黄色ブドウ球菌のバイオ フィルムにおけるアルカリ性フォスファターゼ活性の比色分析
2019年4月12日
本稿では、96-well ティッシュの培養皿から黄色ブドウ球菌のバイオ フィルム文化のアルカリフォスファターゼ活性を定量化する高スループット方法を確立しました。
このプロトコルは、S.aureusバイオフィルム培養におけるアルカリ化ホスファターゼ活性を測定するための容易で信頼性の高い方法を提示した。バイオフィルム形成におけるALPの機能を理解するのに役立ちます。この手法の主な利点は、高スループットです。
それは非常に敏感で、実行しやすいです。この手順のデモンストレーションは、ハーパー・カレッジの元学生、ケビン・ダニコフスキです。TSBを調製するには、カゼインの膵臓消化、大豆ミールのパパニックダイジェスト、塩化ナトリウム、デキストロース、リン酸二カリウムを蒸留水に加えます。
フラスコをアルミホイルで覆い、オートクレーブに入れて使用前に滅菌します。TSAを準備するには、TSBに寒天を加え、殺菌のためにオートクレーブに入れます。その後、室温まで冷まします。
次に、1皿あたり20ミリリットルの比率でペトリ皿に注ぎます。バイオフィルム培地を調製するために、グルコースをオートクレーブTSBに加えて1リットル当たり10グラムの濃度を達成する。真空ろ過キットを使用して、0.2マイクロメートルの細孔サイズのフィルターで溶液を濾過します。
接種するには、殺菌接種ループを使用して、ペトリ皿からステープルアウレウスのコロニーを1つ選び、10ミリリットルのTSBで満たされた培養管に入れます。チューブをインキュベーターに入れて摂氏37度で一晩成長させます。マイクロピペットを使用して、100マイクロリットルの一晩培養を行い、1:100体積比希釈のためにグルコースでTSBの10ミリリットルを充填した培養管に移します。
一定の濃度のために混合する渦。マイクロピペットを使用して、希釈培養物200マイクロリットルを1つの96ウェルプレートから合計18個のウェルに移します。バイオフィルム形成のために摂氏37度で96ウェルプレートを24時間インキュベートします。
S.aureusの最高のバイオフィルム形成のために、フラットまたはラウンドボトム96ウェルプレートを選ぶ方が良いです。その後、プレートを少し傾けて、各ウェルの端から吸引して上清をデカントします。1X PBSでそれぞれをよく洗います。
遠心分離機にプレートを入れて毎分8,000回転で5分間回転させ、吸引によって上澄をデカントします。各ウェルに市販のPNPPからなるバッファ状ALP基板の75マイクロリットルを加え、タイマーを使用して三重に各時点を記録する。各インキュベーションタイムポイントの後、反応を停止するために3つのウェルのそれぞれに5モル水酸化ナトリウムの75マイクロリットルを加えます。
1分間に800回転でプレートを5分間遠心します。ピペットを使用して、100マイクロリットルの上澄み物を新しい96ウェルプレートに移して熱量測定を行います。96ウェルプレートリーダーを使用して、405ナノメートルで各ウェルの吸光度を測定します。
30分のタイムポイントウェルを使用して、バックグラウンドノイズを制御します。3つの96ウェルプレートで実験全体を繰り返します。このプロトコルは、タンパク質の単離を必要としないS.aureusバイオフィルムのALP活性を測定するための迅速かつ信頼性の高いアッセイを開発する。
ALP 活動の代表的な結果は、最大 75 分間の増加傾向を示しています。75分後、ALP活性の増加は認められなかった。良いバイオフィルム文化を確立することは非常に重要であり、習得するにはかなりの数の試験が必要な場合があります。
当社や他の人々が以前に報告したように、結晶紫色のアッセイを行うことによってバイオフィルム形成を確認したり、バイオフィルム形成を容易にするために、ヒトの血漿でプレートを事前に処理することができます。その開発後、バイオフィルム形成を妨げる可能性のある潜在的なALP阻害剤をスクリーニングすることができます。その結果、医療分野におけるバイオフィルム管理に向けた重要な情報が提供されます。
5モル水酸化ナトリウムは、接触した場合に危険である可能性があります。取扱い時には、必ず個人用保護具を着用してください。
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概要
本稿では、96ウェル組織培養プレートを用いて S. aureus バイオフィルム培養中のアルカリホスファターゼ活性を定量するハイスループット法を提示します。本手法は、感度が高く実施が容易に設計されており、バイオフィルム形成におけるアルカリホスファターゼの役割に関する研究を促進します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- バイオフィルム研究
- 酵素学
背景
- アルカリホスファターゼ（ALP）は、さまざまな生物学的プロセスに関与する酵素です。
- バイオフィルム形成におけるALPの役割を理解することは、微生物学的研究において極めて重要です。
- 研究における効率的なデータ収集には、ハイスループット法が不可欠です。
- バイオフィルムは微生物の複雑な共同体であり、健康や産業に影響を及ぼす可能性があります。
研究目的
- バイオフィルムにおけるALP活性を測定するための信頼性の高い手法を確立すること。
- バイオフィルム形成におけるALPの機能についての理解を深めること。
- 研究者が容易に導入可能なプロトコルを提供すること。
使用した手法
- カゼインのパンクレアチン消化物、大豆ミールのパパイン消化物、塩化ナトリウム、デキストロース、およびリン酸二カリウムを用いたTSBの調製。
- ハイスループット解析のための96ウェル組織培養プレートの使用。
- S. aureusバイオフィルム培養液におけるアルカリホスファターゼ活性の測定。
- Harper Collegeの元学生であるKevin Danikowskiによる手順のデモンストレーション。
主な結果
- 本手法により、バイオフィルム培養におけるALP活性を定量化することに成功した。
- 本技術の高い感度により、正確な測定が可能である。
- プロトコルは簡便であり、さまざまな研究室で容易に導入できる。
- 本研究から得られた知見は、今後のバイオフィルム研究に寄与し得る。
結論
- 確立された本手法は、バイオフィルムにおけるALPの研究に有効である。
- 本研究は、バイオフィルムのダイナミクスの理解に寄与する。
- 今後の研究では、本プロトコルを基にバイオフィルム生物学の他の側面を探索することが可能である。
よくある質問
業界における重要性
本手法では、タンパク質の単離を行うことなく、S. aureusバイオフィルム中のアルカリホスファターゼ活性を迅速かつハイスループットに定量することが可能であり、抗菌薬探索における初期段階のターゲットバリデーションを支援します。細胞外酵素活性の感度が高く再現性のあるリードアウトを提供することで、バイオフィルムに関連する治療仮説のメカニズム的なリスク低減を促進します。また、本アッセイは96ウェルプレート形式と互換性があるため、リード化合物同定および予測精度の向上のためのスクリーニングカスケードにシームレスに組み込むことができます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値： アルカリホスファターゼがバイオフィルムの形成と持続に寄与するという治療仮説を検証する。
- 運用的価値： 無傷のバイオフィルムシステムにおける酵素活性の定量的測定を通じて、機能的なターゲット検証を可能にする。
- 予測的価値： ALPの調節をバイオフィルム抑制表現型に関連付けることで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 細胞外酵素マーカーに対する化合物の影響を評価するための、標準化されたハイスループット形式を準備します。
- 定量的出力： 405 nmでの吸光度測定により、用量反応解析およびヒット化合物の確認を可能にします。
- スケラビリティ： 96ウェルプレート形式を使用し、阻害剤ライブラリーの中スループットスクリーニングをサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患との関連性： ALP活性を、デバイス関連感染症や慢性感染症における主要な病原性因子であるS. aureusバイオフィルムに関連付けます。
- トランスレーショナルな連続性： 基盤研究と前臨床有効性試験を橋渡しする、バイオマーカーに基づいたリードアウトを提供します。
- リスク調整後の意思決定： バイオフィルムモデルにおけるターゲットへの結合能および表現型への影響に基づき、go/no-go基準を決定します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは初期探索のプロセスに組み込まれており、ターゲットバリデーションを可能にすることで、リード化合物の同定および抗バイオフィルム戦略の前臨床評価に役立てることができます。
- 発見生物学：バイオフィルム代謝の機能的出力としてALPを測定することにより、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：マイクロタイタープレートを用いた化合物ライブラリーのスクリーニングに適した、再現性のある定量的なリードアウトを提供します。
- 分析学：処理群と対照群の統計的比較を可能にするキネティクスおよびエンドポイント測定を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：酵素活性をバイオフィルム形成および潜在的な治療介入に関連付けることで、バイオマーカー開発に寄与します。
- 企業的な再利用：複数のプロジェクトにわたる微生物バイオフィルム中の細胞外酵素研究のための、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：バイオフィルムにおけるALPの役割に関するメカニズム的な曖昧さを軽減することで、ターゲット検証における予測の信頼性を向上させる。
- 運用の価値：シンプルな比色読み取りにより、標準化、感度、および再現性を提供する。
- 戦略的価値：バイオフィルムとの明確な表現型的な関連を持つALPモジュレーターの迅速なスクリーニングを可能にし、資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：ターゲットの変調を抗バイオフィルム効果に結びつけることで、リスク調整後の推進決定を支援する。
実施上の考慮事項
- S. aureusの無菌的なバイオフィルム培養および取り扱いのための、基礎的な微生物学の専門知識が必要です。
- 405 nmの吸光度測定が可能な96ウェルプレートリーダーへのアクセスに依存します。
- 信頼性の高い比較を行うためには、ウェル間およびプレート間でのバイオフィルム形成条件の標準化が必要です。
- 他の細菌種や細胞外マーカーに拡張する場合、最適化の検討が必要となります。
- 背景吸光度の制御や、NaOHによる適切な反応停止の確保など、実用上の制限が含まれます。
