Name: PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶ PiggyBacベクターを用いたiPSCsから機能的脊髄・頭蓋運動ニューロンへの分化プロトコル。電気生理学的特性評価とALSモデリング・創薬スクリーニングへの応用を含む。

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著者は、サポートと技術的なアドバイスのための生命ナノサイエンス、Istituto イタリアディ Tecnologia のためのセンターでイメージング施設に感謝したいと思います。私たちは、有益な議論のための生命ナノ科学センターのメンバーに感謝しています。この作業は、AriSLA (パイロットグラント 2016 "StressFUS") から AR への助成金によって部分的にサポートされました。

1. 人間の iPSCs の維持
<ol><li>
マトリックスコーティングプレートの調製
	<ol>
<li>4° c のマトリクス (材料の表を参照) の1つの 5 mL バイアルを一晩解凍します。元のマトリックス株は異なるストック濃度で来て、アリコートは個々のロットに特異的なデータシートに示された希釈倍率に従って作られる。マトリックスの早期ゲル化を防ぐためにバイアルとチューブの氷を冷たく保つことが重要です。氷の前に冷やされた cryotubes のアリコートにマトリックスを分配しなさい。-20 ° c で未使用のアリコートを凍らせます。</li>
		<li>1つのアリコートを氷上で約2時間、解凍します。</li>
		<li>50 mL の円錐形の管の冷たい DMEM/F12 の20の mL が付いているマトリックスのアリコートを希釈しなさい。</li>
		<li>よく混ぜて 35 mm の皿 (他の料理の表面積ごとの同等の量) に希釈されたマトリックスの 1 mL を分配してください。</li>
		<li>1時間室温で希釈したマトリックスを含む食器を使用して、コーティングを可能にします。 注:パラフィルムで密封された皿は、2週間まで4° c で貯えることができる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
原液の調製 (20 mL) と、穏やかな細胞解離試薬の1x 作業アリコート(資料表参照)。<ol>
<li>粉末を PBS 中で 10mg/mL に溶解させます (Ca2+/Mg+ free)。</li>
		<li>0.22 μ m フィルター膜を通してフィルター消毒。</li>
		<li>20個のアリコート (それぞれ 1ml) を用意し、-20 ° c で保管してください。</li>
		<li>使用前に、PBS (Ca2+/Mg2 + free) の1アリコートを 1 Mg/mL (1x 作業アリコート) に希釈してください。 注: 1x 作業アリコートは、2週間まで4° c で保存することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
継代人間の iPSCs。
	<ol>
<li>開始前: 4 ° c で保存する場合、37° c のインキュベーター内で20-30 分間の前温マトリックスコーティングされたプレートを室温で予熱する必要がありましたヒト iPSC 培地 (材料の表を参照) の量。DMEM/F12 を予温する。</li>
		<li>培養液を吸引する。</li>
		<li>PBS (Ca2 +/Mg2 + free) で iPSCs をすすぎます。</li>
		<li>1x ジェントル解離溶液 (35 mm ディッシュに 0.5 mL) を加えます。コロニーの端がプレートから剥離し始めるまで37° c でインキュベート, 通常3-5 分.</li>
		<li>穏やかな解離溶液を吸引し、iPSC コロニーを分離しないように注意する。</li>
		<li>細胞を DMEM/F12 (35 mm ディッシュで 2ml) で洗浄し、細胞を切断しないように注意して吸引します。この手順をもう一度繰り返します。</li>
		<li>ヒト iPSC 培地 (35 mm ディッシュに 1ml) を加えます。</li>
		<li>細胞リフターでコロニーを静かに切り離し、15 mL のチューブに移します。</li>
		<li>P1000 pipettor 3-4 回で、セルの束をゆっくりとピペットで押して、静かに切断します。</li>
		<li>マトリックスコーティングされたプレートから上清を吸引する (s)。</li>
		<li>ヒト iPSC 培地の適切な培養容積中に細胞を播種する。スプリット比は、行ごとに異なることができ、約1:4-1:8 です。メディアを毎日変更します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NIL およびニップ誘導性 iPSC 線の生成
<ol><li>
細胞トランスフェクション。
	<ol>
<li>PBS (Ca2+/Mg+ free) で細胞をすすいでください。</li>
		<li>細胞解離試薬 (材料の表を参照) を加え (35 mm ディッシュは 0.35 mL)、単一の細胞が分離されるまで37° c でインキュベートします (5-10 min)。</li>
		<li>P1000 pipettor 3-4 回で、上下にピペッティングして細胞の分離を静かに完了します。</li>
		<li>15 mL チューブで収集し、PBS (Ca2+/Mg2 + free) を10ml に添加します。セルをカウントします。</li>
		<li>ペレット 106細胞および再懸濁は、100μ l のバッファ R (エレクトロポレーションキットの細胞に含まれる、材料の表を参照)。</li>
		<li>トランスフェクションのためのプラスミド DNA を追加します: 転移因子ベクターの4.5 μ g (epB-Bsd-TT-NIL または epB-Bsd-TT-NIP12) および piggyBac トランスポゼースプラスミド13の0.5 μ g。</li>
		<li>トランスフェクトは、製造元の指示に従ってセルのエレクトロポレーションシステム (資料の表を参照) を使用し、前述の3 つのパラメータを使用して、1200 V 電圧、30 ms 幅、1パルスを示します。ヒト iPSC 培地中に細胞を播種し、6 mm マトリックスコーティングされた皿に10μ m Y-27632 (岩石阻害剤、材料表を参照) を添加した。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
抗生物質による選択。
	<ol>
<li>トランスフェクションの2日後に、培養培地に5μ g/mL ブラスチシジンを加えます。</li>
		<li>非トランスフェクトされた細胞のほとんどは、ブラスチシジン選択の 48 h 以内に死亡する。ゲノム中のトランスジーンを統合していない細胞をブラスチシジンに、少なくとも7-10 日間細胞を再選択するようにしてください。</li>
		<li>混合集団として安定的にトランスフェクトされた細胞を維持し、異なる数のトランスジーンおよび異なる集積部位を有する細胞から構成される、または単一クローンを単離する。</li>
		<li>Ngn2 (フォワード: TATGCACCTCACCTCCCCATAG のためのトランスジーン特異的プライマーを用いた RT-PCR により、1μ g/mL のドキシサイクリン誘導時にトランスジーンの効果的な発現をチェックする追加の皿を準備します。逆: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT)、前述したように12.</li>
		<li>この段階では、ヒト iPSCs のための凍結培地において新規の NIL-およびニップ− iPSC 線のストックを凍結する (材料の表を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 運動ニューロン分化
<ol><li>細胞を解離試薬の細胞と分離して説明する (手順 2.1.1.-2.1.3.)。15 mL チューブで細胞を解離させると、5倍量の DMEM/F12 で希釈します。ペレット細胞および再懸濁をヒト iPSC 培地中で、10μ m の ROCK 阻害剤を添加した。62500細胞/cm2 の密度でマトリックスコーティングされた皿の細胞そして種を数える。</li>
	<li>その翌日、培地を DMEM/F12 と交換し、1個の安定した L-グルタミンアナログ、1x の非必須アミノ酸 (NEAA) 細胞培養サプリメントおよび 0.5 x ペニシリン/ストレプトマイシンを添加して、3μ g/mL のドキシサイクリンを含む。これは、分化の0日目とみなされます。1日目に、培地とドキシサイクリンをリフレッシュします。</li>
	<li>2日目に、培地を Neurobasal/B27 培地に変更し (Neurobasal 培地に 1x B27、1x 安定 L-グルタミンアナログ、1x NEAA、0.5 x ペニシリン/ストレプトマイシン) を添加し、5μ m DAPT、4μ m SU5402 および1μ g/mL のドキシサイクリンを含む (資料表参照).5日目まで毎日の培地とドキシサイクリンをリフレッシュ。</li>
	<li>
5 日目: 細胞解離試薬による解離(資料表参照)。<ol>
<li>PBS (Ca2+/Mg+ free) で細胞をすすいでください。</li>
		<li>細胞解離試薬 (35 mm ディッシュは 0.35 mL) を加え、細胞単層全体がディッシュから分離するまで37° c でインキュベートします。単一の細胞はインキュベーションの間に分離されないことに注意してください。</li>
		<li>1ml/F12 の 1 mL を追加し、15 mL のチューブで細胞を収集します。.</li>
		<li>P1000 pipettor 10-15 回で、上下にピペッティングして細胞の分離を静かに完了します。</li>
		<li>4 mL の DMEM/F12 を加え、細胞を数える。</li>
		<li>この段階では、凍結運動ニューロンは、製造業者の指示に従って、細胞凍結培地で前駆細胞 (材料の表を参照)。</li>
		<li>ペレットを神経媒体中の細胞および再懸濁 (Neurobasal/B27 培地に添加した 20 ng/mL の BDNF、10 ng/mL の GDNF および 200 ng/ml の L-アスコルビン酸、10μ m ROCK 阻害剤を添加した材料の表を参照のこと)。</li>
		<li>ポリオルニチン/ラミニン上の細胞をシード-または10万細胞/cm2 の密度でマトリックスコーティング支持体。免疫染色の分析のためにポリマーカバースリップ (材料の表を参照) とのμ-スライドのプラスチックサポートを使用しなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>6日目に、ROCK 阻害剤を欠く新鮮な神経媒体で培地を変更する。次の日には、メディアの半分を3日ごとに更新します。培養媒体は、表面からの剥離を防ぐために、非常に慎重に変更する必要があります。</li>
</ol>4. 免疫染色分析
<ol><li>細胞固定。PBS で細胞をすすぎ (Ca2+/Mg +)、室温で pbs 中の 4% パラホルムアルデヒド (ca2+/Mg2 +) で15分間インキュベートします。 注意:パラホルムアルデヒドは有毒であり、癌を引き起こす可能性が疑われる。皮膚や目との接触を避け、化学ヒュームフードの下で取り扱います。</li>
	<li>室温で5分 0.1% のトリトン X-100 を含んでいる PBS (Ca2+/Mg2 +と) の透過処理。</li>
	<li>抗体ブロッキング溶液 (ABS: PBS 中の 3% BSA で Ca2 +/Mg2 +) で30分間インキュベートします。</li>
	<li>ABS の一次抗体を用いて室温で1時間インキュベートする: 抗 TUJ1 (1:1000; ウサギ) および抗 Oct4 (1:200; マウス) またはアンチ・チャット (抗コリンアセチルトランスフェラーゼ; 1:150; ヤギ)。資料の表を参照してください。</li>
	<li>適切なロバを使用して室温で45分インキュベートしてください。 ABS では、抗マウス alexa fluor 647 (1:250)、抗ウサギ594アレクサ fluor (1:250)、抗ヤギアレクサ fluor 488 (1:250)。資料の表を参照してください。</li>
	<li>室温で5分間0.4 μ g/mL DAPI でインキュベートし、核にラベルを付けます。</li>
	<li>蛍光顕微鏡で撮像するための埋込媒体 (材料表参照) で細胞をマウントします。</li>
</ol>5. パッチクランプによる機能評価
<ol><li>HEPES 平衡型外部溶液 (NE) を次のように準備します: 140 mM NaCl、2.8 mM KCl、2 mM CaCl2、2 mm MgCl2、10 mm HEPES、および 10 mm グルコース。290-300 m ωの間のオスモル濃度を設定します。1N NaOH を使用して pH を7.3 に調整し、溶液を4° c で保存します。</li>
	<li>内部溶液を準備する: 140 mM K-グルコン酸塩、2mm NaCl、5mm BAPTA、2mm MgCl2、10ミリメートル HEPES、2ミリメートル MG-ATP、0.3 mm NA-GTP。PH を1M の KOH で7.3 に調整し、オスモル濃度が約 290 m ωに設定されていることを確認します。溶液を-20 ° c で小さなアリコートで凍らせる。</li>
	<li>実験を実行する前に、約28-30 ° c の水浴中で NES 溶液を予温する。</li>
	<li>ホウケイ酸 micropipettes (ID 0.86 mm を引っ張ってください。先端の抵抗を支える OD 1.5 mm): 5-6 m ωおよびピペットのホールダーに取付ける前に細胞内の解決を満たしなさい。 注:配線表面に AgCl の均一な層を形成するためには少なくとも30分間漂白剤中の記録電極と参照電極の塩化銀ワイヤーに注意してください。</li>
	<li>記録室にペトリ皿を移し、1-2 mL/min の NES の解決の部屋をしなさい。溶液を暖かく保つために、30° c の温度に設定されたインラインヒーターを通過する流れをしてみましょう。</li>
	<li>電気生理学的記録室を直立顕微鏡で配置する。パッチクランプアンプで膜電流を記録し、適切なソフトウェアでデータを集録します。</li>
	<li>アンプ制御ソフトウェアを開き、値1の信号ゲインと 10 kHz のベッセルフィルタを設定します。ベッセルフィルタがサンプリング周波数よりも2.5 倍低いことを確認します。</li>
	<li>記録ソフトウェアの電圧クランプおよび電流クランプ実験のための実験プロトコルを設定します。</li>
	<li>プロトコル設定では、エピソード刺激モードをチェックし、25 kHz でサンプリング周波数を設定します。次に、[波形] タブに移動し、次のように電圧または現在のステップの振幅と長さを入力します。</li>
	<li>電位依存性ナトリウム電流の場合、15個の電圧ステップ (それぞれ 50 ms 持続時間) を-100 mV から + 40 mV (10 mV インクリメント) で使用します。パッチを適用したセルに、アンプを通して-60 mV の保持電位を課すと、プロトコルを実行します。同様に、電圧依存性カリウム電流は、記録されたセルを-40 mV に保持する-30 mV から + 50 mV (10 mV インクリメント) までの電圧ステップ (それぞれ 250 ms 持続時間) によって誘発します。</li>
	<li>IPSC 派生頭蓋および脊髄 MNs の発火特性を調べるために、クランプ細胞を、電流クランプモードで、膜電位で-70 mV と (+ 20 pA から + 80 pA; 20 pA インクリメント) の増加振幅の4現在のパルス (1 秒の持続時間) を使用します。</li>
	<li>各セル電圧活性化電流、誘発焼成活性、および全細胞容量 (Cm) としての3つの受動特性、細胞膜抵抗 (Rm) および静止膜電位 (RMP) を取得します。</li>
</ol>

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</ol>

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このプロトコルは、系統特異的転写因子の異所性発現のおかげで、ヒト iPSCs を脊髄および頭蓋運動ニューロンに効率的に変換することを可能にする。これらのトランスジーンはドキシサイクリンによって誘導され、piggyBac のトランスポゾンベースのベクターのおかげでゲノムに安定的に組み込まれる。混合集団では、piggyBac ベクターの1つまたは複数のコピーが個々の細胞のゲノムにランダムに統合され、ゲノム完全性の変化のリスクが増大する。さらに、iPSC subclones の進行性の選択は、経時的に起こり、疾患および対照細胞株の分化および比較分析のための起こり得る結果を伴う。全体として、このプロトコルで得られた iPSC 由来の MNs は再生医療には不向きであろう。しかしながら、我々の方法は、インビトロ運動ニューロン疾患モデリングに特に有用であり得る。強度の主なポイントは、非常に単純化された培養条件、MN 変換の迅速性、iPSC 由来の MNs の成熟度および脊椎および頭蓋の MNs の両方を得る可能性によって表される、前述のように発現12の特異的マーカー遺伝子の解析。プロトコルの堅牢性は、...

運動ニューロン (MN) 変性は、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) や脊髄筋萎縮 (SMA) などのヒト疾患において原因となる役割を果たしている。ヒト MN の複雑性を不在するインビトロ細胞モデルシステムを確立することは、新しい治療アプローチの開発に向けた重要なステップである。顕著な plurilineage 分化特性を授けられている誘導多能性幹細胞 (iPSCs) は、現在、運動ニューロン疾患1,2によって影響を受ける多くの患者に由来している。MN 疾患に関連した病原性変異を運ぶ付加的な iPSC 線は、遺伝子編集によって生成されており、制御「健常な」多能性幹細胞3から始まる。これらの線は、インビトロ疾患モデリングおよび薬物スクリーニングのための有用なツールを表し、MNs への iPSC 分化のための適切な方法が利用可能であることを提供する。この方法の開発の背後にある理論的根拠は、成熟した機能 MNs を生み出す高速かつ効率的な分化プロトコルで MN 疾患に興味を持って科学的なコミュニティを提供することです。この方法の最初の利点は、実行の時間枠です。強度の別の関連するポイントは、任意の精製工程の排除から来ています。最後に、プロトコルは、運動ニューロンの2つの異なる集団を生成するために使用することができます。
MNs の異なるサブタイプを生成する可能性は、特に MN 疾患のモデル化に関連している。すべての MN 亜型は、ALS および SMA において同様に脆弱であり、異なる運動単位での症状の発症は、予後に大きく影響する。ALS において、上肢および下肢において始まる症状を伴う脊髄発症は、約3-5 年で死に至る4.逆に、球性発症は、頭蓋 MNs の変性から始まり、最悪の予後を有する。さらに、球性発症の割合は、SOD1 変異5を有する個体に比べて RNA 結合タンパク質 FUS および TDP-43 の突然変異を有する患者において有意に高い。代替 MN 分化プロトコールのほぼ全体は、レチノイン酸 (RA) の活性に依存しており、iPSCs6、7、8の鑑別に脊髄特性を付与する。これは、特定の MN 亜型9,10で保護することができる内因性因子を研究する可能性を制限します。
マウス胚性幹細胞11における以前の作業と一致して、我々は最近、ヒトの iPSCs 異所の Ngn2、Isl1 および LHX3 (NIL) が脊髄 MN 同一性を誘導するのに、Ngn2 および Isl1 プラス PHOX2A(ニップ) を頭蓋 MNs を指定することを示した。従って私達はそれ故に12日の転換の機能特性と恵まれた人間の MNs の生産に導く有効な議定書を開発した。この方法の目的は、短時間で、精製を必要とせずに (例えば、FACS によって) 得ることであり、細胞集団は脊髄または頭蓋の同一性を有する MNs に対して高度に濃縮された。

<table><tbody><tr><td>電気生理学的解決策のための</td><td>5-バプタ</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A4926-1G</td>化学薬品</tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A6964-100ML&nbsp;</td><td>細胞解離試薬</td></tr><tr><td>アンチCHAT</td><td>EMDミリポア&nbsp;</td><td>AB144P</td><td>抗コリンアセチルトランスフェラーゼ。免疫染色アッセイに使用される一次抗体。RRID:AB_2079751;ロット番号:</td></tr><tr><td>2971003アンチヤギAlexa Fluor 488&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>A11055</td><td>非単蛍光アッセイに使用される二次抗体。RRID:AB_2534102;ロットナンバー:1915848</td></tr><tr><td>抗マウス Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A31571</td><td>非単蛍光アッセイに使用される二次抗体。RRID:AB_162542;ロットナンバー:</td></tr><tr><td>1757130アンチOct4&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>免疫染色アッセイに使用される一次抗体です。RRID:AB_398736;ロットナンバー:5233722</td></tr><tr><td>anti-Phox2b</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-376997</td><td>免疫染色アッセイに使用される一次抗体。ロットナンバー:E0117</td></tr><tr><td>anti-rabbit Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Immunological Sciences</td><td>IS-20152-1</td> 抗TUJ1 非<td>単蛍光アッセイに用いる二次抗体</td></tr><tr><td></td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>T2200</td><td>免疫染色アッセイに使用される一次抗体。RRID: AB_262133</td></tr><tr><td>B27</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-566</td><td>神経細胞維持のための無血清サプリメント</td></tr><tr><td>バンバンカー</td><td>日本遺伝学</td><td>NGE-BB02</td><td>運動ニューロン前駆細胞にここで使用される細胞凍結培地</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-02</td><td>脳由来神経栄養因子</td></tr><tr><td>ブラストサイジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td>原核生物および真核生物BSA</td></tr><tr><td></td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A2153</td><td>ウシ血清アルブミンにおけるタンパク質合成を阻害するヌクレオシド系抗生物質。免疫染色アッセイにおける抗体の非特異的結合を防止するブロッキング剤</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td> 電気<td>生理学的溶液用</td><td>C3881</td>化学物質</tr><tr><td>Clampex 10ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>Clampex 10</td><td>膜電流記録システム</td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC認定マトリックス</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マウス肉腫からの再構成基底膜調製物。プラスチックやガラスサポートへのiPS細胞の接着に使用</td></tr><tr><td>CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA</td><td>バイオロジカルインダストリーズ</td><td>05-710-1E</td><td>ヒトiPS細胞用凍結培地</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5146</td><td>電気生理学的溶液用化学薬品</td></tr><tr><td>DAPIパウダー</td><td>ロシュ</td><td>10236276001</td><td>4&prime;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。アデニンに結合する蛍光染色。DNA中のチミンリッチ領域 非一蛍光アッセイにおける核染色に使用</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>AdipoGen</td><td>AG-CR1-0016-M005</td><td>ガンマセクレターゼ阻害剤</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>ヒトiPS細胞の穏やかな解離のための試薬</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421-500ML</td><td>細胞培養用基礎培地</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G&nbsp;</td><td>epB-Bsd-TT-NILおよびepB-Bsd-TT-NIPベクターからの導入遺伝子の発現を誘導するために使用</td></tr><tr><td>DS2U&nbsp;</td><td>WiCell</td><td>UWWC1-DS2U</td><td>市販のヒトiPS細胞株</td></tr><tr><td>E.Z.N.A Total RNA Kit&nbsp;</td><td>Omega bio-tek</td><td>R6834-02</td><td>培養真核細胞からのRNA全抽出キット</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-10</td><td>グリア由来神経栄養因子</td></tr><tr><td>Gibco Episomal hiPSCライン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A18945</td><td>市販のヒトiPS細胞ライン</td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050038</td><td>L-グルタミンの代替品で、安定性が向上しています。細胞の健康を改善します。</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>電気生理学的溶液用化学薬品</td></tr><tr><td>iScript RT-qPCR 用 iScript 逆転写スーパーミックス&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1708841</td><td>キット リアルタイム qPCR</td></tr><tr><td>iTaqTM Universal SYBR Green Supermix</td> を使用した遺伝子発現解析用&nbsp;<td>バイオ・ラッド</td><td>172-5121&nbsp;</td><td>あらゆるリアルタイムPCR装置での色素ベースの定量PCR(qPCR)に最適化された、すぐに使用できる反応マスターミックス</td></tr><tr><td>K-グルコン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>電気生理液用化学薬品</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>電気生理学的溶液用薬品</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>LKT Laboratories</td><td>A7210</td><td>細胞培養に抗酸化物質として使用</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11243217001</td><td>in vitro 神経細胞の付着と増殖を促進します</td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス</td><td>&nbsp;iX83 FluoView1200</td><td>免疫染色画像取得用共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td> 電気<td>生理液用</td><td>A9187</td>薬品</tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>電気</td><td>生理液用薬品</td></tr><tr><td>封入剤&nbsp;</td><td>同上</td><td>50001</td><td>共焦点顕微鏡および免疫蛍光アッセイに使用されるマウンティングソリューション</td></tr><tr><td>マルチクランプパッチクランプアンプ</td><td>モレキュラーデバイス</td><td>700B</td><td>膜電流記録システム</td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>電気生理学的溶液用化学薬品</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td>電気生理学的溶液用化学薬品</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11140035</td><td>非必須アミノ酸。細胞増殖と生存率を高めるために、細胞培養培地のサプリメントとして使用されます。</td></tr><tr><td>ネオン100 &mu;Lキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MPK10096</td><td>細胞エレクトロポレーションキット</td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MPK5000</td><td>セルエレクトロポレーションシステム</td></tr><tr><td>ニューロベースル培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21103049</td><td>アストロサイトフィーダー層を必要とせずに、ニューロン細胞集団の長期維持と成熟のために設計された基礎培地</td></tr><tr><td>NutriStem-XF/FF&nbsp;</td><td>生物産業</td><td>05-100-1A</td><td>ヒトiPS細胞培養培地</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>157-8</td><td>免疫染色アッセイにおける細胞固定に使用</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、カルシウム、マグネシウム</td></tr><tr><td>PBS Ca2+/Mg2+フリー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、カルシウムなし、マグネシウム</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシンなし&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>ペニシリン/ストレプトマイシン溶液は、細菌による細胞培養汚染を防止するために使用されます。</td></tr><tr><td>ポリオルニチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>in vitro 神経細胞の付着と増殖を促進する</td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0443-5MG</td><td>血管内皮増殖因子受容体2の選択的阻害剤 (VEGFR-2)</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニルポリエチレングリコール,&nbsp;t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコール&nbsp;tert-オクチルフェニルエーテル。免疫染色アッセイにおける細胞透過処理に使用</td></tr><tr><td>正立顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51VI</td><td>電気生理学的記録用顕微鏡 CoolSnap Myoカメラ搭載&nbsp;</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;(ROCK阻害剤)</td><td>エンツォライフサイエンス</td><td>ALX-270-333-M005&nbsp;</td><td>Rho関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ(ROCK)の細胞透過性選択的阻害剤。iPS細胞の生存率を伸ばす</td></tr><tr><td>&mu;-スライド8 Well&nbsp;</td><td>同上</td><td>80826</td><td>高&ndashのサポート。固定細胞の顕微鏡分析を終了</td></tr></tbody></table>

piggybac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (ipscs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

ここではヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) から機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンを得る方法について述べる。運動ニューロンへの直接変換は、転写因子、すなわち Ngn2、Isl1 および Lhx3 (NIL) または Ngn2、Isl1 および Phox2a (ニップ) の代替モジュールの異所性発現によって得られる。NIL およびニップは、それぞれ、脊髄および頭蓋運動ニューロン同一性を指定する。私たちのプロトコルは、piggyBac トランスポゾンベクターを介して、NIL またはニップがゲノム内に安定して統合される修飾 iPSC 線の生成から始まる。トランスジーンの発現は、その後、ドキシサイクリンおよびリードによって誘発され、5日で、iPSCs の MN 前駆細胞への転化に移行する。その後の成熟は、7日間、脊椎または頭蓋の MNs の均質な集団をもたらす。私たちの方法は、以前のプロトコルよりもいくつかの利点を保持します: それは非常に迅速かつ単純化されます。これは、ウイルス感染またはさらに MN 分離を必要としません;これは、アクション電位の列車を発射する能力によって示されるように、成熟の顕著な程度で異なる MN 亜集団 (脊髄および頭蓋) を生成することができます。さらに、混合集団から精製することなく多数の運動ニューロンを得ることができる。iPSC 由来の脊髄および頭蓋運動ニューロンは、筋萎縮性側索硬化症および運動ニューロンの他の神経変性疾患のインビトロモデリングに使用することができる。同種運動ニューロン集団は、細胞型特異的薬物スクリーニングのための重要な資源を表すかもしれない。

この分化方法の概略説明を図 1に示す。ヒト iPSCs (WT I ライン3) は、EpB-BSD-TT-NIL または EpB-BSD-TT-ニップを用いてトランスフェクトし、ブラスチシジン選択に際して、安定かつ誘導的な細胞株12を、それぞれ iPSC-NIL および iPSC-ニップと称する。分化細胞は、多能性マーカー OCT4 と汎神経マーカー TUJ1 の発現について特徴付けられた。免疫染色分析は、0日目に全ての細胞における OCT4 の均一な発現を示したが、TUJ1 陽性の非存在下である (図 2A)。3日目に、iPSCs 分化のサブセットにおいて TUJ1 の発現によってミラーリングされた OCT4 陽性細胞数の強い減少を観察した (図 2B)。5日目において、母集団において OCT4 ...

このプロトコルは、誘導性 piggyBac ベクターからの転写因子を異所的に発現することによって、脊髄または頭蓋の同一性を有する運動ニューロンへの誘発多能性幹細胞の迅速かつ効率的な変換を可能にする。

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

運動ニューロンの異なるサブタイプを生成する可能性は、筋萎縮性側索硬化症などの現代の運動ニューロン疾患のモデル化に特に関連しています。この方法により、短時間で精製工程を行わずに、脊髄または頭蓋の同一性を持つ運動ニューロンに対して非常に硬直性の細胞集団を取得することができます。簡便培養条件下で誘導多能性幹細胞またはiPSCからヒト運動ニューロンを生成することは、運動ニューロン疾患の薬物スクリーニングを容易にし得る。プログラミング転写因子の誘導発現は、iPSCリポジトリから神経細胞、骨格筋、グリア細胞などの別の細胞タイプを生成するために使用することができる。NILおよびNIP iPSCライン生成では、ヒトiPSC培養をカルシウムおよびマグネシウムフリーPBSでリンスしてから、細胞解離試薬で細胞を摂氏37度で5~10分間処理します。細胞が培養容器から脱離し始めた場合、P1000ピペットを使用して細胞を3~4回軽く手動で解離します。細胞を15ミリリットルのチューブに移し、カルシウムとマグネシウムを数えずに新鮮なPBSで最終体積を最大10ミリリットルにします。遠心分離によって6番目の細胞に10回回収し、エレクトロポレーションキットから100マイクロリットルのバッファーRでペレットを再懸濁します。トランスポーザブルベクタープラズマDNA4.5マイクログラムと、トランスフェクション用ピギーババトランスポザーゼ血漿DNA 0.5マイクログラムを加えます。示されたパラメータを使用してメーカーの指示に従ってセルエレクトロポレーションシステムでトランスフェクト。次に、6ミリメートルマトリックスコーティング皿に10マイクロモルROCK阻害剤Y-27632を添加したヒトiPSC培地に細胞を播種します。トランスフェクションの2日後、抗生物質中の細胞を少なくとも7〜10日間保持する培養培地に、1ミリリットル当たり5マイクログラムのブラシシジンを加え、トランス遺伝子を統合していない細胞を対抗する。インキュベーションの終了時に、異なる数の遺伝子および異なる統合部位を有する細胞で構成される混合集団として安定したトランスフェクトされた細胞を維持するか、単一クローンを単一のクローンに分離する。先に述べたように、ニューロゲニン-2のトランスジーン特異的プライマーを用いたRT-PCRによって評価されるドキシサイクリン誘導の1ミリリットル当たり1マイクログラムのトランス遺伝子の効果的な発現を可能にするために、追加の皿を準備する。この段階では、新しいNILとNIP iPSCラインの在庫も、ヒトiPSC用の凍結培地で凍結する必要があります。運動ニューロン分化のために、DMEM/F12培地の5つの容積を含む15ミリリットル管に細胞を集めることができるように実証されるように解離試薬と安定的にトランスフェクトされた細胞培養物を解離する。遠心分離後、ヒトiPSC培地中の細胞を、カウント用のマイクロモルROCK阻害剤を補充した。マトリックスコーティングされた皿の上に細胞を6.25倍の10倍の4番目の細胞/センチメートル平方密度で播種します。次の2日間は、上清をドキシサイクリンを補充した新鮮な分化培地に置き換えます。2日目に、ガンマ分泌酵素阻害剤、血管内皮成長因子受容体阻害剤、及びドキシシリンを添加した神経基底B27培地に培地を変更する。5日目に、示されているように細胞を解離し、DMEM/F12培地の4ミリリットルで取り離された細胞をカウントします。ピペッティングは、細胞の完全な解離のために重要です。メーカーの指示に従って細胞凍結培地中の運動ニューロン前駆物質のアリコートを凍結し、遠心分離によって残りの細胞を収集する。10マイクロモルROCK阻害剤を添加した神経培地中のペレットを再懸濁する。ポリオルニチンラミニンコーティングされたマイクロスライドに細胞をシードし、ポリマーカバースリップを10倍から5分の5の細胞/センチメートル平方密度でカバーします。6日目には、細胞を支持表面から切り離すことなく下流分析まで培養のための阻害剤を含まない新鮮な神経培地に慎重に交換する。多能性マーカーオクタマー結合転写因子4またはOTC4の均一な発現は、汎ニューロンマーカーニューロン特異的クラス3βチューブリンTUJ1陽性がない場合にゼロ日目に分化細胞培養で観察することができる。3日目には、OCT4陽性細胞の数が強く減少することが明らかである。これは、区別する iPSC のサブセット内の TUJ1 の表現によってミラーリングされます。5日目には、TUJ1と後天的な神経形態の一貫した発現を示す集団ではOCT4の発現は認められていない。運動ニューロン前駆細胞の再めっき後7日後の免疫染色分析は、TUJ1と成熟した運動ニューロンマーカーコリンアセチルトランスファーーゼの均一な発現を明らかにする。iPSC NIL由来のニューロンは、電圧依存性ナトリウム電流と電圧依存性カリウム電流の表示に成功しました。現在のクランプモダリティでクランプされたiPSC NIL由来の運動ニューロンの80%は、プラス60ピコアンプ以上の電流パルスを注入するとスパイクトレインをトリガーすることができます。記録された細胞の50%以上で繰り返し発火するために必要な最小電流は、約マイナス38ミリボルトのスパイク閾値と約8ヘルツの40ピコアンプでの平均発火頻度を有する40ピコアンプをプラスし、iPSC NIL由来脊髄運動ニューロンが成熟ニューロンの典型的な機能的特性を示すことを示唆している。脊髄および頭蓋運動ニューロンは、病理学的突然変異を運ぶ制御されたiPSCまたはiPSCから導き出され、これらの細胞は、研究モデルまたは薬物スクリーニングのために使用することができる。この方法は、異なる運動ニューロンユニットがALSによって差し合いの影響を受ける理由を理解するのに役立ちます。

conversion-human-induced-pluripotent-stem-cells-ipscs-into-functional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

OCT4、SOX2、KLF4とMYCのレトロウイルス媒介性異所性発現を介してヒトの人工多能性幹細胞（性IPSC）を生成する方法が記載されている。...

GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする

このビデオでは、系統特異的転写因子の異所性発現により、PiggyBacトランスポゾンシステムを用いてヒトiPS細胞をトランスフェクションすることにより、運動ニューロンを生成する手順を実演しています。...

ヒトiPS細胞におけるPiggyBacトランスポゾン媒介遺伝子編集:PiggyBacトランスポゾンシステムを用いたヒトiPS細胞への目的遺伝子統合の手順

このビデオでは、ヒトiPS細胞を運動ニューロンに分化させる過程を紹介しています。その根拠は、特定の転写因子を発現するように遺伝子改変されたiPS細胞を利用することにあります。この抗生物質をドキシサイクリンを含む培地で培養すると、転写因子の発現が引き起こされ、運動ニューロン前駆細胞へのiPS細胞の分化が促進されます。最終的に、前駆細胞をニューロン培地で培養して、成熟した機能的な運動ニューロンを生成します。...

人工ヒト人工多能性幹細胞の機能的運動ニューロンへの分化

人工多能性幹細胞の生成は、自家移植の導出のための魅力的な展望を提供しています。しかし、多能性状態と面倒な再分化の進行はまだ臨床の翻訳を妨げます。ここでは、成人のヒト線維芽細胞の誘導および誘導神経前駆細胞への直接変換と神経系統へその後の分化を説明します。...

成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

この研究では、非ウイルスベースのトランスポゾンシステムを使用して、マウスの羊水細胞から人工多能性幹細胞を生成します。...

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

このプロトコルは、仙台ウイルス感染による神経幹細胞を誘導する末梢血単核細胞のリプログラミング、ドーパミン作動性ニューロンへのiNSCの分化、DA前駆体の一方的な病変への移植を提示するパーキンソン病マウスモデル、およびPD治療のためのiNSC由来DA前駆体の安全性および有効性の評価。...

末梢単核細胞からの誘導神経幹細胞の生成と移植研究におけるドーパミン作動性ニューロン前駆体への分化

シームレスなゲノム編集によるヒト多能性幹細胞への点突然変異の導入

この記事では、ベンチトップ3D懸濁バイオリアクターにおけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンの生成のためのプロトコルについて説明します。...

3次元浮遊バイオリアクターにおけるヒトニューロゲニン2誘導性ニューロンの生産

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

学ぶ PiggyBacベクターを用いたiPSCsから機能的脊髄・頭蓋運動ニューロンへの分化プロトコル。電気生理学的特性評価とALSモデリング・創薬スクリーニングへの応用を含む。

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

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