Name: 樹状フィロポディアリッチ画の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 学ぶ 海馬ニューロン培養における樹状フィロポディアリッチ画の精製法。TLCNとビトロネクチンの親和性を活用し、貪食カップ様構造から未成熟シナプス関連タンパク質を同定する手法を解説します。

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海馬ニューロンの低密度培養に対する岡部茂雄氏と松野仁美さん、TLCN欠損マウスの三科正義さん、技術支援を受けた三井幸子さん、塩崎桃子さん、吉原研究室のメンバーに感謝の意を表します。.この作品は、JSPSカケンヒグラント・ノーズが支援しました。JP20700307、JP22700354、JP24500392、文部研日グラントNos.JP23123525からYFおよびJP20022046、JP18H04683、およびJP18H05146からYYへ。

ここに記載されているすべての方法は、理化学研究所和光の施設動物管理・使用委員会によって承認されています。
1. 海馬ニューロンの培養
<ol><li>培養培地の調製
	<ol>
<li>200倍のビタミンミックスの調製。Dパントテイン酸ヘミカルシウム塩の100mg、塩化コリン100mg、葉酸100mg、イノシトール180mg、ナイアシンアミド100mg、ピリドキサルHCl100mg、500mLのチアミンHClを100mgの磁性を使用して溶解する。溶液が完全に溶解するわけではありません。慎重に混合し、50 mLチューブでアリコートし、-20 °Cで保存します。</li>
		<li>リボフラビン溶液の調製。磁気攪拌機を用いて500mLの超純水にリボフラビン100mgを溶解する。溶液が完全に溶解するわけではありません。慎重に混合し、50 mLチューブでアリコートし、-20 °Cで保存します。</li>
		<li>1 M CaCl2の準備 .磁気攪拌機を用いて50mLの超純水にCaCl2・2H2 Oの7.35gを溶解する。</li>
		<li>最小必須培地(MEM)の調製。KClの400mg、NaClの6800mg、NaHCO3の2,200mg、NaH2 PO4~2H2Oの158mg、D-グルコースの7000mg、および950mLの超純水のMgSO4-7H2Oを950mLの超純水で溶解する。</li>
		<li>磁気撹拌機に一定の攪拌を伴う1mLピペを用いて、1M CaCl2の1.8mLをMEMに滴下方法で滴下する。MEMのpHを1モル/L HClでpH 7.25に調整します。</li>
		<li>MEMに200倍のビタミンミックスの5 mLとリボフラビン溶液の200 μLを追加します。溶液の体積を超純水で1,000mLに調整します。0.22 μmフィルターシステムを使用して溶液をろ過し、4°Cに保存します。</li>
		<li>10倍DNase-Iストックソリューションの準備。ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)の12.5 mLでDNase-Iの100mgを溶解し、0.22 μmフィルターを通して濾過し、1.5 mLチューブでアリコートし、-20°Cでチューブを保存します。</li>
		<li>シトシンβ-D-アラビノフラノシド(Ara-C)ストック溶液の調製。8.93 mLの超純水(最終濃度10mM)でAra-Cの25mgを溶解し、0.22 μmフィルターを通して濾過し、1.5mLチューブにアリコートを入れ、-20°Cで保存</li>
		<li>めっき媒体の調製。MEMアミノ酸溶液の1mL、1M HEPESの750 μL、B27の1mL、200mMグルタミンの125μL、ペニシリン/ストレプトマイシンの250μL、2.5mLの胎児ウシ血清(FBS)、および44.375 mLのMELチューブを混合する。</li>
		<li>ストップ培地の調製。MEMアミノ酸溶液1mL、1M HEPESの750 μL、FBSの5mL(最終10%)、および50mLチューブにMEMの43.25 mLを混合します。</li>
	</ol></li>
	<li>ポリL-リジンコーティングされた料理の調製
	<ol>
<li>ポリL-リジンヒドロブロマイドの0.2 mg/mLで35mmプラスチック細胞培養皿を25°Cで1日塗ります。 注:ポリ-L-リジンは、ポリ-L-リジンヒドロブロミドの代わりに使用しないでください。</li>
		<li>2mLの超純水で3回洗います。使用するまで25°Cでストップ媒体の1.5 mLで皿をインキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>マウス胚からの海馬ニューロンの解剖
	<ol>
<li>海馬ニューロンの組織源。Lu et al.19の方法に従って、胚性16-17日目に野生型およびTLCN欠損C57BL6/Jマウスから海馬を解剖する。</li>
		<li>15 mM HEPESを含むHBSSで0.25%トリプシンと1x DNaseIで解剖した海馬を3分毎に攪拌して37°Cで15分間pH 7.2を加分し、溶液を取り除きます。10mLのSTOP培地で海馬をインキュベートし、4°Cでトリプシンを5分間不活性化させる。</li>
		<li>海馬を新鮮なSTOP培地の10mLに移動し、4°Cでインキュベートし、新鮮なSTOP培地の10 mLに移動し、さらに5分間4°Cでインキュベートする。mLチューブ。1 mLピペを使用して20回ピペッティングすることにより、海馬を単離ニューロンに解離する。 注:1 mLピペットの先端は、海馬の解離中に15 mLチューブの底部にわずかに触れます。</li>
		<li>めっき媒体の9 mLを追加し、50 mLチューブに70 μmセルストレーナーを通してフィルタリングします。ヘモサイトメーターを使用して細胞数を数え、めっき培地で3.5 x 104セル/mLに調整します。</li>
		<li>ポリL-リジンコーティングされた料理からSTOP培地を吸引。ポリL-リジンコーティングされた皿に7 x 104セル/皿(2 mL/皿)でセルをプレートします。</li>
		<li>37°Cで5%CO2以下のインキュベーションを60〜64時間後、ニューロンにAra-Cストック溶液(最終10μM)の2μLを加え、ゆっくりと皿を振ります。培養物は、培養物を5%CO2以下の37°Cで変えずに加湿箱に入れたままにしておきます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 樹状性フィロポディアリッチ画分の精製
<ol><li>インビトロ(DIV)で13日後、培養ニューロンを含む20皿に磁気ポリスチレンマイクロビーズ(3 x 106粒子/皿)を添加する。1日後、培地および非結合マイクロビーズを除去するために攪拌3回でPBSの1 mLでニューロンを洗浄する。PBSを除去した後、500 μL/皿のライシスバッファー(0.01%トリトンX-100、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテルを含むPBS)でニューロンをlyseします。</li>
	<li>細胞スクレーパーでライサートを収集し、低タンパク質結合マイクロチューブ(10チューブ)にリザートを移動します。磁石セパレータにチューブをセットし、1分間待って上清を収集し、銀染色とウェスタンブロット分析のための非結合分画として使用します。</li>
	<li>ビーズを新しい低タンパク質結合マイクロチューブに移し、磁気セパレータにセットし、上清を完全に除去する。500 μLのリシスバッファーを追加し、15 s. 磁石セパレータにチューブを設定し、1分間待って、上清を取り除き、500 μLのリシスバッファーを追加します。ビーズの洗浄を10回繰り返し、上清を取り除きます。</li>
	<li>ビーズに結合した溶質タンパク質(結合分画)を1x SDSサンプルバッファー(62.5 mMトリスHCl、pH 6.8、2.5%SDS、および10%グリセロール)の50 μLを添加し、チューブを98°Cで5分間沸騰させ、チューブを860 x gで10°sに設定し、チューブを860 x gで沸騰させます。1分間の磁気セパレータ上に上清を収集し、結合分数として使用します。 注:プロトコルはここで一時停止できます。</li>
	<li>BCAタンパク質アッセイによる非結合分画および結合画分のタンパク質濃度を測定します。ブロモフェノールブルーでタンパク質溶液を可視化し、SDS-PAGEの濃度を5ng/μLに調整します。</li>
</ol>3. 銀染色とウェスタンブロット分析
<ol><li>5~20%のグラデーションゲルを使用して、SDS-PAGEでバインド分数と非連結分数(50ng)を分離します。ゲルを銀染色します。</li>
	<li>抗TLCN-C(1/3,000)、抗ウシビトロネクチン(1/5,000)、抗アクチン(1/1,000)、抗αチューブリン(1/1,000)を一次抗体として使用し、HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(1/500)を用いたウェスタンブロット。化学発光ウエスタンブロッティング検出試薬と化学発光イメージャーを用いて抗原を可視化する。</li>
</ol>

<ol><li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li>
<li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li>
<li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+formation+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683(2012).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+proteome%2C+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li>
<li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li>
<li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin+slows+spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li>
<li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li>
<li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li>
<li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin%3A+a+neuronal+area+code+molecule%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Telencephalin: a neuronal area code molecule?</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li>
<li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li>
<li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li>
<li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li>
<li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27(2018).</li>
<li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density%2C+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
<li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li>
<li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

細胞接着分子TLCNと細胞外マトリックスタンパク質ビトロネクチンとの親和性を用いた樹状フィロポディアリッチ画分の精製方法を開発した。PSD画分と比較して、樹状フィロポディアが豊富な画分から未熟なシナプスに作用するシナプスタンパク質を同定することができる。したがって、樹状フィロポディア富率の構成成分は、74%によってPSD画分のものと異なる。PSD分画とは異なり、培養海馬ニューロンを用いて食細胞カップを積極的に形成し、細胞は生きている必要があります。食細胞性カップを形成するために、TLCNとビトロネクチンの相互作用を用いた。TLCN式はテレスファロンでは限られている。したがって、小脳由来の培養ニューロンは使用できません。しかし、ビーズを異なるタンパク質でコーティングすれば、この活性依存性精製法を小脳ニューロンに適用することができます。例えば、グルタミン酸受容体delta2コーティングマイクロビーズのN末端ドメインが小脳顆粒細胞に適用されると、結合タンパク質からシナプス前ニューレキシンおよびcbln1が同定された。したがって、コーティングタンパク質が変化した場合、この活性依存性法を用いることができる。ビトロネクチンコーティングされたマイクロ...

樹状フィロポディアは脊椎の前駆体であると考えられている。樹状フィロポディアのアクチンフィラメントは、その延長と引き込みを調節する1,2,3.軸と接触した後、選択された樹状フィロポディアは脊椎に成熟を開始し、シナプスが形成され、4、5.脊椎の成分は、樹状密度画率6、7の包括的な分析から決定されたが、樹状フィロポディアの成分はほとんど知られていない。テレスファリン(TLCN)、ERM、SynGAP、Ras、PI3キナーゼ、Akt、mTOR、ポロ様キナーゼ2、CaMKII、シンデカン-2、パラレミン-1、ARF6、およびEphBBがデンドリックフィロポダイヤ形成5、8、9を調節することが示されている。 ,10,11, 樹状フィロポディアに存在する分子の包括的な分析のための方法が開発されていない間.
TLCN(ICAM-5)は、最もrostral脳セグメントにおける脊椎ニューロンによって特異的に発現され、テレスファロン12である。TLCNは、その細胞外領域に9つのIg様ドメイン、膜領域、および細胞質尾13を有する。TLCNは、その細胞外領域におけるビトロネクチン(VN)およびLFA-1インテグリンに結合し、その膜領域におけるプレセニリンに、そして細胞質領域5、8、14、15におけるホスホ-ERMおよびα-アクチニンに結合する。 、16.TLCNは、脊椎および樹状シャフト8、16の樹状フィロポディアおよびα-アクチニンの先端にリン-ERMを介してアクチン細胞骨格に結合する。
我々は、TLCNの過剰発現が樹状フィロポディア形成を増強し、フィロポディア10への脊椎の復帰を誘導することを示した。TLCN細胞質領域に結合したエズリンの構成活性形態と高められた樹状フィロポディア形成8.したがって、TLCNは、アクチン結合タンパク質を介して樹状フィロポディア形成を調節する。Esselensらは、マイクロビーズが培養ニューロン17にTLCN蓄積を誘導することを実証した。我々は、TNコーティングされたマイクロビーズの周りの神経デンドライト上に、TLCN依存的な方法15で食細胞性カップ構造が形成されることを示した。樹状フィロポディアの成分は、食中毒カップのものと類似しています。樹状フィロポディアを採取することは困難ですが、磁気マイクロビーズを使用して食中毒カップを収集することは比較的容易です。そこで、樹状フィロポディア18の代わりに食細胞性カップを精製する方法を開発した。ここでは、樹状フィロポディアが豊富な画分の精製方法について説明する。

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mLl 低結合 MCT</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39640T</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>2530149</td><td></td></tr><tr><td>35 mm プラスチック細胞培養皿</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-actin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alpha-Actinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5044</td><td></td></tr><tr><td>反α-チューブリン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>T-9026</td><td></td></tr><tr><td>反エズリン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>clone3C12, SAB4200806</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Galphaq</td><td>Santacruz</td><td>sc-393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Chemicon</td><td>clone AP20, MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Moesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>clone 38/87, M7060</td><td></td></tr><tr><td>抗PLCbeta1</td><td>Santacuz</td><td>sc-5291</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSD95</td><td>MA2 ABR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Spectrin beta</td><td>Chemicon</td><td>MAB1622</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Thermo</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Merck</td><td>1.08122.0005</td><td></td></tr><tr><td>カルシウムクロリド、含水</td><td>和光</td><td>038-19735</td><td></td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>ファルコン</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>ファルコン</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>塩化コリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>完全EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>シトシンβ-D-アラビノフラノシド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>C-6645</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>D-パントテン酸 ヘミカルシウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 マグネット</td><td>サーモ</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ECL プライムウェスタンブロッティング検出試薬</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>e-PAGEL 5-20% SDS-PAGE グラジエントゲル</td><td>ATTO</td><td>E-T520L</td><td></td></tr><tr><td>葉酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG Jackson</td><td>ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>i-Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td></td></tr><tr><td>LAS-1000 mini</td><td>富士フイルム</td><td>LAS-1000 mini</td><td>WB膜からの発光検出用</td></tr><tr><td>磁性ポリスチレンマイクロビーズ</td><td>Sperotech</td><td>PM-20-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM アミノ酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11130-051</td><td>30 mM L-アルギニン塩酸塩、5 mM L-シスチン、10 mM L-ヒスチジン塩酸塩-H2O、20 mM L-イソロイシン、20 mM L-ロイシン、19.8 mM L-リジン塩酸塩、5.1 mM L-メチオニン、10 mM L-フェニルアラニン、20 mM L-スレオニン、2.5 mM L-トリプトファン、10 mM L-チロシン、20 mM L-バリン</td></tr><tr><td>ミニスラブサイズ電気泳動システム</td><td>ATTO</td><td>AE-6530</td><td></td></tr>ナイ<tr><td>アシンアミド</td><td>Σ-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOPホスファターゼ阻害剤カクテル</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-リジン臭化水素酸塩</td><td>Nacali</td><td>28360-14</td><td></td></tr>ピ<tr><td>リドキサールHClΣ-Aldrich</td><td></td><td>P6155</td><td></td></tr><tr><td>リボフラビン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9504</td><td></td></tr><tr><td>シルバーステイン2キット 和光</td><td></td><td>291-5031</td><td></td></tr><tr><td>チアミンHCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>トランスブロット SD セミドライトランスファーセル</td><td>Bio-rad</td><td>1703940JA</td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td>MilliQ</td><td></td><td>超純水製造用</td></tr></tbody></table>

樹状フィロポディアリッチ画の精製

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

樹状フィロポディアは、アクチンフィラメントに基づいて薄く長い突起であり、それらは、ターゲット軸を検索するかのように拡張し、後退します。樹状フィロポディアが標的軸線との接触を確立すると、それらは脊椎に成熟し始め、シナプスの形成につながる。テレンセファリン(TLCN)は樹状フィロポディアに豊富に局在し、徐々に脊椎から除外される。培養海馬ニューロンにおけるTLCNの過剰発現は、樹状性フィロポディア形成を誘導する。我々は、テレスファリンが細胞外マトリックス分子、ビトロネクチンに強く結合することを示した。ビトロネクチンコーティングマイクロビーズは、神経デンドライト上の食器細胞性カップ形成を誘発した。食細胞カップでは、TLCN、リン酸化エズリン/ラジキシン/モエシン(ホスホ-ERM)、F-アクチンなどのTLCN結合タンパク質が蓄積され、食中毒カップの成分が樹状フィロポディアのものと類似していることを示唆している。そこで、樹状フィロポディアの代わりに食細胞性カップを精製する方法を開発した。磁気ポリスチレンビーズは、海馬ニューロンの培養培地に豊富に存在し、神経デンドライト上の食細胞性カップ形成を誘導するビトロネクチンでコーティングされた。インキュベーションの24時間後、ファゴサイトカップを洗剤で軽度に可溶化し、磁石セパレータを用いて回収した。ビーズを洗浄した後、結合タンパク質をタンパク質をタンパク質をタンパク質をタンパク質でタンパク質にして、銀染色およびウェスタンブロッティングにより分析した。結合画分では、TLCNおよびアクチンが豊富に存在していた。さらに、画分から同定された多くのタンパク質は樹状フィロポディアに局在した。したがって、結合分数を樹状フィロポディアリッチ画として命名した。この記事では、樹状フィロポディアリッチ画の精製方法に関する詳細について説明します。

培養海馬ニューロンにおいて、TLCNは樹状フィロポディア、シャフト、およびソマに豊富に局在し、F-アクチンと共局所化した(図1A、B)。培養海馬ニューロンにポリスチレンマイクロビーズを添加すると、ビーズは培養培地中の胎児ウシ血清(FBS)由来のビトロネクチン(VN)で自動的に被覆された。彼らは主にデンドライトに結合し、彼らは咽末カップの形成を誘導した(図1B-E)。ファゴサイトカップは、デンドライト上のマイクロビーズの周りのシート状のアクチンフィラメントに基づいていました。TLCN、ホスホ-ERM、およびPI(4,5)P2は、樹状フィロポディアのマーカーであり、ビーズの周りに高度に蓄積されている(図1D)8、15。<sup class="...

このプロトコルでは、樹状性フィロポジア間の特異的かつ強い親和性を利用して、培養海馬ニューロン上の食中毒カップ様突起構造から樹状フィロポジアが豊富な画分を精製する方法を紹介する。接着分子、TLCN、および細胞外マトリックス分子、ビトロネクチン。

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

PSD画分と比較して、樹状性フィロポディアリッチ分画の周りの未熟シナプスに作用するシナプスタンパク質を同定することができる。私たちは、貪食性キャップ形成を誘導するために生きたニューロンを使用しました。この技術の主な利点は、人工起源における活性タンパク質が樹状性フィロポディアリッチな画分から同定できることである。始めるには、100mgのビタミンB5、100mgのコリンクロライド、100mgの葉酸、180mgのI-イノシトール、ビタミンB3100mg、ビタミンB6塩酸塩100mg、および100mgのチアミン塩酸塩を500mgの超純水系水質物酸塩に溶解させて200xビタミンミックスを調製します。50mlチューブにアリコートを慎重に混ぜ、摂氏20度で保存します。リボフラビン溶液を調製するには、磁気攪拌機を用いて500mgの超純水に100mgのリボフラビンを溶解する。50mlチューブにアリコートを慎重に混ぜ、摂氏20度で保存してください。1モルの二塩化カルシウムを調製するために、磁気攪拌機を用いて50mlの超純水に塩化カルシウム二水和物7.35グラムを溶解する。最小必須培地調製のために溶解する塩化カリウムの400mg、塩化ソドゥムの800mg、2、200mgの重炭酸ナトリウム、158mgのリン酸ナトリウム単塩基二水和物、7、000mgのD-グルコース、および200mgの硫酸ヘプタ水和物、および950mlの超純水を使用して、アパラメを用いた。次に、磁気攪拌機に一定の攪拌を伴う1mlピペットを使用して、滴下方式で1.8mlの二塩化カルシウム1.8mlをMEMに加えます。次に塩酸を加え、MEMのpHをpH7.25に調整します。次に、5 ml の 200x ビタミンミックスと 200 マイクロリットルのリボフラビン溶液を MEM に加えます。溶液の体積を超純水で1000mlに調整します。0.22ミクロンのフィルターシステムを使用して溶液をフィルターし、摂氏4度で保存します。10x DNase-1ストック溶液を調製するために、100mgのDNA-1をHBSSの12.5mlに溶解する。0.22ミクロンのフィルターを通してフィルター、1.5 mlの管のアリコート、および20°Cで管を貯える。Ara-Cストック溶液調製用に8.93mlの超純水に25mgのAra-Cを溶解する。0.22ミクロンのフィルター、1.5mlチューブのアリコートを通してフィルターし、摂氏20度で保存します。メッキ培地を調製するには、1mlのMEMアミノ酸溶液、1モルHEPESの750マイクロリットル、B27の1ml、200ミリモルグルタミンの125マイクロリットル、ペニシリンストレプトマイシン250マイクロリットル、2.5mlの胎児牛血清、および44.375mlのMEM mlで混合する。停止培地を調製するために

purification-of-the-dendritic-filopodia-rich-fraction

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このビデオ、記事では、の単離および精製のための方法を提示...

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学ぶ 海馬ニューロン培養における樹状フィロポディアリッチ画の精製法。TLCNとビトロネクチンの親和性を活用し、貪食カップ様構造から未成熟シナプス関連タンパク質を同定する手法を解説します。

樹状フィロポディアリッチ画の精製

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