Name: 熱と圧力を用いた水性溶媒和による組み換えクモ絹の材料形成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: 学ぶ、熱と圧力を用いた水性溶媒和法による組み換えクモ絹タンパク質の材料形成技術。水溶液中でタンパク質特性を保持し、ハイドロゲル、繊維、フィルムなど多様な形態を創出する革新的なバイオマテリアル手法です。

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著者たちは、ユタ州科学技術研究 (USTAR) イニシアティブからの資金援助を感謝したいと考えています。

1. 凍結乾燥タンパク質ストックからの組換えクモ糸混合物調製
<ol><li>目的とする材料の形成に必要な定式化とボリュームを決定します。典型的な製剤の範囲は 3%(w/v) ~ 15%(w/v) です。この選択を使用して、適切な rSSp、濃度、および比率を計算します。<ol>
<li>このプロトコルに記載されている各材料を準備するために、以下のそれぞれの製剤を使用してください: ヒドロゲル/スポンジ/lyogels、6%(w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2;フィルム/コーティング, 5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2;接着剤、12%(w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2;繊維、12.5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2。 注: ほとんどの製剤は、特定の形態および材料に適しているにもかかわらず、多くの場合、重複することができる製剤の広い範囲があります。さらに、最終的な rSSp 材料はまた形成および処理の間に好みの特性を作り出すために合わせることができる。一般的に、各タンパク質は、適切または有用なパラメータの調査を必要とします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ゴム製のスクリューキャップ付きの清潔で新しい 8 mL オートクレーブ可能ホウケイ酸ガラス培養を選択します。</li>
	<li>キャップを外し、空のバイアルを分析バランスに置きます。バランスがゼロ質量を読み取るように、空のバイアルの質量を風袋ます。</li>
	<li>各特定の材料のための空のバイアルに所望の凍結乾燥 rSSp 粉末を追加します。<ol>
<li>2 mL の溶液を調製する際に、各材料について各タンパク質タイプのこれらの特定の質量を使用してください: ヒドロゲル/スポンジ/lyogels, 60 mg の MaSp1 と 60 mg の MaSp2;フィルム/コーティング, 80 mg の MaSp1 と 20 mg の MaSp2;接着剤, 120 mg の MaSp1 と 120 mg の MaSp2;繊維, 200 mg の MaSp1 および50の mg の MaSp2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>すでに加重 rSSp 粉末を含んでいるバイアルに、少なくとも2ml の超純水の所望の量を加えます。 注: すべての溶媒和手順には、最小 2 mL のボリュームをお勧めします。</li>
	<li>バイアルキャップを密封し、溶媒和手順の準備ができている分散された、均質な、rSSp 混合物を作成するために内容を活発に渦。超音波処理またはインペラ混合などの追加の均質化アプローチは、または、渦混合に使用することができます。</li>
</ol>2. 組み換えクモ糸溶媒和
注意: 高加熱と圧力は、溶媒和の手順で生成されます。このプロセスには、適切な個人用保護具、特にゴーグル、長袖、耐熱手袋が必要です。
<ol><li>バイアル、または容器、キャップの最終チェックを行い、しっかりとしっかりと締め付けられていることを確認します。その後、懸濁した rSSp 混合物を従来の電子レンジに移す。 注: 1500 700 の電力範囲内のマイクロ波ユニットは、より小さい内部チャンバ容量を有する、および回転プラットフォームは、より良い溶媒和条件を提供することをお勧めします。</li>
	<li>フルパワーで 5 s バーストとマイクロ波の動作を開始します。各バーストの後に簡単にドアを開き、慎重に沈殿し、懸濁混合物を維持するためにバイアルを混ぜ/旋回します。</li>
	<li>混合物および/または溶液が、バイアルの部分を含む溶液に対して直接赤外温度計で測定された場合、少なくとも130° c の温度を得るまで、このマイクロ波プロセスを繰り返します。すべての固体微粒子が完全に溶解し、表示されなくなるまで、このプロセスを繰り返します。 注: 特に製剤が高濃度の rSSp が存在する場合、バイアルおよび溶液を時折冷却することが推奨される。200° c を超える温度は、バイアルシール不良のリスクを増加させます。過熱混合物/溶液がシールに接触するのを防ぐために特別な注意を払わなければならないこともあり、その結果、バイアルの封じ込め不良も生じます。</li>
	<li>首尾よく溶液に rSSp 混合物を溶媒和した後、溶液の温度とバイアルキャップは、開口部の前に100° c (沸点) 以下に冷却することができます。</li>
</ol>3. ヒドロゲル
<ol><li>電子レンジから取り除いた後、溶液からヒドロゲルを調製し、冷却して設定します。それが完全に冷却することを可能にする前に、特定の形状にヒドロゲルをキャスト. 注: 異なる rSSps は、ヒドロゲルに移行するために様々な量の時間を必要とするであろう。例えば、MaSp2 配列は、MaSp1 の配列と比較してより迅速にヒドロゲルを形成する傾向がある。タンパク質濃度、塩分濃度、および pH もまた、ヒドロゲルへの移行速度に直接影響を及ぼす。</li>
</ol>4. スポンジ
<ol><li>第一の溶媒和溶液がヒドロゲルを形成できるようにすることによって、rSSp スポンジを調製する。</li>
	<li>水浴にヒドロゲルを入れ、この浴を-20 ° c で冷凍庫に入れ、浴が完全に冷凍されるまで待つ。</li>
	<li>冷凍ハイドロゲルと水浴を冷凍庫から取り出し、25° c で解凍してスポンジの形成プロセスを完了させます。得られたスポンジを解凍した水から除去できるようになりました。</li>
</ol>5. Lyogel
<ol><li>Lyogel の有無にかかわらず、形成されたヒドロゲルを直接凍結して rSSp を調製し、凍結したヒドロゲルサンプルを lyophilizer (凍結乾燥機) に移します。</li>
	<li>耐湿昇華が発生した容器から最終的な凍結乾燥ゲル材料を除去します。</li>
</ol>6. フィルムおよびコーティング
<ol><li>次の3つの方法のいずれかを使用します: 溶液鋳造、溶液噴霧、またはディップコーティングにより、rSSp のフィルムまたはコーティングを製造します。<ol>
<li>可溶化したシルク溶液を、所望の形状の PDMS 形態に/にキャストする。</li>
		<li>フィルム溶液の200μ l を注ぎ、広げ、これを PDMS 基板の試験または処理のために剥離する前に乾燥させる。</li>
		<li>これらの乾燥を許可した後、機械的な特性を向上させるために、フィルムを処理または後処理のための形成されたフィルムを削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>コーティングを調製するために、または基材から除去することができないフィルムは、薄膜層を生成するためにスプレーまたはディップコーティングを使用する。 注: スプレーコートに、このプロトコルは、マスターエアブラシモデル塗装噴霧器で成功を発見しました。<ol>
<li>選択の基質を可溶化された rSSp に単に沈めるし、乾燥後に所望の厚さを達成するために、ディップコーティングを形成する。</li>
		<li>最終コーティングの一貫性と有効性を向上させるためにディップコートを適用する前に、最初のスプレーコートを実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 接着剤
注: 接着剤の形成は、以下の方法のいずれかによって達成される。
<ol><li>可溶化された rSSp を基板上に直接添加し、2番目の基板を溶液の上部に塗布します。ピースをしっかりとクランプし、最低温度25° c のオーブンでサンプルを少なくとも16時間乾燥させます。</li>
	<li>または、スプレーコーティングで2つの基板表面をスプレーし、基板を一緒にクランプします。</li>
	<li>基材をコーティングするディップ法を通して rSSp を塗布し、基材を固着させることも、接着剤の調製に使用することができます。</li>
</ol>8. ウェットスパンファイバー
<ol><li>19 G のグライド針を通して Luer ロックの先端が付いている同心のスポイトに可溶化されたドープの解決を荷を積む。気泡を取り出し、ドープを注射器の Luer ロックの端に座らせます。</li>
	<li>Peek チューブ、内径0.01 インチの少なくとも 25 mm を挿入1/16 インチ OD と10/32 コーンのための PEEK チューブの1ピースフィンガータイトなフィッティング。このフィッティングは、ルアー・ロックメス・アダプターに PEEK チューブに取り付けます。<ol>
<li>このセットをロードされたシリンジに取り付けて、19ゲージの針を交換してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>凝固の浴室に使用する 99% の純粋な isopropanol が付いている高く、明確なガラス浴室を満たしなさい。<ol>
<li>ストレッチ godets の下に位置するストレッチバスを、記入してください。これらは、80:20 isopropanol を持っています: 最初のストレッチ浴の蒸留水、および 20:80 isopropanol: 第二のストレッチ浴の蒸留水。</li>
	</ol>
</li>
	<li>凝固浴の後の最初のゴデットローラーと第1の伸張浴の最初のゴデットローラーが同じ速度で回転しているようなゴデットローラーストレッチシステムを設定します。<ol>
<li>ストレッチバス1、中央上部ゴデットローラー、およびストレッチバス2の最初のゴデットローラーで同じ速度に最終ゴデットローラーの速度を調整することによって、最初のストレッチを開始します。この速度は、初期の繊維除去速度の2倍の速さになります。</li>
		<li>ストレッチバス2、最後の上部ゴデットローラー、および巻取り機の最終ゴデットローラーの速度を同じ速度に調整することによって、第2の伸張を開始する。この速度は、最初のストレッチに使用される速度の2倍の速さ、または初期繊維除去速度の4倍になります。</li>
		<li>中間 godets の外側にニトリル手袋を置き、繊維を滑らせないようにします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>徐々に凝固浴に溶液を押し出すために開始します。自動化されたシステムでは、10 mm/s の除去速度に一致するように押出率を設定します。<ol>
<li>薄い金属製のフックまたは鉗子を使用して、繊維を浴中に引っ張る前に繊維の押し出しを均一にすることができます。浴中から繊維を除去することを確認します PEEK チューブの先端との間にループを作成し、バスをお風呂のままに繊維をパス。</li>
	</ol>
</li>
	<li>繊維が伸張浴に沈められるが、伸張の浴室間の空気で乾燥し、スプールに行く前に godets のシリーズを通して取り出された繊維を導きなさい。この乾燥は、より高い配置の中間 godets によって達成される。 注: 繊維除去率および/または押出速度は、凝固浴の底部に繊維をプールすることなく十分な凝固時間を可能にするために、タンパク質濃度、添加剤、およびタンパク質タイプに基づいて調整する必要があります。</li>
	<li>テープを使用して、完全に引き伸ばされたファイバーをワインダーメカニズムのスプールに取り付けます。</li>
</ol>

<ol><li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li>
<li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+Just+Fibers%3A+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li>
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<li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li>
<li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li>
<li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li>
</ol>

著者は利害の対立を宣言していない。

組換えクモ糸タンパク質が精製された後、それらは、その後、材料形成のために使用することができる溶液中に調製しなければならない。凍結乾燥したクモ糸タンパク質を水と混合し、この混合物をマイクロ波照射に曝露することにより、熱および圧力を発生させ、rSSp 溶液を調製することができる。この簡単で効率的な rSSp の可溶化法から、多種多様な材料の形態を作り出すことができます。各材料は、所望の結果と特性を達成するために一意に調製し、処理する必要があります。初期の製剤、形成条件、および/または処理パラメータの軽微な変更により、各材料は、この方法を使用して容易に調整することができる。ここに提示されているよりも多くの形態があり、フィールドで他の人によるさらなる調査を通して、これらの材料は、この技術を使用して新しい材料形態を探求するために進化し続けます。
溶液が主に水とタンパク質から構成されている場合 (添加剤を使用してゲル化を遅らせ、溶液の安定性を改善することができる)、生物学的に活性な成分と機能化の可能性が大幅に改善されるHFIP ベースの rSSp ソリューションとの比較。様々な成分が含まれてい...

スパイダーシルクは、強度、弾力性、および生体適合性の彼らの印象的な組み合わせの材料科学者の関心を集めています。繊維の再作成は、伝統的に研究の推進であった。この取り組みは、固有における組換えクモ糸タンパク質 (rSSp) の水に対する阻害性、ならびに従来の溶媒和技術 (カオトロピック剤および洗剤) が水性溶媒和を達成することができなかったことによって妨げられた。さらに、rSSp の溶媒和バージョンのために開発された技術は、すべての rSSp 変異体では動作せず、多くの場合、タンパク質損失1,2に起因するかなりの操作と時間を必要とします。これにより、繊維を形成する溶媒として1、1、1、3、3、3-hexafluoroisopropanol (HFIP)、および他の限られた材料の形態を利用する分野に大きく起因している。すべての既知の rSSp が HFIP に可溶性であるという利点は、各研究グループ間のデータの均一性を提供する。欠点は、HFIP が高価であり、健康上の懸念や環境への配慮のためにスケールすることは現実的ではない有毒な溶媒であるということです。
RSSp 溶媒和への斬新なアプローチは、過酷な有機溶剤 HFIP と rSSp 溶媒和に選択的に働く他の技術との間の技術的ギャップを埋めるものであった。特定の熱および圧力の組合せは rSSp および水の懸濁液に加えられた。結果は、100% の溶媒和と rSSp の回復だけでなく、高タンパク質濃度の近くであった;種々の材料形態は、HFIP または他の有機溶媒3、4、5、6を使用してすべて達成可能ではなかったこれらの製剤からできると判断された。このアプローチの目的は、精製および乾燥された組換えスパイダータンパク質を、様々な材料形態の製造に利用することができる水溶液中で効率的かつ容易に可溶化することである。
繊維、フィルム、コーティング、接着剤、ヒドロゲル、lyogels、微小球、およびスポンジ材料はすべて、この方法を用いて同じ水性 rSSp 溶液から容易に accomplishable する。この方法の継続的な進化は、追加の rSSp だけでなく、他のタンパク質とともに、新しい材料形態および代替タンパク質の精製および可溶化経路をもたらす可能性がある。

<table><tbody><tr><td>3 mLシリンジ(ルアーロックチップ</td><td>BD</td><td>309657</td><td>付き) 他のサイズのシリンジを使用できますが、チップを装着したままにするには、ルアーロックチップを使用することをお勧めします</td></tr><tr><td>4 mL培養バイアル、ゴムライニングキャップ付きクリア</td><td>ウィートン</td><td>225142</td><td>最小ドープ量は1mL、最大は2mL</td></tr><tr><td>8mL培養バイアル、ラバーライニングキャップ付きクリア</td><td>ウィートン</td><td>225144</td><td>最小ドープ量は2mL、 最大は4mL</td></tr><tr><td>99%イソプロピルアルコール、試薬ACS/USPグレード</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>231000099</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Plus</td><td>Labconco</td><td>7386030</td><td>凍結乾燥機</td></tr><tr><td>ルアーアダプター メス ルアー x 10-32 メス、テフゼル (ETFE)</td><td>IDEX</td><td>P-629</td><td></td></tr><tr><td>電子レンジ</td><td>マジック シェフ</td><td>HMD1110B</td><td>120V、60Hz AC; 1000 ワット; 1.1 立方フィート容量; ガラス ターン テーブル付き</td></tr><tr><td>ワンピースフィンガータイト10-32コーン、1/16インチ</td><td>OD用IDEX</td><td>F-120X</td><td></td></tr><tr><td>PEEKチューブ1/16インチODx 0.010インチ</td><td>IDEX</td><td>1531B</td><td></td></tr><tr><td>噴霧器:マスターエアブラシ</td><td>マスターエアブラシ</td><td>TC-60</td><td></td></tr></tbody></table>

熱と圧力を用いた水性溶媒和による組み換えクモ絹の材料形成

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

多くのクモは7種類の絹を作り出します。シルクの6つはクモによって生産されたときの繊維の形です。これらの繊維は水溶性ではない。クモ絹の顕著な機械的特性を再現するためには、クモが領土と cannibalistic の両方であるように、それらは異種宿主で生産されなければなりません。クモ糸の合成類似体はまた、水溶液中に不溶性である傾向がある。したがって、組換えクモシルクの研究の大部分は、材料の大規模な生産に有害である有機溶媒に依存しています。当社グループの方法は、これらの組換えクモ絹の溶媒和を強制的に水にします。驚くべきことに、これらのタンパク質が熱および圧力のこの方法を使用して調製される場合、広範囲の物質形態は、組換えクモ糸タンパク質 (rSSp) の同じ溶液から、フィルム、繊維、スポンジ、ヒドロゲル、lyogel、および接着剤を含む調製することができる。この記事では、溶媒和 rSSp と材料形態の生産を、書かれた材料や方法だけではなく、より容易に理解できる方法で実演します。

RSSp の可溶化の説明方法から、図 1に見られるような様々な材料形態が実現できる。また、可溶化の方法は、熱と圧力を加え、従来のマイクロ波により発生させ、rSSp や水の懸濁液にすることである。臨界温度および圧力が達成されるとき、蛋白質は可溶化。この可溶化 rSSp 溶液から、ヒドロゲル、lyogels、スポンジ、接着剤、コーティング、フィルム、および繊維の7つの材料形態のために必要な条件が提示されます。ヒドロゲルは、可溶化した rSSp を冷却し、自然に自己会合させることによって調製される。ヒドロゲルを lyophilizing することによって lyogel が調製される。スポンジ材料は、水に浸漬されながらヒドロゲルを凍結することによって形成される。フィルムは PDMS 表面 (および他の受け入れ可能な表面) 上に可溶化された rSSp を鋳造することによって調製することができ、乾燥させる。PDMS はフィルムがポストの処置または分析のために容易に取除くことを可能にする。コーティングおよび接着剤は、スプレーま...

ここでは、水溶性の組換えクモ糸タンパク質溶液およびそれらの溶液から形成することができる材料形態を生成するためのプロトコルを提示する。

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

この組換えスパイダーシルクの可溶化方法は、従来の過酷な有機溶剤では不可能な材料形態を作り出します。また、このプロセスは、穀物であり、水中での単純なタンパク質溶液をもたらす。この方法を利用することにより、形成または製造された材料は、スパイダーシルクタンパク質の望ましい特性を維持する。組換えスパイダーシルクのためのこの可溶化技術は、組み換えクモ糸の一段階のプロセスでの可溶化を可能にする。これらは、タンパク質を生成することが困難で、広範な処理によって失われるので、これは望ましいです。さらに、溶液は水中のタンパク質にすぎないので、その用途に望ましい場合は、他の生物学的に活性な化合物を添加することができる。特に、タンパク質構造機能関係は、このシステムは、クモが高濃度で水やタンパク質を利用するという面で繊維を作る方法に対するメメティックである。この可溶化法とその後の材料形成を用いることで、形成される材料と、その原因となる構造を理解することが可能になるはずです。アルカリ性または酸性環境を溶媒和物に必要とする合成ペプチドを可溶化するためにこの技術を使用したと考えられています。すなわち、これらのペプチドに対する下流用途において有利である可能性がある。さらに、合成的に発現すると多くの既知のタンパク質が不溶性分画に終わる傾向がある。再溶解し、これらのタンパク質を再折り畳むのは、多くの場合、大きな損失をもたらす骨の折れるプロセスです。この技術を利用することで、不溶性タンパク質の回収プロセスの効率を高めることができる可能性がある。電子レンジに密封されたバイアルを置くことは、過熱し、バイアルを加圧するリスクを与える少し困難です。熱と圧力を加えるために段階的なアプローチを理解することは非常に重要です。第二に、特に組換えクモ糸については、塩が存在する場合、塩の量に応じて効果的に働いたり働いたりする技術を許さない。塩の除去が鍵です。忍耐強く、注意して、あなたのマイクロ波の時間とバイアル内の温度を注意深く監視します。従来の書かれた資料や方法のセクションを通して伝えることがしばしば困難である動作する可動部品の数があるので、それは重要です。適切な研究を妨げる溶解性の問題を抱えるタンパク質が多く存在することを考えると、この方法は、様々なタンパク質空間に適用して改善したり、分析技術や特性評価を可能にしたりする可能性があります。まず、ゴム製のネジキャップを備えたクリーンで新しい8ミリリットルオートクレーブ可能なホウケイ酸ガラス培養バイアルを選択し、空のバイアルを分析バランスに置きます。空のバイアルの質量を引き裂き、バランスがゼロ質量を読み取るようにします。目的の凍結乾燥した組み換えスパイダーシルクタンパク質粉末を特定の材料の空のバイアルに加えます。次いで、所望の量の超純水を、少なくとも2ミリリットル、バイアルに加える。バイアルキャップをシールし、内容物を活発に渦を出して、分散した均質な組換えクモ糸タンパク質混合物を作成する。バイアルキャップの最終チェックを行い、しっかりとしっかりと締め付けされていることを確認します。次いで、700〜1500ワットの電力範囲を有する従来の電子レンジに懸濁した組換えクモ糸タンパク質混合物を移す。手動でオン/オフを切り替えることで、5秒のバーストがフルパワーでマイクロ波の動作を開始します。各バーストの後、ドアを短時間開き、慎重に沈降を防ぐためにバイアルを混合し、懸濁液を維持します。時折、バイアルと溶液を冷却させ、過熱溶液がシールに触れるのを防ぎます。赤外線温度計を使用して、バイアルの一部を含む溶液の温度を測定します。温度が最低130°Cに達し、固体微粒子がすべて完全に溶解するまで、マイクロ波プロセスを繰り返します。その後、溶液の温度とバイアルキャップを摂氏100度以下に冷却します。この溶液が完全に冷却される前に、バイアルから特定の幾何学に鋳造して、ヒドロゲルを形成します。ヒドロゲルが形成されたら、水浴に入れ、マイナス20度で冷凍庫に移します。お風呂が完全に凍るまで待ちます。冷凍庫から凍結ヒドロゲルと水浴を取り除き、摂氏25度で解凍することにより、スポンジ形成プロセスを完了します。その後、解凍した水から得られたスポンジを取り除きます。ライオゲルを調製するには、凍結したヒドロゲルサンプルを凍結乾燥剤に移します。24時間後、最終凍結乾燥ゲル材料を容器から取り出す。組換えスパイダーシルクタンパク質のフィルムを製造するために、200マイクロリットルのホット可溶化された組換え糸タンパク質をバイアルから所望の形状のPDMS形態にキャストする。乾燥後、テストまたは治療のためにPDMS基板を剥がします。基材から除去できないコーティングを準備するには、エアブラシ噴霧器を使用して可溶化された組み換えスパイダーシルクタンパク質を適用し、選択した基質に初期スプレーコーティングを施します。乾燥後、被覆された基材を可溶化した組換え糸タンパク質に沈水させて、ディップコーティングを形成する。ディップコーティングを繰り返して、所望の厚さを達成します。接着剤を形成するには、ピペットを使用して可溶化された組換えスパイダーシルクタンパク質を基質に加え、溶液の上部に第2の基質を塗布する。しっかりとピースをクランプし、少なくとも16時間摂氏25度の最小限の温度でオーブンでサンプルを乾燥させます。ウェットスピン繊維を生成するには、19ゲージのグライドニードルを使用し、可溶化したドープ溶液をLuerロックチップで同心円のシリンジにロードします。気泡を排出し、ドープはシリンジのルアーロック端に座らせます。16インチ以上の外径の1つのためのPEEKチューブのワンピースフィンガータイトなフィッティングに少なくとも25ミリメートルのPEEKチューブを挿入し、10オーバー32櫛。19ゲージの針を、シリンジのLuerロックメスアダプタのこのセットアップに交換してください。次に、中間ゴデの外側にニトリル手袋を置き、繊維が滑り落ちないようにし、モーターに損傷を与えないようにします。凝固浴として使用するために99%純粋なイソプロパノールと背の高い透明なガラス浴を取得します。イソプロパノールと蒸留水の80〜20の比率で最初のストレッチバスを充填します。第2のストレッチ浴で、イソプロパノールと蒸留水の20〜80の比率を満たす。コンピュータ上のゴデットストレッチシステムを設定します。ファイバー除去の主速度を調整するには、繊維の形成速度と速さによって、ゴデット・トリプレット A 速度のスライド・バーを 1 秒あたり 10 ~ 14 ミリメートルの値に調整します。ゴデットトリプルBストレッチ比のスライドバーを2つに移動して最初のストレッチを開始ストレッチバス1の最終ゴデット、中央上のゴデット、ストレッチバス2の最初のゴデット。2番目のストレッチを開始するには、ゴッドトリプルCストレッチ比のスライドバーをストレッチバス2、最後の上のゴデット、およびワインダーの最終ゴデットの2に移動します。このセットアップは凝固浴の後の最初のゴデット、そして最初のストレッチバスの最初のゴデットが同じ速度で回転していることを保障する。次に、カスタムスピンライン機器の注射器にシルク溶液をロードします。自動化システムでは、イソプロパノールで満たされたガラス凝固浴にシルク溶液を押し出すために、1秒あたり10ミリメートルに押し出し速度を設定します。薄い金属フックで繊維を風呂から引き出す前に、繊維の押出しが均一になるようにします。お風呂から繊維を取り外して、PEEKチューブチップと、バースから出る繊維の経路の間にループが生じることを確認します。一連のゴダを通して取得した繊維を導き、繊維はストレッチバスに沈むが、ストレッチバスの間の空気中で乾燥し、スプールに入る前に。このプロトコルでは、組換えクモ糸タンパク質の可溶化を通じて、様々な材料形態を達成することができる。ここでは、7つの材料形式を紹介します。ヒドロゲル、リオゲル、スポンジ、接着剤、コーティング、フィルム、繊維。繊維は凝固浴に押し出すことによって最も広範な処理を要求し、次にポストビン伸縮浴で生繊維を連続的に伸ばす。タンパク質および水溶液が比較的高温および圧力に加熱されることを考えると、我々の経験は、タンパク質が溶媒和された時点で溶液が無菌であるということであった。これにより、ここで提示される材料形態のいずれかを細胞培養に持ち込み、適切に取り扱う限り、材料に対する細胞応答を研究することができます。確かにこの技術は、接着剤やスポンジ材料を含む新しい材料形態の発見につながっています。繊維形成に向けて必ずしも向いているわけではない材料形態は、繊維形成もこの技術の開発を通じて改善を見た分野の一つである。密閉されたバイアルの内部に熱と圧力を発生させることは、固有の危険を持っています。これらの手順を実行する際には、必ず個人用保護具を着用してください。

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熱と圧力を用いた水性溶媒和による組み換えクモ絹の材料形成

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