茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

お茶は世界中で最も人気のある飲み物の一つです。殺虫剤は、時々害虫から茶の植物を保護するために使用されます。いくつかの全身農薬は、ティーツリーの酵素によってこのために作られるかもしれません。

そして酸化、加水分解、または還元反応によって統合される。植物細胞懸濁培養物は、農薬の植物代謝行動を研究しやすいものとして使用することができる。この方法には、いくつかの利点があります。

第一に、それは遊離微生物の条件で操作することができ、したがって、微生物によって引き起こされる農薬分解の干渉を回避する。第二に、それはいつでも私たちのために一定の材料を提供することができます。最後に、単一の実験で農薬行動の理論を比較するためにも簡単に使用できます。

本研究では、茶葉の可変色から茶細胞懸濁液培養を確立する。その後、細胞懸濁液の最適な培養状態を使用して、6つの農薬の散逸挙動を比較した。この実験は、ジャオ・ヴァイティングとゲ・グオチンによって行われます。

これは、外植の源として動作する私たちのお茶の無菌プランツです。はさみを使用して滅菌葉の真ん中の翼に沿ってカットします。そして、ペトリ皿の約0.3倍の0.3センチメートルの小片に各半分を細分化します。

2、4-DおよびKTを含むMS視覚媒体に無菌の外植物を置く。6つの外植木は300ミリリットルのフラスコに入れることができます。葉の外植を暗闇の中で摂氏25度の一定温度で培養する。28日後、第1世代のカルスを選択し、フレッシュフラスコに移します。

3~4個のサブカルチャーの後に、緩くて可変的なカルスを獲得します。無菌状態の下で生殖不能の外科用刃を使用して、固体媒体から大きなもの、可変的で緩いカルスを小片に切り取ります。私たちはカルスの小片の約3グラムです。

2、4-D、KTを含むB5にカルスを入れる。液体細胞懸濁液を暗闇の中で振るインキュベーターで一定温度で培養する。培養の7〜10日後、培養フラスコを取り除き、数分間放置します。ここで上清を取る堆積物は、新鮮な媒体に文化を強制します。

沈殿した大きなカルスを取り除く。各28日の4〜3回のサブ培養サイクルの後に、最終的に手入れの行き届いた細胞懸濁液培養を得る。生存細胞のサンプルを100°Cで100度、生存細胞として10分間保持し、生存細胞を染色する前にコントロール細胞として保管します。

遠心分離6,000 Gで8分間の細胞懸濁液培養を行い、上清を取り除いてから、細胞を5ミリリットルのPBSバッファーに懸濁し、手で1分間振ります。TTC溶液の2.5ミリリットルを追加し、再び手で振ります.摂氏13度で立っているインキュベーターで1時間混合物をインキュベートします。

400マイクロリットルのアリコートを追加して、すべてのネオニコチノイドサイアムエトキサム、アセチモプリド、イミダクロプリド、イミデプロキサーゼのストック溶液を殺菌します。すべて有機第一相に。ジメトエートとオメトエートをそれぞれ細胞懸濁培養液にする。

一定温度での殺虫剤を用いた細胞懸濁液の培養サンプル、および振度インキュベーター速度。異なる日にサンプルを取る。ネオニコチノイドを含む試料を試験するために、均質な細胞培養物の1ミリリットルのアリコートを除去する。

1.5ミリリットルのプラスチック遠心分離チューブに入れ、4,000 Gで2分間遠心分離します。HPLC-UVおよびUPLC QTOFによる分析の前に0.22マイクロメートルフィルター膜を通して上澄みを渡す。サンプルをテストするには、有機第1段階で継続します。

500マイクロリットルの細胞培養液を取り出し、35ミリリットル遠心管または1.5ミリリットルのプラスチック遠心分離管に入れる。500マイクロリットルサンプルの35ミリリットル遠心分離管に0.1グラムの塩化ナトリウムと5ミリリットルの抽出溶媒を加えます。混合物を1分間渦液。

そして、彼らが10分間休むことを許可します。上澄み2.5ミリリットルを10ミリリットルのガラスチューブに取り込み、摂氏14度の窒素蒸発器を使用してほぼ乾燥に蒸発させます。残渣を1ミリリットルアセトンで溶解する。

渦を1分間、GC-FPDによる分析前に0.22マイクロメートルのフィルター膜を通過させる。5つの植物を4リットルのプラスチックポットに15日間入れます。1ミリリットル当たり0マイクログラム、またはチアムエトキサムまたはジメトマエのミリリットル当たり100マイクログラムをそれぞれプラスチックポットに加えます。

前の方法に従って無傷の植物サンプルを準備し、予め浸漬し、Orbitrap質量分析法で分析します。HPLCUVを使用して、254ナノメートルの波長でチアムエトキサムとアセチモプリドの含有量と代謝産物を検出し、270ナノメートルでイミダクロプリドとイミドプロキサーゼを検出します。管状カラムを用いて、GC-FPDによるジメトエートおよびオメトエートの含有量を検出する。

炭素-18カラムを有するUPRC QTOFを用いて細胞培養中の殺虫剤の代謝物を検出する。UPLCオービットラップ質量分析を用いた試験プラント抽出物中の殺虫剤の代謝物を検出する。1つの無菌プランレットのカルスは、汚染の褐変が低いが、摘んだ茶葉からのカルスの誘導性が高い。

無菌葉に由来するカルスは常に明るい黄色がかったが、摘んだ葉に由来するカルスは茶色の斑点を有する白であった。KT濃度が1リットル当たり0.1ミリグラムであったとき、カルスは黄色がかった色で、テクスチャーが緩んでいた。カルスの成長率は最高で、2、4-Dの濃度が1リットル当たり1ミリグラムで、KTの濃度は1リットル当たり0.5ミリグラムであったとき、最大61.5%であった。

カルスの成長データは最高であり、カルスの成長率は最高46.9%に達したため、植物のホームントの最良の組み合わせは、茶体の成長のためのKTの1リットル当たり1ミリグラム、4-Dおよび0.1ミリグラムであった。カルスは第4のサブカルチャーによって葉を完全に覆い、サブカルチャーサイクルが28日だったとき。カルスは黄色がかった色とゆるい質感と褐変なしで激しく成長していました。

カルスの総データと細胞懸濁液の色を比較した後、B5液状媒体は細胞懸濁液培養に適した。細胞懸濁培養のOD値を細胞増殖量を表すために用いた。培養75日間で、40ミリリットル当たり15グラムの割合は、他の2つの比のそれよりも有意に高いOD値を有していた。

茶細胞懸濁液培養中の細胞生存率は、TTC染色法により試験した。無色のTTC化合物は、生細胞のミトコンドリアでデヒドロゲナーゼによって赤いフォルマジンに変換することができますが、死んだ細胞では色を変えることはできません。そして、これは茶細胞懸濁液培養を確立する全過程である。

これは、細胞懸濁液培養技術を用いた茶中の異なる農薬の代謝に関する初の比較研究である。いくつかの農薬代謝物が同定され、そのうちのいくつかはさらに保たれた茶の植物で調査された。この新しい方法は、お茶や他の植物の農薬代謝研究のモデルとして役立つ可能性があります。