Name: 画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: 学ぶ単一分子追跡の画像処理プロトコル。ImageJ、MATLAB、uTrackを用いて膜受容体の拡散係数とクラスター サイズを定量化し、細胞膜ダイナミクスを解析する方法です。

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我々 は拡散係数解析のヘルプとソース コード カルロ Manzo とマリア ・ ガルシア ・ Parajo に感謝しています。この作品は一部スペイン語科学省、イノベーションや大学 (SAF 2017-82940-R) からの助成金によって支えられた、セルバンテス ・ デ ・ サラッド カルロス 3 世 (RD12/0009/009 と RD16/0012/0006; の RETICS プログラムRIER)。LMM との JV は、フンダシオン一般 CSIC の COMFUTURO プログラムによってサポートされます。

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著者が明らかに何もありません。

この方法は、Matlab の使用経験がなくても実行する簡単です。しかし、Matlab ルーチンは非常に、さまざまなコマンドの名称とプログラムで採用されている別のフォルダーのローカライズ精度必要があります。追跡解析ルーチン (ステップ 3)、複数のパラメーターを変更することができます。「設定ガウス混合物モデルふさわしい」ウィンドウ (手順 3.8) U トラックがビデオの単一粒子を検出する方法を制御します。これは、3で説明したように、ガウス混合物モデル当てはめによる。このフィッティングの重要なパラメーターの 1 つは、極大を識別するためのフィルターを定義します。この操作の成功は、画像のコントラストとノイズ画像の存在に依存します。最初のパラメーター (ローカル バック グラウンドとの比較のアルファ値) は、スポットの識別中にノイズを低減する 2 番目の支援中の実際の場所をされているマキシマの自信を制御します。「追跡」の手順 (3.9) で重要なパラメーターはギャップを閉じるするフレームの数 (つまり、トラックは粒子は実際に見られないそれはこれらフレーム前に、これらのフレーム後; 0 の例で見ら...

脂質二重膜に埋め込まれる膜タンパク質は、熱拡散のための連続的な動きにあります。そのダイナミクスは、分子間相互作用は、オリゴマー、モノマーからサイズが異なります、シグナリング複合体の安定性に影響を与える複合体の形成を許可する細胞応答を調整することが不可欠。細胞生物学、シグナル伝達経路を理解し、予期しない細胞機能を識別するために必要な新たな挑戦は、蛋白質ダイナミクスの制御機構の解明。
いくつかの光学的手法が開発されている細胞1生活のこれらの相互作用を研究します。これらのうち、全内部反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡、1980 年代初頭に開発によりでまたは非常に近い細胞膜2分子間相互作用の研究ができます。細胞内の全反射データから得られる膜タンパク質軌道の動的パラメーターを研究、単一粒子追跡法 (SPT) が必要です。いくつかのアルゴリズムがこれを利用可能な我々 は現在結果のトラックを接続するための連続するフレーム間の粒子をリンクすることにより密な粒子フィールドの粒子運動の不均質性をアドレス Jaqaman ら3の発行するものを使用します。完全な軌道 (一時粒子消失) にセグメント。ソフトウェア キャプチャ粒子凝集・解離のイベント3からその結果を分割します。このソフトウェアの出力データの 1 つは、各フレーム内の X と Y の位置を定義することによって全体の軌道に沿って粒子の検出です。
粒子が検出されると、我々 は短い兼ねた拡散係数 (D1-4)4,5を決定するさまざまなアルゴリズムを適用します。よると粒子も瞬間スケーリング スペクトル (MSS)6,7,8解析を適用することによって、または調整曲線9平均二乗変位 (MSD) の 'アルファ' 値を当てはめによる分類します。軌道の種類。
蛍光画像でスポットの強度の分析は、フィールド10,11の科学者の共通の目的です。使用される最も一般的なアルゴリズムは、いわゆる数と明るさです。このメソッドそれにもかかわらずモバイル画分中の粒子の正しいフレームで強度の検出をできませんは。我々 はしたがって、これら粒子の強度によってフレームを評価して、凝集状態を決定する新しいアルゴリズムを生成しています。U Track2 ソフトウェア3を使用して、各粒子の座標を検出、一度定義その強度各フレームで完全な軌跡を各フレームでセルの背景を考慮します。このソフトウェアは、スポットの強度とセルの背景色を決定するさまざまな可能性を提供していて、粒子の検出 (クラスター サイズ) で蛋白質のおおよその数を計算します、参照として知られている単量体および二量体のタンパク質を使用します。
この資料で述べるこれらの 3 つの手順を実行する注意ガイド: 1) の検出と U-トラックを使用して蛍光顕微鏡のビデオに沿って 1 つの粒子を追跡2) 分析瞬時拡散係数 (D1-4) それらの粒子と MSS; による長い軌道で粒子の運動 (閉じ込められ、無料、フリー、または監督) の種類3) 各スポットに推定される背景の蛍光性によって修正ビデオに沿ってスポットの強度を測定しました。これは、クラスター サイズの推定とフォトブリーチを行なった手順を識別できます。
このプロトコルの使用特別なスキルを必要としない研究室では細胞培養を行うことが、フローサイトメトリー、顕微鏡設備の流れ。プロトコルは、ImageJ やフィジー (ImageJ12分布)、U トラック3、いくつかの広告を作ったホック ルーチン (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip) を使用します。U トラックおよびアドホック ルーチンは、任意の互換性のあるコンピューターにインストールすることができます Matlab 上実行します。

<table><tbody><tr><td>ヒトJurkat細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-10915</td><td>ヒトT細胞株。このソフトウェア</td></tr><tr><td>pAcGFPm-N1(PT3719-5)</td>で他の細胞タイプを分析できますDNA3GFP <td>Clontech</td><td>632469</td> このルーチンGene Pulse X Cellエレクトロポレーター<td>でさまざまな蛍光タンパク質を追跡し、分析できます</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>バイオラッド&nbsp;</td><td></td><td>Jurkatセルには280 V、975 mFを使用します。トランスフェクション法は、あなたの手で最適に働きます。&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytomics FC 500 フローサイトメーター&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MoFlo Astrios セルソーター&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>トランスフェクションのレベルによっては、細胞選別が不要な場合があります。&nbsp;また、目的の受容体の適切なレベルを安定して発現する細胞を使用することもできます。</td></tr><tr><td>Dako Qifikit</td><td>DakoCytomation</td><td>K0078</td><td>細胞表面の受容体の数を定量化するために使用されます。</td></tr><tr><td>ガラス底マイクロウェル皿</td><td>MatTek</td>株式会社 <td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>血漿からのヒトフィブロネクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0895</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトCXCL12</td><td>PeproTech</td><td>300928A</td><td></td></tr><tr><td>反転ライカAM TIRF</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EM-CCDカメラ</td><td>Andor&nbsp;</td><td>DU 885-CSO-#10-VP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>The MathWorks, Natick, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-Track2 ソフトウェア</td><td>Danuser Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://imagej.nih.gov/ij/ FiJi</td><td>FiJI</td><td></td><td>https://imagej.net/Fiji)</td></tr><tr><td>u-Track2 ソフトウェア</td><td></td><td></td><td>Matlabツール。&nbsp;インストールするには、Webページ(http://lccb.hms.harvard.edu/software.html)から.zipファイルをダウンロードし、選択した</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPadソフトウェアの</td><td></td><td></td></tr>ディレクトリでファイルを解凍</tbody></table>します

画像処理プロトコル、拡散の解析と蛍光顕微鏡による膜受容体のクラスター サイズ

Image Processing Protocol for the Analysis of the Diffusion and Cluster Size of Membrane Receptors by Fluorescence Microscopy

粒子追跡ビデオ シーケンスとそれらの軌道の事後解析では、今日多くの生物学研究の一般的な操作です。細胞膜受容体の解析を使用してクラスター モデルが、フィジー (ImageJ) および Matlab ルーチンを使用してこの画像解析タスクの詳細なプロトコルを提案する: 1) 関心領域を定義し、これらの地域に適応したマスクをデザイン2) 蛍光顕微鏡動画内の粒子を追跡します。3) 選択したトラックの拡散と強度特性を解析する.拡散係数の定量的解析、モーション、およびクラスター サイズの型を用いて蛍光顕微鏡と画像処理が粒子のダイナミクスと変更の結果を客観的に判断するための貴重なツールを提供します環境条件。この記事ではこれらの機能の解析のための詳しいプロトコルを提案する.説明する方法ここでだけでなく単一分子追跡検出が細胞膜で横方向の拡散パラメーターの推定の自動化にも、軌道の種類を分類でき、したがって克服する完全な分析、細胞膜でその全体の軌道上のスポット サイズを定量化の難しさ。

このプロトコルは、使用蛍光顕微鏡映画とその動的特性の解析で検出された粒子の自動追跡です。当初、セルは追跡する蛍光結合タンパク質をトランスフェクトしました。SPT は、ソーティング (図 1) によって得られることができる細胞表面受容体の適切なレベルを示します。選択したセルは、このプロトコル (補足のビデオ 1) で説明されているツールを学ぶことができる形式の動画を生成する全反射型顕微鏡によって分析されます。
生成された動画を直接分析できないし、各ビデオの独立したフレームが必要です。ImageJ の使用は、.tiff 形式またはマスクのビデオ フレームなど Matlab ソフトウェアを使用して解釈することができますファイルを生成します。U トラック選択したビデオで見られる粒子を追跡し、Matlab (.mat) ファイル (movieData.mat</...

ここでは、単一粒子の拡散係数、蛍光顕微鏡で検出する単一粒子の運動とクラスター サイズの種類の定量評価ができる画像解析を追跡するためのプロトコルを提案する.

Particle tracking on a video sequence and the posterior analysis of their trajectories is nowadays a common operation in many biological studies. Using ...

新しい顕微鏡手法では、研究されている生物学的プロセスを正しく理解するための適切なツールの開発が必要です。このプロトコルは、横方向拡散パラメータの推定や細胞膜におけるその全軌道上のスポットサイズの定量化を含む、単一分子追跡に必要な画像処理ステップを記述する。このプロトコルは、ImageJ、MATLAB、uTrack などのいくつかのソフトウェアの使用と、このプロトコル用に特別に開発されたタンパク質を組み合わせたものです。この方法は、光顕微鏡下で膜受容体の追跡と共に示されるが、それは、その軌道がビデオシーケンスで時間をかけて追跡することができる任意の粒子状の構造に適用することができる。この技術は基礎研究に関するものであり、臨床現場での直接的な応用はない。しかし、それは異なる疾患で、したがって、新しい治療標的の同定の両方で生物学的事象の特徴付けに役立つ使用することができる。このプロトコルは、このビデオに示すように、細胞膜内の粒子の追跡に関連していますが、完全な細胞、細菌、流体中のナノ粒子、または中心を十分に決定できる他の物体の追跡にも適用できます。このプロトコルはユーザーフレンドリーで、細胞培養と顕微鏡技術の知識のみが必要です。このプロトコルで使用されるさまざまな手法や情報ツールは、新しいユーザーを脅かす可能性があります。この視覚的なデモンストレーションは、この手法を自信を持って使用するのに役立ちます。まず、Jurkat細胞を増殖させ、それらを単量体GFP標識ケモカイン受容体ベクターでトランスフェクトし、また、付随するテキストプロトコルに記載されているように、標識されたベクターの発現レベルが低い細胞を選択する。フィブロネクチンでコーティングされたフィブロネクチンコーティングされた35ミリメートルのガラス底マイクロウェル皿にCXCL12リガンドまたはコントロールメディアを含む培地を追加し、摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、各皿に選別した細胞を加え、細胞をイメージングする前に20分間インキュベートする。インキュベーションに続いて、細胞の最初の皿をTIRF顕微鏡ステージに移し、100x油浸出目的に変えます。明視野を使用して細胞を見つけて焦点を当て、光の漂白効果を最小限に抑えます。その後、TIRFモードに切り替え、低レーザー強度を使用して微調整を行います。フレーム間の時間間隔を最小限に抑え、約50秒の長さのムービーを取得します。実験条件のビデオファイルごとに、このビデオのテキストプロトコルで説明されているファイル構造の指示に従って新しいフォルダを作成します。バーメニューで「イメージ」を選択し、「カラー」をクリックしてから「チャンネルを分割」をクリックして、異なるチャンネルを別々の画像として表示します。バーメニューで「イメージ」を選択し、「カラー」に移動して「チャンネルを結合」を選択し、1 つの画像内の 3 つのチャンネルを再び結合します。適切なチャンネルを選択し、[OK]を押して新しい非スタックイメージを生成してください。バーメニューに移動し、[分析]を選択して、[ツール]に移動し、[Windowsを同期]を選択して、2つのウィンドウを同期します。同期された画像の可能性を持つ新しいウィンドウが表示されます。2 つのウィンドウが同期された状態で、両方のウィンドウの同じ領域をトリミングできるようになりました。バーメニューの[画像]に移動し、[トリミング]を選択します。長方形選択ツールを使用して、対象領域を描画します。2 つのトリミングされた画像が個別に表示されます。次に、両方のウィンドウの同期を解除します。マスクが作成されていない場合は、選択ツールとトリミングを使用して対象領域を描画します。その後、ビデオをイメージ シーケンスとしてディレクトリ Videosec に保存します。次に、マルチチャンネルイメージを選択し、メニューのプラグインに移動し、セグメンテーションエディタを選択してセグメンテーションエディタプラグインを開きます。フリーハンド選択ツールを選択し、緑色のラベルを選択し、最も外側のマスクをデザインするために使用します。デザインが完了したら、複合ウィンドウの選択オプションでプラスボタンを押すと、選択したマスクがビューアに表示されます。すべてのラベルに対してこの手順を繰り返します。すべてのマスクをデザインしたら、ビデオと同じファイル名を付けてマスクを保存します。:mask.tif。MATLAB を開き、パスに uTrack ディレクトリを追加するには、[パスの設定] に移動し、[Add With] を選択します。次に、作業ディレクトリを、分析対象の系列が含まれているディレクトリに変更します。コンソールで「ムービーセレクタGUI」と入力し、Enterキーを押してuTrackを起動します。これにより、ムービー選択ウィンドウが開きます。[新しいムービー] ボタンを押し、[ムービー追加] ウィンドウが表示されるまで待ちます。[チャンネルの追加] を押して、ビデオを含むディレクトリを選択し、ムービー情報パラメータを入力します。uTrack の結果の出力ディレクトリを[結果]に設定し、[チャネルの詳細設定]を押して、取得に関連するパラメータを入力して保存します。ムービーを作成したら、ムービー選択ウィンドウで[続行]を押します。ここでは、uTrackは、分析するオブジェクトの種類について尋ねます。[単一パーティクル] を選択すると、コントロール パネルウィンドウが表示されます。次に、最初のステップ「ステップ 1:検出」を選択し、「設定」をクリックします。[ガウス混合モデルの調整]ウィンドウが表示されます。ここに示すように設定を入力し、適用を押します。コントロール パネルで、[実行] をクリックして検出手順を実行します。数分後に結果ボタンを押して結果を確認します。ムービーは検出されたパーティクルに赤い円を表示します。赤い円が表示されない場合は、この手順が正しく動作しなくて、もう一度やり直してください。ここで、ここで示すようにパラメータを設定して、検出されたばかりのパーティクルを複数のフレームにまたがるトラックにマージします。次に、コントロールパネルで実行を押します。次に、トラック解析を実行します。次に示すように設定を定義し、[適用] と [実行] をクリックします。結果ボタンを押して結果を確認し、次にムービーオプションウィンドウのトラック番号を表示をクリックし、各トラックが正しく識別されていることをフレームごとに確認し、真のパーティクルではないパーティクルを手動でマーキングします。MATLAB に、次に示すようにコマンドを入力します。このコマンドを実行すると、プログラムはすべての軌道を読み込み、拡散係数を計算します。次に、除外するスポットのリストを指定して、誤って識別されたスポットまたは軌道に対応する軌道を除外します。このセルの各トラックの瞬間拡散係数を計算するには、付属のテキストプロトコルに従って行います。この場合、タイムラグの拡散係数はD1から4と呼ばれる4に等しい計算を行います。終了したら、短いおよび長い軌道に軌道を分解します。長い軌道を解析するには、次に示すようにコマンドを入力して、モーメントスケーリングスペクトルを通してモーションのタイプを分類します。各パーティクルの強度を軌道に沿って解析します。付属のテキスト プロトコルに従って、さまざまな方法でこの基本的な動作を構成します。次に、すべての軌道の拡散と強度情報を収集します。短い軌道のために拡散と強度情報のみを収集します。最後に、前に使用したサフィックスである long を次のように入力して、モーメントスペクトルスケーリングと強度情報を収集します。このプロトコルで説明されている技術を使用することで、蛍光顕微鏡ムービーで検出された粒子の自動追跡とその動的特性の分析が可能になります。この分析から、刺激の変動に基づいて異なる特性を得ることができる。これには、4つの異なる刺激に基づく不動スポットの割合、50フレームを超える長い軌道の割合、および指向、自由、または限られた動きによって分割された軌道に沿った動きの種類が含まれます。また、拡散係数、平均スポット強度、および粒子あたりの受容体数を決定することができる。これは、異なる刺激に応答して、各スポットの短い拡散係数値の分布を示しています。赤い線は中央値を表し、この類似グラフは同じ刺激に応答して最初の20フレームに沿って各スポットの平均スポット強度を示す。赤い線は平均強度の値を表します。スポットの平均補正強度は、このスポットに存在する蛍光タンパク質の数に関連しているので、ここで示すように、粒子当たりの受容体数を直接計算することができます。MATLAB は、大文字と小文字を区別するプログラミング言語です。このプロトコルで説明されている変数名に関して変数名を変更できますが、名前付けに一貫性があることを確認してください。関数の名前は変更できず、正しい構文を使用するにはコンマ、コロン、セミコロンが重要です。単一分子顕微鏡検査は、前例のない時空間分解能を持つ個々の膜タンパク質の可視化を可能にし、細胞生物学の予期せぬ側面を明らかにするユニークな機会を提供します。このプロトコルは、細胞および分子生物学における顕微鏡ビデオの定量的分析のための新しい扉を開きます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

複数のターゲットトレースは、生きた細胞の細胞膜内で個別に標識分子を追跡するために開発した自家製のアルゴリズムである。効率的に検出するナノ膜のダイナミクスを調べるためにユーザーフレンドリーな、包括的なツールを提供し、高密度で時間をかけて分子を推定し、トレースします。...

複数のターゲットトレース（MTT）による原形質膜中の分子拡散のマッピング

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、シグナル伝達受容体を含む多くのタンパク質を内部化する急速で非常に動的なプロセスです。ここで説明するプロトコルは、個々のエンドサイトーシスイベントの動態を直接視覚化します。これは、エンドサイトーシス機構のコアメンバーがどのように互いに協調し、タンパク質カーゴがこのプロセスにどのように影響するかを理解するために不可欠です。...

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

細胞膜タンパク質と脂質の空間分布と時間ダイナミクスは、生物学におけるホットなトピックです。ここでは、この問題は、概念的には同じ物理量の単一粒子追跡を提供する時空間画像変動解析によって対処されますが、低分子ラベルと標準的な顕微鏡セットアップを使用します。...

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

生体内の生体分子の研究は、生物学的な文脈における分子機能を理解するために非常に重要です。ここでは、DNAやタンパク質などの蛍光生体分子を生きた微生物に取り込むことができる新しい方法について説明します。蛍光顕微鏡で記録されたin...

エレクトロポ生きた微生物で内在化および蛍光生体分子の観測

提示されたプロトコルは、細孔スパンの溶媒を含まない脂質二重層を使用した単一トランスポーターレベルでの膜タンパク質媒介輸送の分析を説明しています。これは、大量生産されたナノポアアレイチップの作成と、高度に並列化されたデータ取得および分析を組み合わせることで達成され、膜タンパク質エフェクタースクリーニングの将来の確立が可能になります。...

単一のタンパク質解像度で高並列ナノ細孔チップシステムにより分析膜輸送プロセス

液滴単層を平らな単層に融合させることにより、流体-流体界面における表面活性種の横方向の拡散を測定する新しい技術を提示します。...

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

ここでは、単一分子感度と〜15ミリ秒の時間分解能で、偏TIRFMを用いたマイクロ流体チャネルにおけるリポソームおよびサポートされている二重層の間の単一、SNARE媒介融合事象を検出するためのプロトコルを提示します。脂質可溶性貨物放出を同時に検出することができます。リポソームサイズは、脂質拡散、および融合細孔特性が測定されます。...

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

pH感受性蛍光体で膜タンパク質の細胞外ドメインをラベリング、superecliptic pHluorin（SEP）は、細胞内局在、発現、および人身売買を決定することができます。全反射蛍光顕微鏡（TIRFM）の撮像SEP-標識されたタンパク質は、末梢ERおよび原形質膜中のタンパク質レベルの定量化を可能にします。...

細胞内局在や人身売買を監視するpHluorinタグ付き受容体を利用します

生細胞の形質膜におけるリガンド結合によって誘導されるmEGFPタグ付き受容体オリゴマーの平均オリゴマー状態の測定のためのイメージングアプローチについて説明する。このプロトコルは、数と明るさ(N&amp;B)分析と組み合わせた全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡に基づいています。...

数と明るさの分析と組み合わせた全内部反射蛍光顕微鏡による生細胞における細胞表面受容体のオリゴマー化ダイナミクス

ここでは、単一分子全反射蛍光(smTIRF)顕微鏡を使用して、人工混雑した脂質膜上の単一分子の結合、移動度、および組み立てを実行および分析するためのプロトコルが提示されます。...

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

学ぶ単一分子追跡の画像処理プロトコル。ImageJ、MATLAB、uTrackを用いて膜受容体の拡散係数とクラスター サイズを定量化し、細胞膜ダイナミクスを解析する方法です。

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