Name: 精製と筋前駆細胞移植派生エクソソーム デュシェンヌ型筋ジストロフィー マウスの心機能を改善するために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶ筋前駆細胞由来エクソソームの精製と心筋内移植法。デュシェンヌ型筋ジストロフィーマウスの心機能改善とジストロフィン発現増加を評価する技術を習得できます。

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唐は部分的に米国心臓協会によって支えられた: GRNT31430008, NIH AR070029, NIH HL086555, NIH HL134354。

動物は、承認されたプロトコルおよび機関動物ケアとオーガスタ大学ジョージア医科大学の利用委員会の動物福祉規則に従って処理されていました。
1 MPC 派生エクソソームの分離, 精製
<ol><li>20 mL 完全・ ダルベッコと 15 cm 細胞培養皿の中シード 5 x 106 C2C12 細胞変更イーグル培地 (DMEM) 10% 牛胎児血清 (FBS)、100 U/mL ペニシリン G および 100 μ g/mL ストレプトマイシンを含みます。37 ° C と 5% CO2で孵化させなさい。</li>
	<li>FBS の 100,000 × gで遠心スイング バケツの回転子を使用して 4 ° C で 18 h のエキソソーム枯渇媒体を準備します。ペレットを破棄します。</li>
	<li>単層細胞培養皿で 80% の合流点に達するときエキソソーム枯渇の中で完全な DMEM を置き換えます。</li>
	<li>転送ピペットを使用して、細胞培養ディッシュ計 3 回のすべての 48 h から上澄みを収集します。50 mL 遠沈管で残りのセルを削除する 10 分間 150 × gで遠心上清を収集します。</li>
	<li>細胞の残骸を除去するために 0.22 μ m のフィルターを通して、上澄みをフィルターします。遠心フィルター エクソソームを沈殿させる 4 ° C で 120 分 100,000 × gでスイング バケツの回転子を使用して超クリアなチューブ中。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でエキソソームを含むペレットを再懸濁します、PBS と全体の超クリアなチューブを埋めます。汚染タンパク質を除去するために 4 ° C で 120 分のこの懸濁液 100,000 × gで遠心を実行します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、100 μ L の PBS でエキソソーム ペレットを再懸濁します。将来の使用に備えて-80 ° C で保存します。</li>
	<li>電子顕微鏡による解析、室温で 5 分間 200 メッシュ ホルムバール被覆銅電子顕微鏡グリッド上 exosomal 懸濁液の 3 μ L を配置します。23の染色標準 005. を続行します。透過電子顕微鏡によるセミドライ グリッドを確認します。</li>
</ol>2. 心筋エキソソーム配信
注:各グループの六つのマウスを使いました。
<ol><li>DBA/2 j-DMDMDXマウス (男性; 年齢 > 10 ヶ月、体重 (BW) > 18 g) を 100 mg/kg BW ケタミン 10 mg/kg BW、キシラジンの併用腹腔注射で麻酔し、つま先ピンチによって麻酔の深さを確認します。</li>
	<li>臥位手術のプラットフォーム上で各マウスを修正するには、テープを使用して各肢を確保し、3-0 縫合場所で上顎を保持する上の歯の下に水平に配置します。</li>
	<li>脱毛クリームを皮膚から毛皮を削除するマウスの胸の左側に適用されます。</li>
	<li>24 G カテーテルを用いた口腔内から気管内挿管を行いマウス齧歯動物人工呼吸器を使用して 195 の呼吸/分の速度で部屋の空気を換気 (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>75% アルコール 10% ポビドン ヨードと皮膚を消毒します。</li>
	<li>10\u201215 mm 斜切開左胸骨端から向かって左側の脇の下を作る、はさみ、によって、大胸筋および小胸筋をカット、第 4 肋間スペースを通って左開胸を行います。10 mm の幅に胸腔を広げるためリトラクター バンドをそっと挿入します。左の肺への損傷を避けるために注意してください。</li>
	<li>心膜を削除し、それらを抜く際、中心部を公開するリトラクター ヒントの背後にそれらを置く 2 つのストレート ピンセットを使用します。MPC Exo を注入 (30 μ L の PBS で 50 μ g) または 1 つのサイトで 31 G インスリンの針を使用して左心室の前壁に 30 μ L の PBS (コントロール) として intramyocardially。</li>
	<li>6-0 ナイロン縫合糸を使用して、シーケンスの胸腔内、大胸筋の筋肉と皮膚を閉じます。</li>
	<li>マウスを回復します。リズミカルな自発呼吸があれば、一度人工呼吸器と extubate から、マウスを削除します。観察し、手術後マウスの状態を記録します。</li>
</ol>3. 心エコー
注:実験群に目がくらんで、単一の観察者は、心エコー検査、データ分析を行います。
<ol><li>PBS/エキソソーム移植後 2 日間は麻酔 1\u20122% イソフルランとマウスです。</li>
	<li>テープを使用して仰臥位の位置でマウスを修正し、左胸の部分に予熱音響ゲルを適用します。</li>
	<li>
前述の16,24として、心エコー法による左室機能を評価します。
	<ol>
<li>2 次元 (B モード)、左心室 (LV) の傍胸骨長軸ビューを取得し、乳頭筋レベルで LV の短い軸のビューを取得する超音波プローブ 90 ° を回転します。</li>
		<li>M モード心エコー画像を記録し、メジャー左心室末期径 (LVEDD)、左室収縮末期容積 (LVESD)、左心室末期容積 (LVEDV)、左室収縮末期容積 (LVESV)。 注:短縮率 (FS %) = [(LVEDD − LVESD)/LVEDD 】 x 100、および左室駆出率 (LVEF %) = [(LVEDV − LVESV)/LVEDV] x 100。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 免疫組織化学
<ol><li>PBS/エキソソーム移植後 2 日間は (参照ステップ 2.1) マウスを麻酔し、胸骨を切開胸腔内を公開します。下大静脈の解剖、3 ml の PBS、常温で 4% パラホルムアルデヒドの 3 mL に続いて 5 mL 注射器に付いている 25 G 針と蝶カテーテルを用いた左心室尖を通して心臓を灌流します。</li>
	<li>固定の心を埋め込むパラフィンで、5 μ m 厚いセクションにカットします。</li>
	<li>キシレンのスライドを deparaffinize、次の順序でのエタノール溶液から水分補給: 100% キシレン (3 分)、100% キシレン (3 分)、100% エタノール (1 分)、100% エタノール (1 分)、95% エタノール (1 分)、80% エタノール (1 分)、H2O (1 分)。</li>
	<li>組織切片を室温で 8 分 4% パラホルムアルデヒドで固定します。</li>
	<li>クエン酸ナトリウム (0.01 M、pH 6.0) のスライドを没頭し、抗原レトリーバーを用いた抗原検索を実行します。</li>
	<li>PBS で 1% ポリエチレング リコール tert-オクチルフェニル エーテルと室温で 1 時間のセクションを permeabilize します。</li>
	<li>室温で 1 時間 PBS で 5% ヤギ血清を使用してセクションをブロックします。</li>
	<li>希釈した一次抗体 (抗ジストロフィン抗体) PBS (1: 100) で 4 ° C で一晩でセクションをインキュベートし、5 分 3 回を PBS で洗浄します。</li>
	<li>セクション希釈した二次抗体 (Alexa Fluor 488 標識ヤギ抗うさぎ IgG) PBS (1: 400) で常温で 45 分間、インキュベートします。</li>
	<li>蛍光が蛍光消光キット (材料の表を参照) を使用してコントロールします。</li>
	<li>使用マウント培 DAPI (材料の表を参照)、スライドをマウントします。</li>
	<li>共焦点顕微鏡のスライドを確認します。</li>
</ol>

<ol><li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Paediatrics+and+Child+Health%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li>
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<li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li>
<li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li>
<li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268(2016).</li>
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</ol>

すべての著者は、利害の対立があるないことを宣言します。

純粋なエクソソームを分離する方法は、エクソソームの機能を研究するために不可欠です。エキソソーム分離の一般的なテクニックの 1 つはポリエチレン グリコール (ペグ) を介した降水量17,18,25です。エクソソームを釘で沈殿し、低速遠心分離によってペレットできます。ペグを介した浄化は非常に便利で、低コスト、それは任意の高度な機器を必要はありませんが、他のリポタンパク質一緒に沈殿することがあります、削除しにくいのでエクソソームの純度についての懸念があります。限外濾過は分子量と除外サイズ制限26に基づいてエキソソーム分離のため定期的な方法です。限外ろ過分離による遠心分離より高速ですが、大きい小胞構造上の損傷を引き起こすことができます。膜エクソソーム CD9、CD63 と CD8127などのさまざまなエピトープの存在は、これらのエピトープと抗体磁性ビーズに結合イム...

デュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD) は X 連鎖劣性、進歩的な神経筋疾患です DMD 遺伝子と機能ジストロフィン1の損失の突然変異によって引き起こされます。ジストロフィンは主に骨格筋や心筋、表し、少ない平滑筋と腺内分泌ニューロン2,3で表されます。DMD は、3,500 に 5,000 新生児男の子世界4、5の 1 の発生率と筋ジストロフィーの最も一般的なタイプです。個人は通常進行性筋壊死、思春期、および心不全と呼吸不全6のための彼らの生命の第 2 から第十年の死によって歩行自立の損失を開発します。
拡張型心筋症、不整脈、うっ血性心不全は、DMD7,8の一般的な心血管症状です。病気を治癒することはできません、支持療法が症状を改善したり、心不全の進行を遅らせるが、心臓機能9,10を改善するために非常に困難です。
DMD 患者は、X-リンクされている筋ジストロフィーのよう (MDX) マウスはジストロフィン蛋白質および11心筋症の症状を呈するに欠乏しているし、関連付けられている DMD 心筋症研究で広く使用されしたがって。影響を受ける筋肉のジストロフィンを復元、するために同種造血幹細胞治療は、DMD12,13,14の効果的な治療であると証明しました。各種細胞から分泌される 30-150 nm 膜小胞エクソソームはメッセンジャー RNA (mRNA)、非コーディング RNAs15,16,17 などの遺伝学的物質輸送による細胞間コミュニケーションの重要な役割を再生します。 ,18,19,20,21。
私たちの以前の研究に由来する筋前駆細胞 (MPC)、C2C12 細胞株などエクソソームはジストロフィンを転送できることを示されているホスト心筋心臓噴22後の同種の配信にしたを示す mRNAMPC 派生エクソソーム (MPC-エキソ) 一過性 MDX マウスにおける DMD 遺伝子発現を復元できます。MPC-エキソ精製と移植技術について説明します。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上 μ;m フィルター</td><td>フィッシャーブランド</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>15 cm 細胞培養皿</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>24 G カテーテル</td><td>テルモ</td><td>SR-OX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>31 G インスリン針</td><td>BD</td><td>328291</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6-0 縫合</td>糸 <td>Pro Advantage by NDC</td><td>P420697</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ 抗ウサギ IgG</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質 抗真菌剤</td>溶液 <td>コーニング&nbsp;</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>抗ジストロフィン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>抗原回収試薬&nbsp;</td><td>Aptum Biologics</td><td>R2100-US</td><td>抗原回収</td></tr><tr><td>自家蛍光消光キット&nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-8400</td><td></td></tr><tr><td>C2C12細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Unico</td><td>C8606</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip High Temp Cauteries</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>HIT</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 780 Upright Confocal</td><td></td></tr><tr><td>DBA/2J-mdx マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>013141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>10-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>191356</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Henry Schein</td><td>056344</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium with DAPI&nbsp;</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>マウスリトラクターセット</td><td>ケントサイエンティフィック</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール tert-オクチルフェニルエーテル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>げっ歯類の人工呼吸器</td><td>ハーバード装置</td><td>55-7066</td><td></td></tr><tr><td>SW-28 Ti</td>ローター <td>ベックマン 342207</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 イメージングプラットフォーム</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td>超音波診断装置&nbsp;</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラクリアチューブ</td><td>ベックマン</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン (キシラメッド)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td>1XYL003 8XYL006</td><td></td></tr></tbody></table>

精製と筋前駆細胞移植派生エクソソーム デュシェンヌ型筋ジストロフィー マウスの心機能を改善するために

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

デュシェーヌ型筋ジストロフィー (DMD) は、X 連鎖劣性遺伝病機能ジストロフィン蛋白質の欠乏によって引き起こされます。病気を治癒することはできませんと進行するにつれて、患者は拡張型心筋症、不整脈、うっ血性心不全の症状を開発します。DMDMDX変異マウスは、ジストロフィンを発現していないと、DMD のマウスのモデルとして使われます。最近の研究では、我々 は観察幅広タイプ (WT) 心筋内注射すること-筋前駆細胞由来エクソソーム (MPC-エキソ) は一過性だった関連付けられている DMDMDX変異マウスの心筋内のジストロフィンの発現を復元示唆して心臓の機能の一時的な改善で WT MPC エキソ DMD の心臓の症状を緩和するためのオプションがあります。この記事では、MPC-エキソ精製と DMDMDX変異マウスの心移植の手法について説明します。

分離し、C2C12 細胞からエクソソームを浄化のフローチャートを図 1に示します。エクソソームの存在を確認するには、透過電子顕微鏡による解析を行った。透過電子顕微鏡像 (図 1B) は、派生した C2C12 エクソソームの明るいとラウンド形状の小胞の形態を示しています。西部のしみの分析は CD63 と TSG101 を含むエキソソーム マーカーの存在を確認した (図 1C)。
心筋注入の成功を示す心筋 MDX マウス (図 2)、左心室の前壁に PBS/MPC-エキソ注入後半透明浮腫領域を観測しました。
免疫蛍光染色、ジストロフィンと共焦点顕微鏡とイメージングを行った心臓 MPC-エキソ配信...

一過性エクソソーム通常筋前駆細胞由来の移植によるデュシェンヌ型筋ジストロフィー マウスの心機能を改善するためにプロトコルを紹介します。

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

このプロトコルは、正常な筋原性前駆細胞由来のエクソンを移植することによって、デュシェンヌの筋ジストロフィーマウスにおける心機能を移行的に改善する方法を提示する。外皮移植は、レシピエント心臓におけるジストロフィーの発現増加に関連してDMDマウスの心臓機能を改善することができる。エキサの分離、精製、筋膜内移植のための適切な方法は、デュシェンヌの筋ジストロフィーを有するマウスの心臓機能を改善するために、エクソン移植の成功に寄与する。MPC由来のエキソソーム療法は、外因性媒介性正常なジストロフィンmRNA転移によって骨格筋機能を改善する可能性がある。このビデオでは、外因性精製、心筋外因性分娩、および心エコー検査後移植のための重要な技術を示す。心エコー検査のデモンストレーションは、研究室の技術者であるヤン・シェンによって行われます。この手順を開始するには、500万個のC2C12細胞を15センチメートルの培養皿に種付けし、10%FBSと抗生物質を含む完全なDMEMを20ミリリットルで培養します。5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。次に、スイングバケットローターを使用して、100,000倍GでFBSを超遠心分離し、摂氏4度で18時間使用して、エキソソーム枯渇培地を調製します。ペレットを捨てて上清を集める。単層細胞が培養皿中で80%の合流に達したら、完全なDMEMをエキソソーム枯渇培地に置き換えます。移管ピペットを使用して、48時間ごとに細胞培養皿から上清を収集します。チューブを150回Gで10分間遠心し、残りの細胞を除去する。上清を0.22マイクロメートルのフィルターでフィルターして、細胞の破片を除去し、フィルターした媒体を超透明の管に移します。次に、スイングバケットローターを使用して、チューブを100、00倍G、摂氏4度で120分間超遠心分離し、エキソソームを沈殿させます。PBS中のエキソソーム含有ペレットを再懸濁し、超透明チューブ全体をPBSで満たします。この懸濁液を100,00倍Gで、摂氏4度で120分間超遠心分離し、汚染タンパク質を排除します。上清を捨て、100マイクロリットルのPBSでエキソソームペレットを再懸濁します。将来の使用のためにマイナス80°Cで保管してください。まず、各手足をテープで固定することにより、手術用プラットフォーム上の上の上の位置に麻酔をしたマウスを固定する。上の歯の下に3-0縫合糸を水平に置き、上顎を所定の位置に保持します。次に、マウスの胸の左側に脱毛クリームを塗布し、皮膚からモミを取り除きます。24ゲージのカテーテルを使用して、口腔を介して気管内挿管を行う。そして、1分間に195呼吸の速度で部屋の空気でマウスを換気するためにげっ歯類の換気装置を使用してください。70%アルコールと10%ポビドネヨウ素で皮膚を消毒します。その後、左胸骨端から左脇の下まで10〜15ミリメートル斜め切開を行います。はさみを使用して大胸筋と小胸部をカットします。そして、4番目の沿岸間空間を通って左の分腔序を作ります。左肺に損傷を与えないので、胸腔を10ミリメートルの幅に広げるために、レトラクタバンドをそっと挿入します。この後、2つのストレートピンセットを使用して心膜を取り除きます。それらを引き離し、心臓を露出させるためにリトラクターの先端の後ろにそれらを置きます。31ゲージのインスリン針を使用して、MPC-ExoまたはPBSのいずれかの心膜内を1つの部位の左心室の前壁に注入する。次に、6-0ナイロン縫合糸を使用して胸腔、胸筋、および皮膚を順番に閉じます。PBSエキソソーム移植の2日後、テキストプロトコルに概説されているようにマウスを麻酔する。テープを使用して、マウスを上弦の位置に固定し、左胸部に予熱された音響ゲルを塗布します。次に、心エコー検査を使用して左心室機能を評価する。左心室のパラスターナル長軸図を2次元で取得し、次いで超音波プローブを90度回転させて、乳頭筋レベルで左心室短軸図を得る。この後、Mモード心エコー画像を記録し、左心室終期拡張期直径、左心室終期収縮期容積、左心室終期期容積、および左心室末期収縮期容積を測定する。マウスの心拍数は、心臓測定機能のために少なくとも400bpmを制御する必要があります。エキソソームをC2C12細胞から単離して精製した後、透過電子顕微鏡分析を用いてその存在が確認される。透過電子顕微鏡画像は、C2C12由来エキソソームの明るい円形の小胞の形態を示す。ウェスタンブロット分析は、CD63およびTsg101を含むエキソソームマーカーの存在を確認する。半透明浮腫領域は、心筋への注入が成功したことを示すmdxマウスの左心室の前心壁への心筋内注入後に観察される。次いで、ジストロフィンの免疫蛍光染色を行い、心臓MPC-Exo送達がMDX心臓におけるジストロフィンタンパク質発現を回復させるかどうかを判断する。ジストロフィン発現の部分的な回復は、心筋細胞の一部における膜局在化で観察される。心機能は、心筋内出産の2日後に心エコー検査によって測定され、MPC-Exoのトランスプロレーションがmdxマウスの心機能を改善するかどうかを決定する。MPC-Exo治療はPBSと比較して内壁の動きを改善することが見られ、MPC-Exo移植がmdxマウスの心臓機能を改善したことを示唆している。約20度の先端で31ゲージのインスリン針を使用することは、心筋薬へのほとんどのエキソソームの送達に成功するために重要であり、心筋細胞をホストするために注入されたエキソソームの暴露を最大化する。手順に従って、ジストロフィン発現は、MPC由来エキソソーム送達がジストロフィンタンパク質発現を回復することを示す免疫蛍光染色法によるMPC由来エキソソーム注射後に検出することができる。この技術は、DNA、mRNA、lncRNA、またはマイクロRNAを含むエキソソームを運ぶ治療遺伝物質による心筋症治療への道を開く。

purification-transplantation-myogenic-progenitor-cell-derived

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

誘導多能性幹細胞(iPSC)由来の筋原性前駆細胞は、筋ジストロフィーを治療するための細胞治療戦略の有望な候補である。このプロトコルは、急性および慢性筋肉再生のマウスモデルにおけるiPSC由来メソアンジオ芽細胞(筋前駆体の一種)の生着および分化を評価するために必要な移植および機能的測定について記述する。...

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

静止衛星細胞の純粋な集団の単離および培養、筋肉幹細胞集団は、筋肉幹細胞生物学および再生、ならびに筋ジストロフィーおよび他の変性疾患における治療のための幹細胞移植の理解に不可欠である。...

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

このプロトコルは、筋ジストロフィー患者からの尿由来細胞の分離のための詳細な手順を伴います。それらは、センダイウイルスの形質導入を通じて効率的かつ迅速に再プログラミングされます。...

筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

我々は、心筋細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞およびパッチ媒介性サイトカインの送達と細胞注射を組み合わせることにより、移植細胞の生着を改善する配送方法に、ヒト人工多能性幹細胞を分化するための3つの新規かつより効率的なプロトコルを提示します。...

多能性幹細胞は、心筋の修復のための心臓細胞を派生します

ここで生体内で心臓遺伝子組換えアデノ ウイルス (下さい rAAV) を用いたマウスで編集を実行する詳細なプロトコルを提供-CRISPR...

心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信

ここでは、Dmdmdxマウス由来皮膚線維芽細胞からiPSC中のジストロフィン発現を復元し、Tet-on...

iPSC由来筋前駆体におけるジストロフィン発現の回復に関するCRISPR/Cas9技術

複雑な人間の疾患は、従来の実験室モデルシステムでモデル化するのが難しい場合があります。ここでは、ヒト骨格筋生検を免疫不不十分マウスに移植することにより、ヒト筋疾患をモデル化する外科的アプローチについて述べた。...

免疫不全マウスにおけるヒト骨格筋異種移植片の実行

本稿では、MYOD1変換尿由来細胞を用いてデュシェンヌ型筋の効率的なモデリングのための詳細なプロトコルを説明し、エキソンスキップ後のジストロフィンmRNAおよびタンパク質レベルの回復を評価する。...

ヒト尿由来細胞から得られた直接再プログラムされた筋チューブでのエキソンスキップ

このプロトコルは1)大人マウス腓腹筋からの第一次線維芽細胞の隔離そして文化、また2)西部のしみの分析に先行しているスクロース密度勾配と結合される差動ultrarifjugeation方法を使用してexosomesの浄化そして性格描写を示す。...

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

このプロトコルは、皮膚線維芽細胞を筋芽細胞に変換し、その分化を筋管に変換することを記述する。細胞株は神経筋疾患の患者に由来し、病理学的メカニズムを調査し、治療戦略をテストするために使用することができる。...

神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

マウスの心筋梗塞部位周辺の超音波ガイド下細胞送達は、安全で効果的で便利な細胞移植方法です。...

心筋梗塞マウスにおける超音波ガイド下多能性幹細胞由来心筋細胞移植術

学ぶ筋前駆細胞由来エクソソームの精製と心筋内移植法。デュシェンヌ型筋ジストロフィーマウスの心機能改善とジストロフィン発現増加を評価する技術を習得できます。

精製と筋前駆細胞移植派生エクソソームデュシェンヌ型筋ジストロフィーマウスの心機能を改善するために

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精製と筋前駆細胞移植派生エクソソーム デュシェンヌ型筋ジストロフィー マウスの心機能を改善するために

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