ガラスマイクロピペットを用いて局所ATP吐出による血管応答を研究する生体内3次元2光子顕微鏡検査
2019年6月7日
ガラスマイクロピペットと高速2光子ハイパースタックイメージング法を用いて最適化された局所突出手順を提示し、毛細血管の直径変化の精密な測定と3次元での調節の調査を可能にします。
このプロトコルは、ATPの局所的な放出によって引き出される脳毛細血管におけるゆっくりとした血管応答を研究するように設計されている。この技術の利点は、局所ピペット放出による局所シナプス活動をシミュレートし、3D 2光子顕微鏡でスキャント容器に焦点を当て続けることです。この方法はまた、脳神経腫と休息時のグリア活性を研究し、3次元の刺激に使用することができます。手順のデモンストレーションはマイケルLになります
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本研究では、ATPを局所的に注入するためのガラスマイクロピペットと、高度な2光子ハイパースタックイメージングを用い、脳毛細血管の血管反応を調査する新しい手法を提示します。この手法により、局所的なシナプス活動を模倣した、毛細血管径の三次元的な変化の精密な測定が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 血管生物学
- イメージング技術
背景
- 局所的な噴出技術により、シナプス活動を模倣することが可能です。
- 三次元イメージングは、微小血管へのフォーカスに有用です。
- 血管反応の理解は、神経科学研究において極めて重要です。
研究目的
- 毛細血管における緩徐な伝導性血管反応を調べる。
- 局所的なATP放出が血管動態に及ぼす影響を評価する。
- 脳神経腫およびグリア細胞の活性を研究するための手順を開発する。
使用した手法
- 局所的なATP放出にガラスマイクロピペットを使用した。
- 毛細血管の三次元イメージングに二光子顕微鏡を用いた。
- 刺激中の脳毛細血管に焦点を当てた。
主な結果
- この手法により、毛細血管径の変化を詳細に観察することが可能です。
- 血管調節および刺激に対する反応についての知見が得られました。
- グリア細胞の活動をさらに理解するための可能性が示されました。
結論
- 本研究は、神経血管相互作用を研究するための新しい手法を提示します。
- 得られた結果は、血管反応およびシナプス活動のメカニズムに関する知見となる可能性があります。
- 脳におけるグリア細胞および血管機能の理解に寄与します。
よくある質問
業界における重要性
この手法により、局所的なATP放出に反応した毛細血管径の変化を三次元的に精密に測定することが可能となり、神経血管カップリング機構を研究するための生理学的に妥当なモデルが提供されます。局所的なシナプス活性を模倣し、大脳毛細血管における伝導性血管反応を捉えることで、血管調節が薬剤の送達および有効性に影響を与えるCNS創薬における標的バリデーションを支援します。本アプローチは、血管機能の定量的かつ再現可能なリードアウトを提供することで、前臨床モデルにおける血流調節に関する機序的仮説のリスクを低減します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲット検証
- 科学的価値： 脳毛細血管における神経血管カップリングおよびATP介在性シグナル伝達経路に関わる治療仮説を検証する。
- 実用的価値： 局所的なアゴニスト放出とリアルタイムの直径測定により、血管受容体およびイオンチャネルの機能的なターゲットバリデーションを可能にする。
- 予測的価値： 分子レベルの摂動を疾患に関連した三次元系での血管反応に結びつけることで、メカニズム的なリスク低減（de-risking）を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：ATPに対する血管反応性のベースラインを確立することで、後続の化合物スクリーニングに向けた検証済み生物学的システムの準備を行います。
- 定量的出力：ハイパースタック2光子イメージングのマキシマムインテンシティプロジェクション（最大強度投影法）により、正確で再現性のある毛細血管径の測定値を提供します。
- 拡張性と再利用性：最小限のプロトコル変更で、グリア細胞の活性、シナプス機能、および血管調節の研究にわたり、プラットフォームの再利用が可能です。
トランスレーショナル＆前臨床研究
- 疾患への関連性：神経変性疾患や虚血性疾患における低灌流を理解する上で不可欠な、毛細血管レベルでの伝導性血管反応をモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性：探索段階におけるメカニズムの洞察と、血液脳関門機能に影響を与える血管標的の前臨床検証を橋渡しします。
- リスク調整後の進展：生理学的に完全なネットワークにおける血管ダイナミクスへの標的結合効果を定量化することで、go/no-go判断に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット仮説の検証からリード最適化に至る創薬のプロセスに適合しており、特に血管反応が組織への曝露量および有効性を予測するCNS（中枢神経系）標的治療薬の開発において有用です。
- 探索生物学：局所的なATP放出および直径変化の読み取りを通じて、神経血管シグナリングに関与するGPCRおよびイオンチャネル標的の仮説検証を支援します。
- スクリーニング：三次元における毛細血管ダイナミクスに対する化合物の影響を評価するための、アッセイの標準化と再現性を可能にします。
- 分析：異なる条件や化合物処理間での比較を可能にする、定量的な血管反応指標を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：毛細血管レベルでの知見を、脳血流調節およびグリア-血管相互作用の前臨床モデルへと結びつけます。
- 企業での再利用：複数のプロジェクトにわたる神経血管メカニズムの継続的な調査に向けた、再利用可能なイメージングおよびマイクロインジェクションプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：神経活動と血管反応の間のメカニズム的な関連性の曖昧さを排除することで、ターゲット検証における予測の信頼性を向上させます。
- 運用の価値：ハイパースタックイメージングと精密なマイクロピペット投与により、標準化と再現性を高め、操作者によるばらつきを最小限に抑えます。
- 戦略的価値：血管ターゲットのリスクを早期に低減することを可能にし、脳への曝露不足による後期の失敗を減らすことで、資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：毛細血管伝導度および血流調節に対する検証済み効果に基づき、CNSターゲットのリスク調整済み優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 2光子顕微鏡法、マイクロマニピュレーション、およびin vivo血管イメージングの専門知識が必要です。
- ハイパースタック撮像および高速Z軸トラッキングが可能な波長可変レーザー走査型顕微鏡へのアクセスに依存します。
- 操作者および施設間でのATP放出パラメータおよび血管選択基準の標準化が必要です。
- 異なる動物モデル、血管床、および蛍光標識戦略への適応に関する検討が含まれます。
- マイクロピペット挿入中の血管フォーカスの維持という技術的課題、および術後の回復期間の必要性によって制限されます。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Title
0:57
Surgical Procedure: Tracheotomy
1:55
Surgical Procedure: Catheter Insertion
2:59
Surgical Procedure: Craniotomy
5:29
Two-photon Imaging
6:32
Insertion of the Glass Micro-pipette
9:11
Results: ATP Puffing by Micro-pipette Induces Vessel Dilation, followed by Constriction
10:30
Conclusion
![の開発と特性評価インビトロ微小血管ネットワークおよび内皮の定量的測定の[Ca 2+]私と一酸化窒素の生産](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
