞変位の誤った定量化につながる可能性がある。これを防ぐために、剛性および弾性変形のためのソフトウェアを14を使用することができる。
この手順は、腫瘍の行動の変化を研究するための広範なアプリケーションを提供していますが、特定の制限を考慮する必要があります。この方法は、科学者が(光学パラメトリック発振器を使用して)1.6ミリメートルの深さまで画像化することができます。しかし、これはイメージングが表面的な脳皮質領域15に限定されたことを意味する。したがって、脳幹領域に位置する拡散性本質的なポンチン神経膠腫を含む、深い脳構造に位置する一部の脳腫瘍は、このプロトコルを用いて本来の脳環境で研究することができない。このプロトコルのもう一つの制限は、画像化することができる腫瘍の体積である。全腫瘍体積スキャンは最大情報を得ることが望ましいが、多くの場合、腫瘍サイズおよび移動細胞の速度は因子を制限し得る。腫瘍タイプごとに、イメージングに最適なタイムラプスを考慮する必要があります。画像間の時間枠が長すぎると、腫瘍細胞を追跡することが困難な場合があります。共振スキャナの使用は、より大きな腫瘍16のイメージングを可能にする、スキャン時間を大幅に短縮することができます。最後に、このプロトコルの手動画像解析は非常に時間がかかるため、代わりに、自動化された3Dトラッキングのためのプログラムを使用することができます。しかし、自動セル追跡のアルゴリズムは、目的のセルの移行を正確に要約するように設計されることはほとんどないため、追跡の結果は常に視覚的に監視する必要があります。
ここで説明するプロトコルのわずかな適応は、より広い範囲のアプリケーションを可能にすることができます。生検を行う代わりに、部分的な腫瘍切除や化学療法ウエハの送達などの他の(外科的)介入を実施してもよい。外科的に埋め込まれたマイクロチューブを介した化合物の添加は、目的とする特定の分子を薬理学的に標的とするこのプロトコルと組み合わせてもよい。このモデルは、腫瘍細胞行動に対する特定の介入の影響を分析する研究に役立つことを期待する。同じ動物で繰り返し測定を行う可能性は、腫瘍で起こる変化に関するより正確なデータを提供するだけでなく、研究ごとに必要な実験動物の数を大幅に減らします。

ほとんどの固形腫瘍の治療の標準は、診断のための組織生検、予後、およびパーソナライズされた治療決定1、2を含む。全体的に、これらの手順は臨床的利益を与えるが、最近の証拠は、生検および腫瘍切除のような他のより侵襲的な手順が、腫瘍の進行に悪影響を及ぼすことも示している3、4、5,6.これらの手順は、患者のケアに不可欠であり、その利点は、その負の効果を克服する一方で、患者の安全性と最大にするために、これらの負の影響の背後にあるメカニズムを十分に理解する必要があります。これらの手順の肯定的な影響とそれらがさらに臨床的に有益にする。
腫瘍進行に対する生検媒介性望ましくない効果は、組織破壊に応答する腫瘍微小環境の全身変化および変化によって引き起こされる4,5.したがって、生きた動物でこのプロセスを研究する必要があります。しかし、これらの最小限に侵略的な手順の微妙な結果は、多くの場合、個人間の大きなバリエーションによって偽装することができます。免疫組織化学または転写発現分析に基づく従来の方法は、これらの効果を見落としたり、それらを同定するために多数の動物を必要とする場合があります。さらに、これらの静的アプローチは、遊移および侵入、腫瘍悪性腫瘍と相関する動的プロセスなどの腫瘍細胞行動の変化を同定する能力を欠いている。これらの腫瘍細胞の特徴は、神経膠芽腫多色(GBM)のような非常に積極的な脳腫瘍にとって特に重要であり、腫瘍細胞の局所的な広がりは外科的切除を制限し、患者の生存率7を減少させる。生検がGBM細胞の挙動にどのように影響するかを完全に理解するには、生物の生理的文脈でこれらの細胞を視覚化できる縦方向のアプローチが必要です。
外科的に埋め込まれた慢性イメージングウィンドウと組み合わせた高分解能イントラビタルイメージングの最近の開発は、科学者が複数の日8、9にわたって生きているマウスの腫瘍細胞の動的挙動を研究することを可能にする。この強力なアプローチを用いて、同じマウスの生検に応じて、腫瘍細胞の増殖、移動、浸潤行動が数日間でどのように変化するかを研究することができます。磁気共鳴イメージング(MRI)10、陽電子放射断層撮影/コンピュータ断層撮影(PET/CT)11、または生物発光イメージング12など、生きたマウスの腫瘍の複数日モニタリングを可能にする他の技術と比較して、これは、アプローチは、単一細胞レベルで腫瘍細胞の挙動を研究し、腫瘍内で起こる微妙な変化を解明する可能性を提供します。
ここでは、腫瘍性マウスの脳における生検様損傷および生体生体前および生後縦腔内イメージングを行う詳細な方法について説明する。この方法は、部分的な腫瘍切除または化学療法ウエハの移植などの他の外科的介入を研究するために潜在的に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>25g x 16 mm 皮下注射針</td><td>BD Microlance</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>701 RN 10uL SYR W/O 針</td><td>ハミルトン</td><td>7635-01</td><td></td></tr><tr><td>吸収性ゼラチンスポンジ</td><td>ファイザー</td><td>ゲルフォーム</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ ラウンド 6 mm</td><td>VWR 国際</td><td>631-0168</td><td></td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>パテックス</td><td>パテックス ウルトラ ゲル</td><td></td></tr><tr><td>デンタルセメント</td><td>Vertex Dental</td><td>Vertex Self-Curing</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Dremel</td><td>Dremel 3000 (歯科用ドリルの方が便利かもしれません) + 105 彫刻カッター</td><td></td></tr><tr><td>細湾ピンセット</td><td>Dumont</td><td>AGT508</td><td></td></tr><tr><td>Hypnorm</td><td>VetaPharma Ltd</td><td>Hypnorm (クエン酸フェンタニル 0,315 mg/ml+ フルアニソン 10 mg/ml)</td><td></td></tr><tr><td>ミダゾラム</td><td>Actavis</td><td>5mg/ml</td><td></td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>Kela Veterinaria</td><td>Duodrops veter kela 10 m</td><td></td></tr><tr><td>Quintessential Stereotaxic Injector (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンオイル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>181838</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaxic Frame</td><td>Stoelting</td><td>Lab standard stereotaxic, rat and mouse</td><td></td></tr><tr><td>手術用ステレオ顕微鏡</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テムゲシック(0.3 mg / ml)</td><td>BDファーマシューティカル</td>ズ<td>283732</td><td></td></tr><tr><td>バンナスT&uuml;bingen Spring Scissors</td><td>ハーバード装置</td><td>72-8508</td><td></td></tr><tr><td>キシロカイン (リドカイン 1% + エピネフリン 1:100,000) 局所麻酔薬</td><td>アストラゼネカ</td><td>キシロカイン (リドカイン 1% + エピネフリン 1:100,000)</td><td></td></tr></tbody></table>

侵襲性外科生検に対する脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

生検はがん治療の標準的な治療であり、固形腫瘍の診断、予後、個別化された治療決定を可能にするので、臨床的に有益です。しかしながら、生検および他の侵襲的処置による腫瘍アーキテクチャの摂動は、腫瘍進行に対する望ましくない影響と関連しており、これらの処置の臨床的利益をさらに改善するために深く研究する必要がある。腫瘍のスナップショットのみを提供する従来の静的アプローチは、腫瘍悪性腫瘍に密接に関連するプロセスである腫瘍細胞行動に対する生検の影響を明らかにする能力に限られている。特に、腫瘍細胞の移動は、局所的な腫瘍の播播広が全腫瘍切除を事実上不可能にする非常に積極的な脳腫瘍の鍵である。マルチフォトンイメージングと慢性イメージングウィンドウの開発により、科学者は時間をかけて生きた動物のこの動的なプロセスを研究することができます。ここでは、同じ生体動物における生検前後の脳腫瘍細胞の高解像度縦方向イメージングの方法について説明する。このアプローチは、腫瘍細胞行動(移動、侵入、増殖)に対するこの手順の影響を研究することを可能にする。さらに、この技術の長所と限界、ならびに腫瘍切除や化学療法の移植を含む他の外科的介入に対する癌細胞行動の変化を研究するこの方法論の能力について議論する。ウェーハ。

生検が脳腫瘍細胞の挙動に及ぼす影響を評価するために、このプロトコルに記載の手順を実行した。グリオーマ-GL261細胞-核蛍光タンパク質(H2B-Dendra2)を発現させる細胞をC57BL/6マウスの脳に注入し、慢性CIWを移植した。腫瘍に対する生検前および生検後の損傷と同じ動物に対して、時間経過インビタルイメージングが行われた(図1A,B)。個々の腫瘍細胞の移動は、z-stack(図1C)の異なるxy平面における経時の移行経路を追跡することによって決定され、生体生殖前および生体後細胞のパーセンテージとしてプロットした(図1F)。腫瘍細胞増殖速度は、有分裂時のH2Bタグ付きDendra2凝縮に基づいて定量し(図1D)、生体前および生体後細胞の分裂の割合としてプロットした(図1E)。同じ腫瘍における生検前後の遊移速度の分布を比較したところ、介入後に渡り細胞の数(速度&gt;4 μm/h)が増加し、遅い/非移行細胞の数が減少することがわかった(速度 &lt; 4 μm/h) (図 2A)腫瘍当たりの平均では、生検様損傷を行った場合の渡り細胞の割合が1.75倍(SD=0.16)増加し、生検されなかった対照マウスと比較した(図2B)。我々は、別の週の腫瘍細胞の挙動を監視し、渡り腫瘍細胞の割合は最終的に対照マウスと生検マウスの両方で減少したが、生検マウスはまだ対照マウスよりも高い渡り子能力を示した((図 2C)時間の経過に伴う腫瘍細胞増殖行動の分析は、非生検対照マウスに対して、生検時の有人事象数の1.52倍の増加を示した(図2D)。
腫瘍細胞増殖および移動行動に対する生検の観察された効果がCIW置換手術(生検様損傷を行うために必要な)による人工物であったかどうかをテストするために、CIWを受けたマウス群の腫瘍細胞行動をモニタリングした。生検なしの置換。本群では、腫瘍細胞の移動または増殖の誘導は観察されず、腫瘍細胞増殖および移行速度の上昇が生検様損傷によって特異的に引き起こされたことを示した(図3A,B)。
蛍光タンパク質Dendra2の安定な光変換性は、数日間にわたって腫瘍細胞浸潤を研究することを可能にする。紫外線/青色光にさらされると、Dendra2は不可逆的に緑から赤に切り替わります。この性質を用いて、腫瘍の正方形領域を照射し、〜200 Dendra2発現腫瘍細胞を生検前にフォトマークした(図4)。生検の翌日、光切り替え領域を再局在化し、周囲の腫瘍組織に浸潤した腫瘍細胞の体積を測定した。生検様損傷後の腫瘍の浸潤領域は、非生検対照腫瘍と比較して1.72倍(SD=0.41)大きかったことがわかった(図4)。このアプローチは、単一の細胞レベルではなく、腫瘍細胞のバルク浸潤行動に関する情報のみを提供しますが、タイムラプスイメージングアプローチよりも時間がかかりにくく、排他的に焦点を当てた研究質問のための選択方法となりうる潜入行動を研究する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig1.jpg"> 図1:腫瘍細胞行動に対する生検効果の縦方向のバイタルイメージングのための実験的セットアップ。(A) リングと磁気ホルダーのデザインを示す図。(B) 実験ワークフローの概略表現。腫瘍細胞をマウスの脳に注入し、CIWを確立する。腫瘍の発症時に、最初の(生検前)タイムラプスイメージングセッションが行われる。翌日、生検およびCIW置換が実施される。イメージング(生後生検)の翌日には、2回目のタイムラプスイメージングセッションが行われる。長期的な効果のために、後続のイメージングセッションを行うことができます。(C) 画像は、GL261 H2B-Dendra2腫瘍細胞が追跡されたタイムラプスムービーの代表的なスナップショットを示す。赤い線は個々の腫瘍細胞のトラックを示す。スケールバー= 50 μm.(D) GL261 H2B-Dendra2腫瘍における分裂細胞を示す生体内タイムラプス画像の代表的。人工的な異なる段階が示されます:プロフェーズ(P)、プロメタフェイズ(Pm)、メタフェーズ(M)、アナフェーズ(A)、およびテロ相(T)。スケールバー = 50 μm. グラフは、(E)渡り子と(F)細胞を分裂する細胞の前生検とポストバイオプシーの割合を示す。各ドットは、個々の動物で測定されたすべての位置における渡り細胞のパーセンテージを示します。データは、6匹のマウスの平均±S.E.M.として示される(**P&lt;0.01、対対t-test)。 この図は Alieva ら4.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig2.jpg"> 図2:腫瘍細胞の移動および増殖速度に対する生検の影響を示す代表的な結果。(A) 個々のマウスにおける基底移動に対する細胞速度分布の変化を示す滝プロット。データは、5匹のマウスの平均±S.E.M.として示される。(B) 対照細胞(青色)および生検(赤色)動物の数は、渡り細胞の予備介入数に正規化された(n=6マウス、***P&lt;0.0001、学生のt-test)。 (C)腫瘍細胞の挙動を数日間にわたって追跡した。例示は、時間の経過に関する個々のマウスにおける正規化された(前介入に対する相対的な)回食細胞数(n&gt; 4マウス/条件、***P&lt;0.0001、双方向分散分析)。(D) 対照細胞(青色)と生検(赤色)動物の分裂細胞の正規化数。個々の動物ごとに、介入後の値は、予見前の値に正規化された(n = 5マウス、**P &lt; 0.01、学生のt-test)。 この図は Alieva ら4.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig3.jpg"> 図3:CIW置換は腫瘍細胞の挙動に影響を及ぼさない。縦方向のバイタルイメージングは、生検なしのCIWの置換が移行および増殖速度に影響を及ぼさないことを示している。(A) 示された条件に対する渡り子細胞数の増加。すべてのシンボルは、個々のマウスの平均を表し、n ≥ 4 マウスを表します。(B) 示された条件に対する増殖細胞数の増加。すべてのシンボルは、個々のマウスの平均を表します(n ≥ 4 マウス、**P &lt; 0.01,***P &lt; 0.001、ns = ニューマン・ケウルスのポストホックテスト付きの一方通行の ANOVA)。この図は Alieva ら4.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig3large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59278/59278fig4.jpg"> 図4:Dendra2写真切り替えで得られた実験設定と代表的な結果を示す図。生検時に腫瘍細胞浸潤を監視するために、Dendra2発現腫瘍細胞は、UV/青色光照明によって正方形領域に光スイッチングされ、生検の1日前に画像化される。生検の翌日、光交換領域は再局所化され、再画像化される。腫瘍細胞浸潤の代表的なDendra2画像を示し、チャネル減算を用いて補正した。白い点線は浸透領域を表します。スケールバー = 50 μm。グラフは、生検(赤)および対照(青)マウスに対してプロットされた増加した光切り替え領域を示す。すべてのドットは、個々のマウスの平均値を表します(n ≥ 5マウス、*P &lt; 0.05、学生のt-test)。 この図は Alieva ら4.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59278/59278fig4large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは、同じ生体動物内での侵襲的外科的介入(例えば生検)の前後の脳腫瘍細胞の高解像度タイムラプスマルチフォトンイメージングの方法について説明する。この方法は、これらの侵襲的外科的処置が腫瘍細胞の移動、侵襲的、増殖性の行動に対する影響を単一の細胞レベルで研究することを可能にする。

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

このプロトコルは、ユーザーが移動、浸潤、および増殖などの腫瘍細胞行動にクリニックで使用される侵襲的な外科的処置の影響を研究することを可能にする。この方法は、侵襲的処置の前後に同じ腫瘍をユニークに視覚化することを可能にし、非縦断的アプローチで見逃すことができる洞察を提供する。麻酔付きの成人マウスのつまみつまみへの応答の欠如を確認した後、立体的なフレームにマウスを取り付け、鼻クランプと2つのイヤーバーで頭を固定します。体温を維持するために加熱ランプを使用し、動物の目に軟膏を適用します。鋭利なはさみを使用して、目から頭蓋骨の基部に頭蓋骨の毛皮を剃り、露出した皮膚を殺菌するために70%エタノールを使用します。皮膚を円形に切り、綿棒を使って露出した骨膜を削り取ります。綿棒で余分な溶液を取り除く前に、1%リドカインの低下、および1:100,000濃度のエピネフリンを5分間治療します。シアノアクリル酸接着剤を使用して皮膚の端を頭蓋骨に付着させ、4倍の拡大で解剖ステレオ顕微鏡の下に立体フレームを配置します。次に、表面的な5ミリメートルの直径、円形の溝を右頭頂骨に慎重に掘削します。そして、溝に皮質緩衝液の滴を適用します。薄い鉗子を使用して骨のフラップを持ち上げて脳表面を視覚化し、曲がったテーパードの非常に細い点鉗子を使用して硬膜を取り除きます。出血が発生した場合は、吸収性ゼラチンスポンジを使用して止血を行います。腫瘍細胞注射の場合、約3マイクロリットルの細胞を、ポイントスタイルの2本の針を備えた5マイクロリットルのガスタイトな注射器にロードする。ステレオタキシックマニピュレータアームの針を固定し、露出した組織から皮質バッファーを取り除きます。頭蓋骨切除術の途中に注射器の先端を置き、頭蓋骨の表面から0.5ミリメートルの深さで針を挿入します。次に、皮質バッファーを1滴の皮質を頭蓋骨の骨組に加え、マイクロシリンジポンプインジェクターを使用して、毎分250〜400ナノリットルの速度で細胞を送達する。頭蓋イメージングウィンドウを準備するには、窓の下の気泡を避けるために、皮質バッファーを頭蓋骨開頭部位にシリコーンオイルの滴で置き換えます。露出した脳を6ミリメートルのカバースリップで密封し、カバースリップと頭蓋骨の間にシアノクリレート接着剤を塗布します。その後、細かいピンセットを使用して、カバースリップを頭蓋骨に軽く押し付けます。適切な実験タイムポイントで、マウスの顔を撮像ボックスに置き、25倍の水の目標を最も低いz位置に設定します。目的に大量の水を加え、顕微鏡の37°Cの暗い気候室にイメージングボックスを移します。水滴がカバースリップに触れるまで、頭蓋イメージングウィンドウのカバースリップに目的を持って来てください。そして、蛍光モードを使用して、接眼レンズを通して腫瘍を観察し、細胞を焦点にします。レーザーを正しい波長に調整し、ライブモードを選択します。イメージングに関心のある複数の位置を選択した後、その座標をソフトウェアに記録します。各位置のZスタックを定義して、腫瘍細胞分解能を損なうことなく腫瘍細胞の最大体積を獲得し、画像間のステップサイズを3マイクロメートルに設定します。次いで、20分毎に異なる位置で腫瘍体積の画像を2時間取得し、各画像取得前に目的に水を加える。最後の画像が取得されたら、完全な回復まで監視と加熱パッドにマウスを転送します。最初のイメージングセッションの1日後に、実証されているようにステレオタックシックフレームで麻酔マウスを固定し、アセトンを浸した綿棒を使用して、接着剤が柔らかくなるまでカバースリップの端を拭きます。カバースリップの下に25ゲージの針をスライドさせ、それを持ち上げるために薄いポイント鉗子を使用し、新鮮な皮質バッファーで頭蓋切除術を水和します。25ゲージ針で腫瘍を1ミリメートルの深さまで穿刺し、無菌ゼラチンスポンジで出血を止め、新鮮なシリコーンオイルで脳の表面を密封する。その後、傷口の上に新しい6ミリメートルのカバースリップを接着します。画像解析では、顕微鏡ソフトウェアプログラムでタイムラプスLIFファイルを開き、プロセス、プロセスツール、およびマージタブを選択します。時系列の最初の画像を選択し、最初にクリックします。時系列の 2 番目の画像を選択し、2 番目をクリックします。[寸法のマージ] で、時間に対して [t] を選択し、[適用] をクリックします。2 つのタイムポイントを持つ新しいファイルが生成されます。連続する 3 つの z スタックのタイムラプス シリーズを個別に追跡した後、タイムラプス イメージを含むフォルダーを ImageJ にドラッグします。タブプラグイン、トラッキング、および MtrackJ を選択します。個々のセルを追跡するには、[追加] を選択し、各タイムポイントで各セルをクリックします。次に、[メジャー] をクリックし、ファイルを保存してトラックのメジャーを抽出します。個々の腫瘍細胞の移動は、zスタックの異なるxy平面で経時移動経路を追跡することによって決定され、生検前および生検後の回遊細胞の割合としてプロットすることができる。腫瘍細胞増殖率は、糸球体に対するH2Bタグ付dendra2凝縮に基づいて定量化し、生検前および生検後の分裂細胞の割合としてプロットすることができる。同じ腫瘍における生検前後の移動速度の分布を比較すると、介入後に回遊細胞の数が増加し、関連する低速から非遊動細胞の数が減少することが明らかになった。腫瘍当たりの平均では、生検様傷害が行われると、非生検マウスと比較して、回遊細胞の割合が1.75倍に増加することが観察される。遊動腫瘍細胞の割合は、最終的には対照マウスと生検マウスの両方で減少するが、生検マウスは依然として対照マウス全体よりも高い遊覧能力を示す。腫瘍細胞増殖行動はまた、非生物細胞化対照マウスに対して、経時の生検時の有糸分裂事象の数の1.52倍の増加を示す。なお、生検を伴わない頭蓋イメージングウィンドウ置換後に腫瘍細胞移動または増殖の誘導は認められず、腫瘍細胞増殖および移動速度の上昇が生検様傷害によって特異的に引き起こされることを示している。頭蓋イメージング、移植、および置換ステップの間に、高精度で外科的なスキルを持って作業することが重要です。広範な練習が必要な場合があります。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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学ぶ侵襲性外科生検前後の脳腫瘍細胞行動の縦腔内イメージング法。マウスモデルで単一細胞レベルの移動・浸潤・増殖を可視化し、外科処置が腫瘍動態に与える影響を詳細に解析する手法です。

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