Name: 黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムにおけるアルカリ性フォスファターゼ活性の比色分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: 学ぶ黄色ブドウ球菌バイオフィルムにおけるアルカリ性フォスファターゼ活性の比色定量法。96ウェルプレートを用いた高感度・高スループットな手法で、バイオフィルム形成におけるALPの機能解析に貢献します。

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ウィリアム Rainey ハーパー大学とこれらの実験を行うための施設のためのシカゴのイリノイ大学に感謝します我々 はまた彼らの寛大なサポートの McGraw 丘財団を感謝します。

1. 培地の準備
<ol><li>1 L のトリプシン大豆スープ (TSB) の準備: 1 L の蒸留水にはカゼイン、大豆ミール、塩化ナトリウム 3 g、2.5 g、ブドウ糖、リン酸水素二カリウム 2.5 g の馬肉のダイジェストの 5 g の 15 グラムを追加します。使用する前に消毒します。</li>
	<li>トリプシン大豆寒天 (TSA) の tsb、1 L に 15 g の寒天を追加オートクレーブ。それが室温まで冷却しなさい次に、ペトリ皿 (100 mm × 15 mm) あたり 20 mL の割合で注ぐ。</li>
	<li>バイオ培: オートクレーブ TSB の 1 L に 10 g のブドウ糖を追加。0.2 μ m フィルターを用いたろ過滅菌します。</li>
</ol>2 96 ウェル培養プレートで黄色ブドウ球菌のバイオ フィルム形成。
注:黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムは上記6,21として培養しました。
<ol><li>TSB の 10 mL の TSA から黄色ブドウ球菌の各コロニーに接種し、37 ° C で一晩成長</li>
	<li>1: 100 (v/v) 比で TSB/糖 (10 g/L) の 10 mL に一晩かけて培養を希釈します。一貫性のある濃度のミックスに優しく渦。</li>
	<li>1 つの 96 ウェル プレートから 18 の井戸 (実験グループ、ALP 活性6との関係を示唆するような非バイオ フィルム制御について) の合計に希薄文化の 200 mL を転送します。各時点の三つ子を使用: 0 分、15 分、30 分、45 分、60 分、75 分。3.2 の手順を参照してください。</li>
	<li>バイオ フィルム形成6、21の 24 h の 37 ° C で 96 ウェル プレートを孵化させなさい。</li>
	<li>吸引により、上清をデカントします。</li>
	<li>それぞれを洗ってリン酸緩衝液 (PBS、pH 7.4) x 1 でも 15,000 × gで 5 分間遠心し、吸引により、上清をデカントします。</li>
</ol>3.ブドウ球菌バイオ フィルムにおける ALP 活性の測定
注:説明6,18と ALP 活性を測定しました。
<ol><li>ステップ 2.6 から市販の同時の各ウェルで構成されるバッファーの ALP 基板の 75 mL を追加し、時間の記録を開始します。3 通の各時間ポイントを記録します。</li>
	<li>様々 な時間の培養後: 反作用を停止する 5 M NaOH の 75 μ L をそれぞれ追加 (コントロール) 0 分、15 分、30 分、45 分、60 分、75 分。</li>
	<li>15,000 × gで 5 分間プレートを遠心します。</li>
	<li>比色測定のための新しい 96 well プレートに培養上清の 100 μ L を転送します。</li>
	<li>それぞれの吸光度を測定 405 nm を使用してでも、96 ウェル リーダーをプレートします。0 分の時間を使用して井戸の 405 nm のバック グラウンド ノイズの制御を指します。</li>
	<li>3 つの個々 の 96 ウェル プレートで全体の実験を繰り返します。</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
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<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li>
<li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li>
<li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).</li>
<li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells%3A+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li>
<li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li>
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<li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

我々 の分析では、ALP 基板に同時を使用しました。ELISA 用に設計された実用的なソリューションで、希釈する必要はありません。Alp 企業様が、加水分解後黄色製品開発し、405 で測定できる nm。酵素反応の最後に、我々 は簡単に 96 ウェル プレートを遠心分離し、上澄みをプレート リーダーを使用して吸光度を測定する新鮮な 96 well プレートに転送。それは 405 で吸光度の一貫性を増加するのでこの余分なの遠心分離のステップが重要ですが分かった酵素反応中に発生したすべての可能な浮遊細胞を排除することによっておそらく nm。
バイオ フィルム形成報告6,21として一晩文化 (v/v) 1: 100 希釈 200 μ L を使用します。これは、黄色ブドウ球菌他の希釈液 (データは示されていない) と比較してバイオ フィルムを形成するための最適な希釈です。本稿の目的はバイオ フィルムにおける ALP 活性を測定するため、バイオ フィルムの最適...

アルカリフォスファターゼ (ALP) 普遍的、両方の原核生物と真核生物の細胞の1で表されます。核酸、タンパク質、アルカロイド、リン酸エステル、リン酸の無水物などの異なる分子からリン酸の加水分解を触媒することができますそれ。ヒトでは、真核生物の ALP は肝臓、骨、小腸、胎盤の2を含む多くの組織に存在です。それは通常骨格鉱化作用と同様、タンパク質リン酸化、細胞増殖、アポトーシス、幹細胞プロセスで重要な役割を果たしています。真核生物の ALP はまた、骨、肝臓、そして昇格したとき他の組織/臓器の疾患の有無をキー血清指標3,4。
土8にエシェリヒア属大腸菌5、黄色ブドウ球菌6,7いくつかの共通の第一胃内細菌などの細菌細胞の様々 な原核生物の ALP が検出されました。細菌の ALP 活性は、殺虫剤、重金属9および10細菌汚染の検出バイオ センサーとして使用されています。構成式の ALP はブドウ球菌11を識別し、エンテロバクター12からセラチアを区別するために使用されています。さらに、構成の ALP 生産病原性ブドウ球菌13と相関していることをお勧めします。ALP は、異なる設定3,4、研究されているがまだ少しはその活動とバイオ フィルム文化の機能の報告されます。
バイオ フィルムは、その自由生存細菌セル対応14と比較して異なる機能細菌生命に記載されています。黄色ブドウ球菌、さまざまな臨床状態と抗生物質耐性の慢性的な炎症15,16アカウントでバイオ フィルムの形成が確認されました。多くの分子は、多糖類、タンパク質、核酸、脂質などのバイオ フィルム マトリックスに報告されていたが、バイオ フィルム形成のメカニズムは完全に理解した14。バイオ フィルム形成における ALP の役割を理解し、96 のよく組織培養皿で黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムを培養し、パラ nitrophenylphosphate (同時) を用いた ALP 活性を測定します。
分子同時は ALP のための準備ができて使用する基板を ALP 活性6,17,18を測定に広く使用されています。この比色定量法は、パラ-ニトロフェノール 405 色製品の結果にパラ-ニトロフェニル リン酸 (同時) の変換に基づいて nm。Agarose のゲルの電気泳動法19、小麦胚芽凝集素 (WGA) 沈殿物および WGA HPLC20、この試金は非常に特定のように、他の従来の alp と比較して、敏感な簡単に再現、そして最も重要なでは、高スループット。

<table><tbody><tr><td>寒天</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ 遠心分離機</td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>グルース</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>NaOH ペレット</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>パラニトロフェニルホスフェート (pNPP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)でよく使用されるpNPP液体基質の典型的な濃度は、10〜50mMの範囲です。ここで使用されているような、すぐに使用できるほとんどのpNPP液体基板と同様に、正確なpNPP濃度は、その独自の性質のために開示されていません。</td></tr><tr><td>10x PBS、pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Biotek</td><td>ELx808</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン大豆寒天&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;15 g/L TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン大豆ブロス:&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;g/L カゼインの膵臓消化物............15.0 大豆飯のパパシックダイジェスト.........5.00 塩化ナトリウム..............................3.00 デキストロース........................................&nbsp;2.50 リン酸二カリウム..................2.50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>96井戸のティッシュの文化の版</td><td>BD</td><td>6902D09</td><td>のU字型の底</td></tr></tbody></table>

黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムにおけるアルカリ性フォスファターゼ活性の比色分析

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

アルカリフォスファターゼ (ALP) は原核生物と真核生物の細胞で発現した一般的な酵素であります。基本的な pH で多くの分子からリン酸モノエステル加水してリン酸の代謝に不可欠な役割を果たしています。ヒトでは、真核生物の ALP は、胆汁うっ滞や佝僂病などの各種疾患の診断に最も頻繁に使用される酵素の信号の一つです。S.細胞膜; 排他的に球菌ALP が検出されました。また同様に分泌形態として表されます。まだ、少しはバイオ フィルム形成の機能について知られています。
本稿の目的は、蛋白質の隔離を必要としない黄色ブドウ球菌バイオ フィルムにおける ALP 活性を測定するための迅速かつ信頼性の高いアッセイを開発することです。P-ニトロフェニル リン酸 (同時) を使用すると、基質として、96-well ティッシュの培養皿で形成された黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムにおける ALP 活性を測定しました。活動は、405 nm の吸光度を用いて水溶性反応生成物の形成に基づいていた。96 よく組織培養プレート法のスループットの高い自然は、高感度かつ再現性 ALP 活性アッセイ法を提供します。同じ実験のセットアップは、バイオ フィルム形成に関連する他の細胞外の分子マーカーを測定する拡張できます。

図 1は、96 のよく組織培養皿で黄色ブドウ球菌のバイオ フィルム文化から ALP 活性の代表的な結果を示します。市販, 耐溶液 75 μ L は、それぞれも、室温でインキュベートしたに追加されました。異なる時間の培養後 (0 分、15 分、30 分、45 分、60 分、75 分、それぞれ) 反作用を停止する 5 M NaOH の 75 μ L を追加しました。製品は、405 96 well プレート リーダーで測定した nm。時間の各ポイントが単一 96 well プレートから三つ子、3 の個々 の 96 ウェル プレートで全体の実験を繰り返した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59285/59285fig1.jpg"> 図 1:黄色ブドウ球菌バイ...

本稿では、96-well ティッシュの培養皿から黄色ブドウ球菌のバイオ フィルム文化のアルカリフォスファターゼ活性を定量化する高スループット方法を確立しました。

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

このプロトコルは、S.aureusバイオフィルム培養におけるアルカリ化ホスファターゼ活性を測定するための容易で信頼性の高い方法を提示した。バイオフィルム形成におけるALPの機能を理解するのに役立ちます。この手法の主な利点は、高スループットです。それは非常に敏感で、実行しやすいです。この手順のデモンストレーションは、ハーパー・カレッジの元学生、ケビン・ダニコフスキです。TSBを調製するには、カゼインの膵臓消化、大豆ミールのパパニックダイジェスト、塩化ナトリウム、デキストロース、リン酸二カリウムを蒸留水に加えます。フラスコをアルミホイルで覆い、オートクレーブに入れて使用前に滅菌します。TSAを準備するには、TSBに寒天を加え、殺菌のためにオートクレーブに入れます。その後、室温まで冷まします。次に、1皿あたり20ミリリットルの比率でペトリ皿に注ぎます。バイオフィルム培地を調製するために、グルコースをオートクレーブTSBに加えて1リットル当たり10グラムの濃度を達成する。真空ろ過キットを使用して、0.2マイクロメートルの細孔サイズのフィルターで溶液を濾過します。接種するには、殺菌接種ループを使用して、ペトリ皿からステープルアウレウスのコロニーを1つ選び、10ミリリットルのTSBで満たされた培養管に入れます。チューブをインキュベーターに入れて摂氏37度で一晩成長させます。マイクロピペットを使用して、100マイクロリットルの一晩培養を行い、1:100体積比希釈のためにグルコースでTSBの10ミリリットルを充填した培養管に移します。一定の濃度のために混合する渦。マイクロピペットを使用して、希釈培養物200マイクロリットルを1つの96ウェルプレートから合計18個のウェルに移します。バイオフィルム形成のために摂氏37度で96ウェルプレートを24時間インキュベートします。S.aureusの最高のバイオフィルム形成のために、フラットまたはラウンドボトム96ウェルプレートを選ぶ方が良いです。その後、プレートを少し傾けて、各ウェルの端から吸引して上清をデカントします。1X PBSでそれぞれをよく洗います。遠心分離機にプレートを入れて毎分8,000回転で5分間回転させ、吸引によって上澄をデカントします。各ウェルに市販のPNPPからなるバッファ状ALP基板の75マイクロリットルを加え、タイマーを使用して三重に各時点を記録する。各インキュベーションタイムポイントの後、反応を停止するために3つのウェルのそれぞれに5モル水酸化ナトリウムの75マイクロリットルを加えます。1分間に800回転でプレートを5分間遠心します。ピペットを使用して、100マイクロリットルの上澄み物を新しい96ウェルプレートに移して熱量測定を行います。96ウェルプレートリーダーを使用して、405ナノメートルで各ウェルの吸光度を測定します。30分のタイムポイントウェルを使用して、バックグラウンドノイズを制御します。3つの96ウェルプレートで実験全体を繰り返します。このプロトコルは、タンパク質の単離を必要としないS.aureusバイオフィルムのALP活性を測定するための迅速かつ信頼性の高いアッセイを開発する。ALP 活動の代表的な結果は、最大 75 分間の増加傾向を示しています。75分後、ALP活性の増加は認められなかった。良いバイオフィルム文化を確立することは非常に重要であり、習得するにはかなりの数の試験が必要な場合があります。当社や他の人々が以前に報告したように、結晶紫色のアッセイを行うことによってバイオフィルム形成を確認したり、バイオフィルム形成を容易にするために、ヒトの血漿でプレートを事前に処理することができます。その開発後、バイオフィルム形成を妨げる可能性のある潜在的なALP阻害剤をスクリーニングすることができます。その結果、医療分野におけるバイオフィルム管理に向けた重要な情報が提供されます。5モル水酸化ナトリウムは、接触した場合に危険である可能性があります。取扱い時には、必ず個人用保護具を着用してください。

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本稿では、黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムの 5-アミノレブリン酸による光線力学療法 (アラ-PDT) の抗菌効果を研究するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、PDT を細菌バイオ...

黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムに及ぼす 5-アミノレブリン酸による光線力学療法を勉強する体外モデル

このプロトコルは、カンジダ・アルビカンスとストレプトコッカス・ミュータンスからなるクロスキングダムバイオフィルムの栽培を記述し、これらのバイオフィルム内の細胞外pHを監視するための共焦点顕微鏡ベースの方法を提示する。...

共焦点顕微鏡を用いたクロスキングダムバイオフィルムの細胞外pHのモニタリング

この記事では、アルカリホスファターゼ結合ScFv D11抗体を使用した免疫蛍光法による組織内のイソレブグランジンの測定のための詳細な方法論を提供します。マウスとヒトの両方の高血圧モデルは、組織サンプル中のイソレブグランジン測定に関連する段階的な手順と基本原理を説明するために使用されます。...

D11 scFv-アルカリホスファターゼ融合タンパク質と免疫蛍光を用いた組織中のイソレブグランジンの直接検出(英語)

本プロトコルは、好中球-バイオフィルム相互作用の研究を記載している。 黄色ブドウ球 菌バイオフィルムは in vitro で確立され、末梢血由来のヒト好中球とインキュベートされます。好中球からの酸化バースト応答を定量化し、バイオフィルム内の好中球局在を顕微鏡で測定します。...

ヒト好中球と黄色ブドウ球菌バイオフィルムの間の相互作用を視覚化および定量するための標準化されたin vitroアッセイ

学ぶ黄色ブドウ球菌バイオフィルムにおけるアルカリ性フォスファターゼ活性の比色定量法。96ウェルプレートを用いた高感度・高スループットな手法で、バイオフィルム形成におけるALPの機能解析に貢献します。

黄色ブドウ球菌のバイオフィルムにおけるアルカリ性フォスファターゼ活性の比色分析

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