ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成
August 28th, 2019
このプロトコルは、以前にインビトロで神経前駆体から数週間分化していたヒト幹細胞由来ニューロンを再中断および培養するための詳細な手順を説明する。この手順は、光顕微鏡検査および高含有量スクリーニングと互換性のある形式で、神経伝達物、シナプス、および後期発現ニューロンマーカーのイメージングベースのアッセイを容易にします。
このプロトコルは、高コンテンツスクリーニングアプリケーションのためのヒト多能性幹細胞由来ニューロンの使用を促進する。これは、シナプスをアッシングするために特に適しています, 人間のニューロンでは、長い培養期間を必要とします.我々は、その生存率を維持する方法で、大判皿からHCS適合のマルチウェルへのニューロンの再めっきを実証する。
直観的に、再懸濁・再めっきする前にプロテアーゼインキュベーションを拡張すると、ニューロンの生存率が向上することを示す。ヒト多能性幹細胞由来ニューロンは、基礎研究、医薬品開発、変性医療の分野でますます関連性が高まっています。この穏やかな滴定法は、プロセスの厚いネットワークを有する細胞の任意の大きな単層を再中断するために使用することができる。
ヒトiPSCに加えて、一次ニューロンの培養を再プレートしたり、ファクトソートや単一細胞シーケンシングのために再中断したりするために使用できます。プロトコルのステップを注意深く実行し、頻繁にプレートからニューロンの分離を媒介プロテアーゼを監視することが重要です。最適なインキュベーション時間は、培養によって異なる場合があります。
視覚的なデモンストレーションでは、経験の浅い調査員でもこの手順を再現できます。PBSで分化したニューロンのプレートをそっとすすめることから始めます。PBSをプレートの壁に分散させ、細胞に直接分散させ、それらを破壊しないようにします。
皿の端からPBSを吸引しながら、細胞に触れないように注意してください。10センチメートルプレートあたり少なくとも1ミリリットルのタンパク質分解酵素を塗布する。そして、40〜45分間培養器に細胞を戻す。
インキュベーション中に、段階的なコントラスト顕微鏡でニューロンをチェックし、ニューラルネットワークがプレートから完全に切り離されて分解し始めるまでプロテアーゼ処理を続けます。ニューロンが切り離されたら、プロテアーゼの1ミリリットルごとに新鮮なDEMEM培地を5ミリリットル加えることによって消化を止める。血清ピペットを使用して、細胞をプレートに対して5〜8回穏やかに拍子にし、圧力をかけすぎないようにします。
100マイクロメートルのメッシュを通して細胞を50ミリリットルの円錐形チューブにひずみ、滴下します。そして、新鮮なDMEMメディアの追加の5ミリリットルでストレーナーをすすいでください。ベンチトップの遠心分離機を使用して、細胞をGの1000倍に5分間回転させます。
遠心分離後、円錐管をバイオセーフティキャビネットに戻し、ほとんどの媒体を吸引し、細胞を湿らせたまま250マイクロリットルを残します。新鮮なDMEM培地の2ミリリットルで細胞を穏やかに再懸濁し、5ミリリットルの血清ピペットの端を通過します。最後に、チューブを2〜3回反転します。
生細胞を数えるためにヘモサイトメーターと三重青を使用してください。そして、所望の濃度にDMEM。特定の細胞株の要件に応じて、チューブに適切なサプリメントを追加し、コニカルチューブを2〜3回傾けることによって細胞を穏やかに混合します。
24ウェルプレートからラミニンコーティングを吸い上げ、PBSで一度すすいます。PBSを吸引する。そして、束を避けるために図8の動きの各井戸に細胞溶液を適用する。
細胞のめっきを終えたら、37°Cと5%の二酸化炭素に設定されたインキュベーターにプレートを戻します。初期細胞死レポーターのストックソリューションを簡単に渦液し、原稿の指示に従って井戸に追加します。20 分待ちます。
そして、ガラス底のマルチウェル上の生きている細胞と死んだ細胞をイメージします。プロテアーゼインキュベーションを延長すると、細胞の持ち上げられたシート内の神経ネットワークの緩みが可能になります。これは解離時に減少した細胞死をもたらすだけでなく、次の日にわたってより効率的な回復をもたらす。
拡張酵素インキュベーション手順を用いて、再めっき後の日における細胞生存率のおよその倍増と死細胞または死死細胞の密度の低下を示す。ニューロン分化の移行期は数日にわたって行われ、その間に細胞は徐々に後期のニューロンマーカーを発現する。これらのマーカーは、4週間の事前分化後に再入植された培養物で直ちに検出される。
拡張プロテアーゼプロトコルはまた、中程度に神経化物の伸びを増強する。全中性の長さと樹状突起の両方が改善される。再めっきはシナプスの研究にも役立ちます。
再めっきのわずか1週間後に、シナプス前およびシナプス後のタンパク質のマーカーが観察された。また、自発的な脱分極と相乗的に駆動される電流からの電気的活動は、カルシウムイメージングや多電極アレイを用いて検出可能である。この再めっき手順は、多くの種類の用途に適応することができる。
潜在的な治療化合物を同定するための高含有スクリーニングに加えて、イメージング成長コーンまたは多電極アレイ記録に使用することができる。すでに長いプロセスを形成しているニューロンの機械的解離はストレスです。細長い酵素インキュベーションと細胞の穏やかな滴定は、この手順の成功に不可欠なステップです。
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概要
このプロトコルは、in vitroで分化したヒト幹細胞由来ニューロンを再懸濁し培養する手順を概説しています。この方法は、ニューライト、シナプス、および神経マーカーのイメージングベースアッセイを可能にし、ハイコンテントスクリーニングアプリケーションに適しています。
主要な研究構成要素
科学の領域
- 神経科学
- 幹細胞生物学
- 細胞培養技術
背景
- ヒト多能性幹細胞由来ニューロンはシナプスの研究に不可欠です。
- これらのニューロンは成熟のために長期培養が必要です。
- 培養中の神経生存率を向上させることは正確なアッセイに不可欠です。
- この手順は再播種後の細胞回復と生存率を向上させます。
研究目的
- ヒト幹細胞由来ニューロンの信頼できる培養方法を作成すること。
- ハイコンテントスクリーニングのための効果的な再播種を実証すること。
- 細胞の健康を向上させるためのプロテアーゼ処理時間の最適化。
使用された方法
- ヒト多能性幹細胞由来ニューロンを含む細胞培養法。
- 細胞の優しい剥離のための詳細なプロテアーゼ処理を使用しました。
- プロトコル中のニューロン剥離を監視するための視覚的チェックを組み込みました。
- 培養と再播種プロセスの厳格なタイムラインに従いました。
- この方法は他の神経タイプとアプリケーションに適応可能です。
主要な結果
- 延長されたプロテアーゼ処理は神経生存を向上させ、細胞死を減少させました。
- 再播種後数日間でニューライトの成長と生存率の向上を示しました。
- 再播種の1週間以内にシナプス蛋白のマーカーが観察されました。
- 電気的活性が検出可能で、機能的な神経ネットワークを示しています。
結論
- この研究は、神経培養とアッセイ応用のための再現可能なプロトコルを提供します。
- 生存率の向上とニューライト成長は神経機能に関するさらなる研究を促進します。
- 結果は神経メカニズムと潜在的な治療的アプローチの理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Replating human pluripotent stem cell-derived neurons enables high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation within a compressed timeline, addressing the bottleneck of lengthy differentiation cycles in drug discovery. This approach supports scalable, reproducible assays for target validation and phenotypic screening in neurodegenerative disease models. By improving cell viability and preserving functional networks post-replating, the method enhances predictive confidence in early-stage compound evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through scalable assessment of neurite outgrowth and synaptic marker expression in human neurons.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation using late-stage neuronal markers such as NeuN and CTIP2.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid detection of compounds affecting neurite regeneration and synapse assembly within two weeks post-replating.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of uniformly distributed, viable neurons in 384-well formats for high-content imaging of neurite length and synaptic puncta.
- Operational Value: Ensures assay standardization through enzymatic dissociation and gentle titration, minimizing variability from mechanical stress.
- Scalability: Enables platform reuse across compound libraries and gene perturbation studies with consistent cell recovery and viability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant neuronal phenotypes from discovery through preclinical validation by preserving synapse maturation trajectories.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of pre- and post-synaptic protein expression and electrical activity as functional readouts for target engagement.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on quantitative neuritogenesis and synaptogenesis readouts prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The replating method bridges early discovery and preclinical workflows by providing a scalable neuronal model compatible with high-content screening timelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via quantitative imaging of neurite outgrowth and dendritic arborization.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized dissociation and replating in multi-well formats.
- Analytics: Enables comparison of conditions via measurable outputs such as total neurite length, dendrite growth, and synaptic protein signal intensity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through detection of spontaneous electrical activity and synaptically-driven currents post-replating.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal plating capability applicable across multiple assay types and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurite and synapse formation assays.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through defined protease titration and gentle resuspension steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by shortening the time-to-assay for mature neuronal phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on early-stage neuritogenesis and synaptogenesis efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell-derived neuronal culture and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to phase-contrast microscopy for monitoring neural network detachment during protease incubation.
- Necessitates standardized protocols for protease concentration, incubation time, and titration to ensure cross-lot consistency.
- Requires adaptation of coating and seeding densities when transitioning between different multi-well formats.
- Practical limitations include variability in optimal protease incubation time across cell lines and differentiation stages.
