Name: 細胞外マトリックスヒドロゲルを用いた正常組織放射線効果の研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学ぶ、マウス乳腺脂肪体の脱細胞化とヒドロゲル形成による放射線影響評価法。乳がん再発メカニズム解明に貢献する、細胞外マトリックス特性を保存する新規プロトコルです。

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著者らは、GFPおよびルシフェラーゼ-4T1細胞を提供したローラ・L・ブロンサート博士に感謝し、エドワード・L・ラゴリー博士は1-([4-(ザイラゾ)xylyl]アゾ)-2-ナフトール染色、IVISおよび凍結性細胞使用のためのクレイグ・L・デュバル博士にアドバイスを提供した。使用。この研究は、NIH助成金#R00CA201304によって財政的に支援されました。

<ol><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The hallmarks of cancer.</a> Cell. 100 (1), 57-70 (2000).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2018%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li>
<li>Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery%3A+a+systematic+review+by+receptor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).</li>
<li>Miller, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+treatment+and+survivorship+statistics%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer treatment and survivorship statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).</li>
<li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li>
<li>Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+Following+Radiation+Therapy+in+Immunosuppressed+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).</li>
<li>Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+after+radiation+therapy%3A+Review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Radiation+Oncology%22%5BJournal%5D)">Wound healing after radiation therapy: Review of the literature.</a> Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).</li>
<li>Beachley, V. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+matrix+arrays+for+high+throughput+screening+and+systems+analysis+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function.</a> Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+metastases+obtained+by+culturing+colorectal+cancer+cells+on+tissue-specific+decellularized+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds.</a> Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).</li>
<li>Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+hydrogels+from+decellularized+tissues%3A+Structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function.</a> Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).</li>
<li>Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+and+ECM-like+materials+%E2%80%94+Biomaterials+for+applications+in+regenerative+medicine+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).</li>
<li>Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hydrogel+scaffold+from+decellularized+human+lipoaspirate%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate.</a> Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).</li>
<li>Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+derived+myocardial+matrix+as+an+injectable+scaffold+for+cardiac+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering.</a> Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).</li>
<li>Pouliot, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+naturally+derived+lung+extracellular+matrix+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).</li>
<li>Bonvillain, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Nonhuman+Primate+Model+of+Lung+Regeneration%3A+Detergent-Mediated+Decellularization+and+Initial+In+Vitro+Recellularization+with+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).</li>
<li>Brown, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Three+Methods+for+the+Derivation+of+a+Biologic+Scaffold+Composed+of+Adipose+Tissue+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).</li>
<li>Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+Hydrogels+from+Pulmonary+Extracellular+Matrix+for+3D+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).</li>
<li>Massensini, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration-dependent+rheological+properties+of+ECM+hydrogel+for+intracerebral+delivery+to+a+stroke+cavity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity.</a> Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).</li>
<li>Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+5+1+facilitates+cancer+cell+invasion+through+enhanced+contractile+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces.</a> Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).</li>
<li>Ahmadzadeh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+two-way+feedback+between+contractility+and+matrix+realignment+reveals+a+nonlinear+mode+of+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

ヒドロゲル形成のこの方法は、開始組織の量に大きく依存する。マウスMGPは小さく、脱細胞化プロセスは材料の大幅な減少をもたらす(表1)。プロセスは、最終的な収率を高めるために、より多くの複合機で繰り返すことができます。フライス加工は、材料の損失につながる可能性のあるもう一つの重要なステップです。他の人は低温ミルで成功を示していますが、このプロトコルは、手持ちのモルタルを介したフライス加工と害虫の付属品8、17を備えた電気ドリルに基づいています。これは、資本コストを削減し、材料損失を最小限に抑える利点がありますが、最終製品にばらつきを導入する可能性があります。
脱細胞性および脱脂質の確認に対する課題は、クライオスタット埋め込み培地中の脂肪組織を凍結することである。図2Aは、パラフィンに埋め込まれ、区分された未照化された複合機のH&E染色を示す。異なる核は、他の細胞との接合部の近...

癌は、アポトーシスを回避し、また遠方部位1に転移することができる細胞の過剰増殖によって特徴付げられる。乳癌は米国の女性の間で最も一般的な形態の1つであり、2018年には推定266,000人の新しい症例と40,000人の死亡が2018年2月に推定される。サブタイプを治療するのが特に積極的で困難なのは、エストロゲン受容体(ER)、プロゲステロン受容体(PR)、およびヒト表皮成長因子(HER2)を欠いているトリプルネガティブ乳癌(TNBC)である。放射線療法は、腫瘍切除術後の残留腫瘍細胞を排除するために乳癌で一般的に使用されるが、TNBC患者の13%以上はまだ原発性腫瘍部位3で再発を経験する。
放射線療法は、腫瘍切除と放射線の組み合わせが乳房切除術と同じ長期生存をもたらすため、転移および再発を緩和するのに有効であることが知られている4。しかし、最近、放射線治療は、免疫不全の設定5、6における原発性腫瘍部位への局所再発と関連することが示されている。また、線維化7を誘導することにより、放射線が正常組織の細胞外マトリックス(ECM)を変化させるのもよく知られている。したがって、腫瘍細胞行動を指示する場合の放射線誘発ECM変化の役割を理解することが重要である。
脱細胞組織は、疾患8、9を研究するためにインビトロモデルとして使用されている。これらの脱細胞組織は、ECM組成物を保持し、生体内ECM中の複合体を再要約する。この脱細胞組織ECMは、細胞増殖および機能10、11の研究に使用することができる再構成されたECMヒドロゲルを形成するためにさらに処理および消化することができる。例えば、脱細胞化ヒト脂肪吸引および心筋組織由来の注射用ヒドロゲルは、組織工学の非侵襲的な方法として役立ち、ブタ肺組織に由来するヒドロゲルをインビトロ試験方法として利用した。間葉系幹細胞の付着および生存率12,13,14.しかし、ECM特性に対する正常組織放射線損傷の影響は調査されていない。
ECMに由来するヒドロゲルは、インビボ現象のインビトロ研究の最大の可能性を秘めています。コラーゲン、フィブリン、マトリゲルを含むいくつかの他の材料が研究されているが、ECM13の組成を総合的に要約することは困難である。ECM由来ヒドロゲルを使用する利点は、ECMが特定の組織14、15に必要なタンパク質および成長因子を含むことです。腫瘍切除の間に正常組織の照射はECMに重大な変化を引き起こし、ECM由来のヒドロゲルはインビトロでこの効果を研究するために使用することができる。この方法は、疾患のインビトロモデルにおいてより複雑で正確になる可能性がある。
本研究では、マウス乳腺脂肪パッド(MMF)を放射線ex vivoに供した。MMFを脱細胞化し、プレゲル溶液にした。ヒドロゲルは、埋め込まれた4T1細胞、マウスTNBC細胞株で形成された。ヒドロゲル材料の再生特性を調べ、ヒドロゲル内で腫瘍細胞ダイナミクスを評価した。照射されたMMFから製造されたヒドロゲルは腫瘍細胞増殖を増強した。今後の研究では、治療後の癌再発の文脈で細胞細胞相互作用を研究するために他の細胞型を組み込む予定です。

<table><tbody><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン、スピゴット付きキューブ</td><td>VWR</td><td>16004-128-2</td><td></td></tr><tr><td>-メチルブタン</td><td>アルファ エーザー</td><td>19387-AR</td><td></td></tr> <tr><td>2000ex レオメーター</td><td>TA Instruments</td><td>10D4335</td><td>レオメーター</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1933-25G</td><td>-</td></tr><tr><td>カルセイン アセトキシメチル (カルセイン AM)</td><td>Molecular Probes, Inc.</td><td>C1430-D</td><td></td></tr><tr><td>-ルシフェリンホタル、カリウム塩</td><td>Biosynth化学&生物学</td><td>L-8820</td><td>(S)-4,5-ジヒドロ-2-(6-ヒドロキシ-2-ベンゾチアゾリル)-4-チアゾールカルボン酸カリウム</td></tr>塩 <tr><td>組織学用DPXマウンタン剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>06522-500ML-</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td> <td>14040133-Eosin-Y</td><td></td></tr> <tr><td>with Phloxine</td><td>リチャード・アラン・サイエンティフィック</td><td>71304</td><td>エオシン</td></tr><tr><td>・エチジウム・ホモダイマー</td><td>モレキュラープローブ株式会社</td><td>E1169</td><td>ethidium homodimer-1 (EthD-1)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926-500ML-Fisher</td><td></td></tr> <tr><td>Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>クライオスタット埋め込み培地</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>水性封入剤</td></tr><tr><td>FreeZone 4.5</td><td>Labconco</td><td>7751020</td><td>凍結乾燥機</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液 (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>青色蛍光色素</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-500ML-IVIS</td><td></td></tr> <tr><td>Lumina III</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td>生物発光イメージングシステム</td></tr><tr><td>Kimtech Science</td><td>Kimwipes Kimberly Clark</td><td></td><td>デリケート タスク ワイプ</td></tr><tr><td>n-プロパノール (過酸化物フリー/シーケンシング)、Fisher BioReagents</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1130-500-Oil</td><td></td></tr> <tr><td>Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625-25G</td><td>1-([4-(キシリルアゾ)キシリル]アゾ)-2-ナフトール</td></tr><tr><td>OPS Diagnostics CryoGrinder</td><td>OPS Diagnostics, LLC</td><td>CG-08-02-PBS</td><td></td></tr> <tr><td>(10X), pH 7.4</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>119-069-151</td><td>リン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td>豚</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胃粘膜由来</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td>ペプシン</td></tr><tr><td>過酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77240-100ML-Phalloidin-iFluor</td><td></td></tr> <tr><td>594 試薬 (ab176757)</td><td>abcam</td><td>ab176757</td><td>ファロイジンコンジュゲート</td></tr><tr><td>プロピレングリコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W294004-1KG-K-Richard-Allan</td><td></td></tr> <tr><td>Scientific Signature Series ブルーイング試薬</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7301L</td><td>ブルーイングエージェント</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Signature Series ヘマトキシリン 7211</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>7211-RPMI</td><td></td></tr> <tr><td>Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093-Nadium</td><td></td></tr> <tr><td>deoxycholate, 98%</td><td>フロンティアサイエンティフィック</td><td>JK559522</td><td>デオキシコール酸</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S5016</td><td>-</td></tr><tr><td>トリトンx-100</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>X100-100ML</td><td>t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25200-056-Whatman</td><td></td></tr><tr><td>定性的濾紙、グレード</td><td>4Whatman</td><td>1004-110</td><td>グレード4定性濾紙</td></tr><tr><td>キシレン(認定ACS)、フィッシャーケミカル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>X5-4</td><td>-</td></tr></tbody></table>

細胞外マトリックスヒドロゲルを用いた正常組織放射線効果の研究

Studying Normal Tissue Radiation Effects using Extracellular Matrix Hydrogels

放射線は、トリプルネガティブ乳癌患者のための療法です。健康な乳房組織の細胞外マトリックス(ECM)に対する放射線の影響と原発性腫瘍部位における局所再発におけるその役割は不明である。ここでは、マウスママリー脂肪パッドに由来するECMヒドロゲルの脱細胞化、凍結乾燥、および製造の方法を提示する。脱細胞化プロセスの有効性に関する結果が発表され、評価された。ヒドロゲルに封入されたGFP-およびルシフェラーゼ標識乳癌細胞は、照射ヒドロゲルにおける増殖の増加を示した。最後に、封入腫瘍細胞の細胞骨格組織を可視化するためにファロイジンコンジュゲート染色を用いた。我々の目標は、腫瘍細胞の挙動を研究するために、生体内乳房組織環境と放射線に対する応答を模倣するインビトロ研究のためのヒドロゲルを製造する方法を提示することである。

MMFは、図1Aに示す手順を用いて照射後に脱細胞化した。MMFの細胞内化(図1B)および細胞外化後(図1C)を示す。脱細胞化はヘマトキシリンおよびエオシン(H&amp;E)染色を用いて確認され、1-(4-(Xylylazo)xylyl)-2-ナフトール染色を用いて脂質含有量を評価した(図2)。ECMヒドロゲルの特性も37°C(図3)で評価した。貯蔵係数は、すべての条件の損失係数よりも高く、安定したヒドロゲル形成を実証した。
GFP-およびルシフェラーゼ標識4T1乳癌細胞をヒドロゲルに封入した。細胞増殖は、蛍光顕微鏡、生物発光測定、およびカプセル化後48時間の生存率染色によって調べた(図4)。照射されたヒドロゲルは、腫瘍細胞増殖の増加傾向を示した。ファロ...

このプロトコルは、ex vivo照射後のマウス乳酸パッドの脱細胞化およびその後のヒドロゲル形成のための方法を提示する。

Radiation is a therapy for patients with triple negative breast cancer. The effect of radiation on the extracellular matrix (ECM) of healthy breast tissue ...

このプロトコルは、放射線がマウス乳腺脂肪パッドにおける脂肪組織の細胞外マトリックス特性に影響を与えることを示している。脱細胞化モデルにおける放射線の添加は、これまで行われなかった。この技術は、それぞれが脱細胞化プロセスで独自の化学的目的を果たすいくつかの洗浄ステップを使用しています。この技術の特異性は、より優しい化学薬品の化し、組織特性をよりよく維持することを可能にする。乳癌再発は、特にトリプルネガティブ症例において、治療後に起こる。照射された細胞外マトリックスが腫瘍細胞の挙動をどのように変化させるかを評価することは、再発メカニズムに関する重要な発見につながる。サンプルを照射した後、セシウム源を使用して、照射されたMFPと完全なRPMI培地をバイオセーフティキャビネットに移します。6センチまたは10センチメートルの皿に、MFPを水没させるのに十分なメディアを入してください。2日間、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートします。まず、MFPを5ミリリットルのトリプシン-EDTA溶液で6センチメートルの皿に入れる。70%エタノールで皿をスプレーして拭き取り、摂氏37度で1時間インキュベートします。0.7ミリリットルのストレーナーを使用して、組織の上に3回水を注ぐことによって、脱イオン水でMFPを洗浄します。鉗子を使用して、手動で、その間に組織をマッサージします。次に、繊細なタスクワイプでティッシュを簡単に乾燥させ、それを計量します。乾燥した組織をオートクレーブ前のビーカーに入れ、適切なサイズの攪拌棒を含み、組織のグラムあたり3%t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノールの60ミリリットルで組織を覆う。室温で1時間かき混ぜます。その後、ビーカーの内容をストレーナーにダンプします。ビーカーを脱イオン水ですすいで、これを組織に注ぎます。このすすめプロセスをさらに2回繰り返し、鉗子を使用してリンスの間の組織を手動でマッサージしてください。この後、繊細なタスクワイプでティッシュを簡単に乾燥させ、重量を量る。組織と攪拌棒を同じビーカーに戻し、組織の1グラム当たり4%デオキシコール酸の60ミリリットルでそれらをカバーします。室温で1時間かき混ぜます。次に、ビーカーの内容物をメッシュストレーナーにダンプし、ビーカーを脱イオン水ですすいで組織に注ぎます。このすすめプロセスをさらに2回繰り返し、鉗子を使用してリンスの間の組織を手動でマッサージしてください。繊細なタスクワイプですすった組織を簡単に乾燥させ、重量を量ります。乾燥した組織を同じビーカーに入れ、新鮮な脱イオン水と共に、1%ペニシリンストレプトマイシンを補う。ビーカーをパラフィンフィルムでしっかりと覆い、一晩摂氏4度で放置します。翌日、ビーカーの内容物をストレーナーに排出し、繊細なタスクワイプでティッシュを短時間乾燥させ、計量します。次に、MFPを適切なサイズのスターバーと同じビーカーに入れます。4%エタノールと1グラムの組織あたり0.1%過酢酸を含む溶液の60ミリリットルで組織を覆います。室温で2時間かき混ぜます。ビーカーの内容物を0.7ミリメートルのストレーナーにダンプします。鉗子を使用して、組織を手動でマッサージし、内容物をビーカーに戻します。組織のグラムあたり1X PBSの60ミリリットルでそれをカバーすることによって、組織を洗浄します。室温で15分間かき混ぜます。この洗浄プロセス全体をもう一度繰り返します。次に、ビーカーの内容物を0.7ミリメートルのストレーナーにダンプします。鉗子を使用して、ティッシュを手動でマッサージし、ビーカーに戻す。組織のグラム当たり60ミリリットルの脱イオン水で覆うことによって組織を洗います。室温で15分間かき混ぜます。この洗浄プロセス全体をもう一度繰り返します。繊細なタスクワイプで洗浄された組織を簡単に乾燥させ、それを量ります。組織と内容物をストレーナーにダンプし、鉗子を使用して手動で組織をマッサージします。内容物をビーカーに戻し、組織の1グラムあたり100%n-プロパノールの60ミリリットルで組織を覆います。室温で1時間かき混ぜます。その後、繊細なタスクワイプでティッシュを短時間乾燥させ、重量を量ります。0.7ミリメートルのストレーナーに組織と内容物をダンプし、手動で組織をマッサージするために鉗子を使用しています。内容物をビーカーに戻し、組織のグラム当たり60ミリリットルの脱イオン水で覆って組織を洗います。室温で15分間かき混ぜます。この洗浄プロセスを3回繰り返します。この後、繊細なタスクワイプでティッシュを簡単に乾燥させ、それを量ります。ラベル付き15ミリリットルチューブに組織を移し、一晩でマイナス80°Cで凍結します。まず、浅い容器に液体窒素を充填します。冷凍庫からサンプルを取り出し、各凍結乾燥MFPの重量を量る。モルタルにサンプルを1個入れ、極低温手袋を使用して乳鉢を液体窒素に保持する。次に、手持ちドリルに取り付けられた害虫を使用して、サンプルを粉砕する。1分間間隔でミルして進捗状況を確認し、手袋をはめた手を液体窒素から取り除きます。すべてのサンプルに対してこの粉砕プロセスを繰り返し、各サンプルの間にエタノールでモルタルと害虫をスプレーして拭いてください。粉末サンプルを使用できる状態になるまで、マイナス80°Cで15ミリリットルチューブに保管してください。まず、冷凍庫からサンプルを取り出し、室温で解凍します。サンプルが解凍されている間に、ペプシンを塩酸に混ぜてペプシン-HCL溶液を形成する。次に、サンプルパウダーとペプシン-HCL溶液を15ミリリットルチューブに加え、小さな攪拌棒を加え、48時間かき混ぜます。この後、5分間氷の上にチューブを置きます。各サンプルに10倍のPBSを加え、最終溶液が1XPBSの濃度を有するようにする。次に、10%体積/体積、0.1モル水酸化ナトリウムを各溶液に加え、pH 7.4に達し、pH紙を使用して各溶液を個別に試験した。pH 7.4ゲル溶液を用いて、4T1細胞に標識したペレット化GFPおよびルシファーゼを、1ミリリットルのゲル溶液当たり500、000、000、000細胞のいずれかの濃度に再懸濁する。16ウェルチャンバースライドのウェルに16マイクロリットルのゲルセル溶液を加え、37°Cで30分間インキュベートします。この後、完全なRPMI培地を100マイクロリットルずつ各ウェルに加えます。摂氏37度で48時間インキュベートを続けます。次に、蛍光顕微鏡を用いて、519ナノメートルの励起波長と発光波長618ナノメートルで細胞を観察します。本研究では、細胞外マトリックスヒドロゲルを用いて、正常な組織放射線効果を研究する。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、DNAの核および他の痕跡の喪失を通じて、脱細胞化を確認するために使用される。オイルレッドO染色は脂質含有量を評価し、脂肪形形態の保持を確認するために使用されます。ECMヒドロゲルのレオロジー特性は摂氏37度で評価される。貯蔵弾性率は、安定したヒドロゲル形成を示す、すべての条件の損失弾性率よりも高い。4T1乳腺癌細胞に標識されたGFPおよびルシメラーゼは、次いでヒドロゲル中に封入される。細胞増殖は蛍光顕微鏡法により検査され、発光測定および生存性染色により、封入後48時間である。照射されたヒドロゲルは、腫瘍細胞増殖の増加傾向を示す。ファロイジンコンジュゲートは、封入された細胞の中でF-アクチンを可視化するために使用される。ミル内に組織を配置する前にモルタルを冷却することを忘れないでください、暖かいモルタルは不完全な粉砕につながる可能性があります。n-プロパナルおよびペプシンを扱う場合は注意が必要であり、化学フードの下でn-プロパナルおよび他の脱細胞化剤のみを開いてください。可能であれば、吸入の危険性があるので、化学フードの下でペプシンを量る。ECM組成は、照射および脱細胞化後に、質量分析法およびラマン分光法を用いて評価することができる。また、ECMヒドロゲルの繊維構造は走査型電子顕微鏡法により解析することができる。この方法は、治療の結果として、腫瘍細胞だけでなく、免疫細胞だけでなく、放射線損傷を経験する組織に対する放射線の影響を調べるために拡大される可能性を秘めています。この脱細胞化技術により、研究者は、ほとんどの癌において重要な治療選択肢である放射線に続く組織の細胞外マトリックス特性を評価することができます。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

細胞機能上の基層の剛性の影響をモデル化することができます...

アクリルアミド系ハイドロゲルを用いた細胞機能のマトリックスの剛性の影響を研究

このビデオでは、in vitro研究のためのex vivo照射後にマウスの乳腺脂肪パッドを脱細胞化することにより、細胞外マトリックスハイドロゲルを導出する技術について説明しています。このハイドロゲルは、放射線治療後のin...

乳腺脂肪パッドの脱細胞化:乳腺脂肪パッドからの細胞外マトリックスハイドロゲルの誘導

このビデオは、接着細胞の細菌感染に対する細胞外マトリックス(ECM)硬化の影響を研究するためのアッセイを示しています。さまざまな硬さのポリアクリルアミドハイドロゲルをコラーゲンで重ね合わせたマルチウェルプレートに重ね合わせることで、生理的ECMの硬さを模倣します。ヒト内皮細胞をハイドロゲル上に重ね合わせ、細胞内で蛍光タンパク質を発現するように設計されたリステリア菌を細胞に感染させると、フローサイトメトリーを使用して、硬いハイドロゲル上に存在する細胞内の内在する細菌と柔らかいハイドロゲル上に存在する細菌を比較します。...

細胞外マトリックスの硬直が細菌感染に及ぼす影響を研究するためのアッセイ

粒子追跡マイクロレオロジーは、3D腫瘍モデルにおける細胞外マトリックスの機械的特性の変化を非破壊的に定量化し、空間的にマッピングするために使用できます。...

粒子追跡マイクロレオロジーを用いて3次元腫瘍モデルにおける細胞外マトリックス剛性の縦測定

コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。...

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

これは、肺の細胞外マトリックスからの3次元細胞培養の足場を作成するための方法です。無傷の肺は、三次元での細胞の増殖を支持することができるヒドロゲルに加工されます。...

3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

このプロトコルは、cryogelation の技術で微細加工を統合することにより弾性三次元多孔体 microcryogels の作製をについて説明します。セルの読み込み、時に、容易に注入の生体内再生治療を容易にすることができますまたは高スループット薬剤スクリーニングの in vitroの配列に組み立てに 3 D...

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性をプロービングのためのウェル フォーマット...

付着性のセルの細菌感染症に及ぼす細胞外マトリックス剛性を勉強するためのウェル フォーマット ポリアクリルアミドを用いたアッセイ

本プロトコールは、調整可能な機械的特徴を有するヒドロゲルのハイスループット光架橋を容易にするカスタムメイドのUV照明装置を使用して、3Dマトリックス模倣培養における患者由来の膠芽腫細胞の化学療法応答に対する機械的および生化学的手がかりの効果を評価するための実験プラットフォームを記載する。...

ハイドロゲルアレイにより、3D腫瘍モデルにおけるマトリックス成分および治療薬の効果をスクリーニングするためのスループットの向上が可能

ここでは、腫瘍スフェロイドの迅速、堅牢、低コストな作製とそれに続くハイドロゲルカプセル化を可能にするプロトコルを紹介します。特殊な機器を必要としないため、広く適用できます。特に、スフェロイドとマトリックスの相互作用を探索したり、 in vitro 組織生理学や病理学モデルを構築したりするのに有用です。...

スフェロイド-マトリックス相互作用研究のためのポリエチレングリコールハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化

プロトコルは原産の牛のような肺のティッシュに加えられる2つの明瞭な脱cellularizationの方法を解明し、それぞれの性格描写の広範囲の記述を提供する。...

脱細胞化肺細胞外マトリックスハイドロゲルの開発と特性評価

学ぶ、マウス乳腺脂肪体の脱細胞化とヒドロゲル形成による放射線影響評価法。乳がん再発メカニズム解明に貢献する、細胞外マトリックス特性を保存する新規プロトコルです。

細胞外マトリックスヒドロゲルを用いた正常組織放射線効果の研究

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