細胞外マトリックスヒドロゲルを用いた正常組織放射線効果の研究
July 24th, 2019
このプロトコルは、ex vivo照射後のマウス乳酸パッドの脱細胞化およびその後のヒドロゲル形成のための方法を提示する。
このプロトコルは、放射線がマウス乳腺脂肪パッドにおける脂肪組織の細胞外マトリックス特性に影響を与えることを示している。脱細胞化モデルにおける放射線の添加は、これまで行われなかった。この技術は、それぞれが脱細胞化プロセスで独自の化学的目的を果たすいくつかの洗浄ステップを使用しています。
この技術の特異性は、より優しい化学薬品の化し、組織特性をよりよく維持することを可能にする。乳癌再発は、特にトリプルネガティブ症例において、治療後に起こる。照射された細胞外マトリックスが腫瘍細胞の挙動をどのように変化させるかを評価することは、再発メカニズムに関する重要な発見につながる。
サンプルを照射した後、セシウム源を使用して、照射されたMFPと完全なRPMI培地をバイオセーフティキャビネットに移します。6センチまたは10センチメートルの皿に、MFPを水没させるのに十分なメディアを入してください。2日間、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。
まず、MFPを5ミリリットルのトリプシン-EDTA溶液で6センチメートルの皿に入れる。70%エタノールで皿をスプレーして拭き取り、摂氏37度で1時間インキュベートします。0.7ミリリットルのストレーナーを使用して、組織の上に3回水を注ぐことによって、脱イオン水でMFPを洗浄します。
鉗子を使用して、手動で、その間に組織をマッサージします。次に、繊細なタスクワイプでティッシュを簡単に乾燥させ、それを計量します。乾燥した組織をオートクレーブ前のビーカーに入れ、適切なサイズの攪拌棒を含み、組織のグラムあたり3%t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールの60ミリリットルで組織を覆う。
室温で1時間かき混ぜます。その後、ビーカーの内容をストレーナーにダンプします。ビーカーを脱イオン水ですすいで、これを組織に注ぎます。
このすすめプロセスをさらに2回繰り返し、鉗子を使用してリンスの間の組織を手動でマッサージしてください。この後、繊細なタスクワイプでティッシュを簡単に乾燥させ、重量を量る。組織と攪拌棒を同じビーカーに戻し、組織の1グラム当たり4%デオキシコール酸の60ミリリットルでそれらをカバーします。
室温で1時間かき混ぜます。次に、ビーカーの内容物をメッシュストレーナーにダンプし、ビーカーを脱イオン水ですすいで組織に注ぎます。このすすめプロセスをさらに2回繰り返し、鉗子を使用してリンスの間の組織を手動でマッサージしてください。
繊細なタスクワイプですすった組織を簡単に乾燥させ、重量を量ります。乾燥した組織を同じビーカーに入れ、新鮮な脱イオン水と共に、1%ペニシリンストレプトマイシンを補う。ビーカーをパラフィンフィルムでしっかりと覆い、一晩摂氏4度で放置します。
翌日、ビーカーの内容物をストレーナーに排出し、繊細なタスクワイプでティッシュを短時間乾燥させ、計量します。次に、MFPを適切なサイズのスターバーと同じビーカーに入れます。4%エタノールと1グラムの組織あたり0.1%過酢酸を含む溶液の60ミリリットルで組織を覆います。
室温で2時間かき混ぜます。ビーカーの内容物を0.7ミリメートルのストレーナーにダンプします。鉗子を使用して、組織を手動でマッサージし、内容物をビーカーに戻します。
組織のグラムあたり1X PBSの60ミリリットルでそれをカバーすることによって、組織を洗浄します。室温で15分間かき混ぜます。この洗浄プロセス全体をもう一度繰り返します。
次に、ビーカーの内容物を0.7ミリメートルのストレーナーにダンプします。鉗子を使用して、ティッシュを手動でマッサージし、ビーカーに戻す。組織のグラム当たり60ミリリットルの脱イオン水で覆うことによって組織を洗います。
室温で15分間かき混ぜます。この洗浄プロセス全体をもう一度繰り返します。繊細なタスクワイプで洗浄された組織を簡単に乾燥させ、それを量ります。
組織と内容物をストレーナーにダンプし、鉗子を使用して手動で組織をマッサージします。内容物をビーカーに戻し、組織の1グラムあたり100%n-プロパノールの60ミリリットルで組織を覆います。室温で1時間かき混ぜます。
その後、繊細なタスクワイプでティッシュを短時間乾燥させ、重量を量ります。0.7ミリメートルのストレーナーに組織と内容物をダンプし、手動で組織をマッサージするために鉗子を使用しています。内容物をビーカーに戻し、組織のグラム当たり60ミリリットルの脱イオン水で覆って組織を洗います。
室温で15分間かき混ぜます。この洗浄プロセスを3回繰り返します。この後、繊細なタスクワイプでティッシュを簡単に乾燥させ、それを量ります。
ラベル付き15ミリリットルチューブに組織を移し、一晩でマイナス80°Cで凍結します。まず、浅い容器に液体窒素を充填します。冷凍庫からサンプルを取り出し、各凍結乾燥MFPの重量を量る。
モルタルにサンプルを1個入れ、極低温手袋を使用して乳鉢を液体窒素に保持する。次に、手持ちドリルに取り付けられた害虫を使用して、サンプルを粉砕する。1分間間隔でミルして進捗状況を確認し、手袋をはめた手を液体窒素から取り除きます。
すべてのサンプルに対してこの粉砕プロセスを繰り返し、各サンプルの間にエタノールでモルタルと害虫をスプレーして拭いてください。粉末サンプルを使用できる状態になるまで、マイナス80°Cで15ミリリットルチューブに保管してください。まず、冷凍庫からサンプルを取り出し、室温で解凍します。
サンプルが解凍されている間に、ペプシンを塩酸に混ぜてペプシン-HCL溶液を形成する。次に、サンプルパウダーとペプシン-HCL溶液を15ミリリットルチューブに加え、小さな攪拌棒を加え、48時間かき混ぜます。この後、5分間氷の上にチューブを置きます。
各サンプルに10倍のPBSを加え、最終溶液が1XPBSの濃度を有するようにする。次に、10%体積/体積、0.1モル水酸化ナトリウムを各溶液に加え、pH 7.4に達し、pH紙を使用して各溶液を個別に試験した。pH 7.4ゲル溶液を用いて、4T1細胞に標識したペレット化GFPおよびルシファーゼを、1ミリリットルのゲル溶液当たり500、000、000、000細胞のいずれかの濃度に再懸濁する。
16ウェルチャンバースライドのウェルに16マイクロリットルのゲルセル溶液を加え、37°Cで30分間インキュベートします。この後、完全なRPMI培地を100マイクロリットルずつ各ウェルに加えます。摂氏37度で48時間インキュベートを続けます。
次に、蛍光顕微鏡を用いて、519ナノメートルの励起波長と発光波長618ナノメートルで細胞を観察します。本研究では、細胞外マトリックスヒドロゲルを用いて、正常な組織放射線効果を研究する。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、DNAの核および他の痕跡の喪失を通じて、脱細胞化を確認するために使用される。
オイルレッドO染色は脂質含有量を評価し、脂肪形形態の保持を確認するために使用されます。ECMヒドロゲルのレオロジー特性は摂氏37度で評価される。貯蔵弾性率は、安定したヒドロゲル形成を示す、すべての条件の損失弾性率よりも高い。
4T1乳腺癌細胞に標識されたGFPおよびルシメラーゼは、次いでヒドロゲル中に封入される。細胞増殖は蛍光顕微鏡法により検査され、発光測定および生存性染色により、封入後48時間である。照射されたヒドロゲルは、腫瘍細胞増殖の増加傾向を示す。
ファロイジンコンジュゲートは、封入された細胞の中でF-アクチンを可視化するために使用される。ミル内に組織を配置する前にモルタルを冷却することを忘れないでください、暖かいモルタルは不完全な粉砕につながる可能性があります。n-プロパナルおよびペプシンを扱う場合は注意が必要であり、化学フードの下でn-プロパナルおよび他の脱細胞化剤のみを開いてください。
可能であれば、吸入の危険性があるので、化学フードの下でペプシンを量る。ECM組成は、照射および脱細胞化後に、質量分析法およびラマン分光法を用いて評価することができる。また、ECMヒドロゲルの繊維構造は走査型電子顕微鏡法により解析することができる。
この方法は、治療の結果として、腫瘍細胞だけでなく、免疫細胞だけでなく、放射線損傷を経験する組織に対する放射線の影響を調べるために拡大される可能性を秘めています。この脱細胞化技術により、研究者は、ほとんどの癌において重要な治療選択肢である放射線に続く組織の細胞外マトリックス特性を評価することができます。
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概要
このプロトコルは、in vitro放射線照射後のマウスの乳腺脂肪パッドの脱細胞化とその後のヒドロゲル形成の方法を提示します。この技術により、組織特性をより良く保存するためにより穏やかな化学的洗浄が可能となり、これは細胞外マトリックス特性に対する放射線の影響を研究する上で重要です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物学
- 腫瘍学
背景
- 放射線は脂肪組織の細胞外マトリックス特性に影響を与えます。
- 脱細胞化モデルはこれまで放射線を組み込んでいませんでした。
- 乳癌の再発は、特にトリプルネガティブ症例で重大な懸念事項です。
- 照射された細胞外マトリックスの影響を理解することで、再発メカニズムを明らかにできます。
研究の目的
- 放射線がマウスの乳腺脂肪パッドの細胞外マトリックスにどのような影響を与えるかを評価すること。
- 組織特性を保存する脱細胞化方法を開発すること。
- 照射された細胞外マトリックスが腫瘍細胞の挙動に与える影響を調査すること。
使用した方法
- 特定の洗浄ステップを含む脱細胞化プロトコル。
- マウスの乳腺脂肪パッドのin vitro放射線照射。
- 脱細胞化組織からのヒドロゲル形成。
- 放射線照射後の細胞外マトリックス特性の評価。
主要な結果
- このプロトコルはマウスの乳腺脂肪パッドを成功裏に脱細胞化します。
- 放射線は細胞外マトリックスの特性を変化させます。
- より穏やかな化学的洗浄により重要な組織特性が保存されます。
- 得られた洞察は乳癌再発に対処する戦略に情報を提供する可能性があります。
結論
- この研究は照射された脂肪組織を研究するための新しい方法を紹介します。
- 結果は腫瘍再発メカニズムのより良い理解につながる可能性があります。
- このアプローチはがん生物学のさらなる研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding how radiation alters the extracellular matrix in healthy breast tissue provides mechanistic insights into local tumor recurrence, a critical challenge in triple-negative breast cancer therapy. This method enables in vitro modeling of irradiated tissue microenvironments to de-risk target validation and assay development by linking ECM changes to tumor cell proliferation and cytoskeletal reorganization. It supports predictive confidence in preclinical models by capturing stromal contributions to therapy resistance and disease relapse.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how irradiated stromal ECM influences tumor cell behavior to clarify microenvironmental contributions to therapeutic resistance.
- Operational Value: Enables functional validation of stromal targets by assessing tumor cell proliferation and cytoskeleton organization in physiologically relevant hydrogels.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible hydrogels with quantifiable rheological and biochemical outputs for compound screening in irradiated microenvironments.
- Operational Value: Supports assay scalability and reuse through lyophilized ECM powder storage and controlled rehydration for consistent experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant stromal-tumor interactions post-radiation to evaluate mechanistic de-risking of therapeutic candidates.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by preserving native ECM architecture and composition after irradiation and decellularization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a tunable stromal platform that connects radiation-induced ECM changes to tumor cell phenotypes, informing lead identification and preclinical progression decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of stromal-mediated resistance mechanisms by enabling controlled comparison of irradiated versus non-irradiated ECM on tumor cell behavior.
- Screening: Delivers assay-ready hydrogels with measurable proliferation and cytoskeletal readouts for evaluating modulator effects in a standardized microenvironment.
- Analytics: Provides quantitative outputs including fluorescence intensity, luminescence, and rheological parameters to compare conditions and assess stromal impact on tumor phenotypes.
- Translational Research: Models stromal-tumor crosstalk in irradiated tissue to align with preclinical evaluation of agents targeting microenvironmental drivers of recurrence.
- Enterprise Reuse: Enables platform standardization through lyophilized ECM storage, allowing reproducible hydrogel generation across teams and timepoints for longitudinal stromal studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by modeling stromal contributions to tumor recurrence and reducing mechanistic ambiguity in irradiated microenvironments.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized decellularization, irradiation, and hydrogel formation steps with defined washing and reagent parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying stromal targets that modulate tumor cell behavior post-radiation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of therapeutics based on efficacy in irradiated stromal contexts that mimic clinical relapse scenarios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue decellularization, hydrogel handling, and fluorescence-based cell viability and cytoskeleton assays.
- Depends on access to irradiation equipment (e.g., cesium source), rheometers, and microscopy systems for proliferation and F-actin imaging.
- Necessitates cross-team standardization of tissue sourcing, irradiation dosing, and hydrogel preparation to ensure experimental consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other tissue types or stromal sources beyond murine mammary fat pads.
- Limited by the murine origin of the ECM, which may require validation in human-relevant stromal models for translational extrapolation.
