マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いてインビトロ微小核アッセイを行う自動化方法

画像ストリームベースのミクロ核アッセイは、低スループットやイベントの視覚的確認の欠如など、自動顕微鏡検査や従来のフローサイトメトリーなどの方法のいくつかの制限を克服することができます。この技術の主な利点は、細胞毒性と細胞毒性を決定するために必要なすべての事象を、顕微鏡スライドを作成することなく、自動的に画像化、同定、およびスコア付けできることです。クラストゲンおよび/またはアオイジンへの細胞暴露の場合、T25フラスコ中の適切な細胞培養培地の9ミリリットルの実験細胞の5分の1から5分の1に関心のある化学物質の1ミリメートルを加え、1ミリリットルの水を対照培養物に加える。

フラスコ1個につき15ミリリットルのポリプロピレンチューブに細胞を移す前に、37°Cでフラスコを3時間、二酸化炭素を5%でインキュベートします。遠心分離によって細胞を収集し、新しいT25培養フラスコに播種するためのチューブあたり10ミリリットルの新鮮な培養培地でペレットを再懸濁する。次に、各フラスコにシトカラシンBのストック濃度の150マイクロリットルを加え、1ミリリットル当たり3マイクログラムの最終濃度を達成する。

経済協力開発機構のガイドラインで推奨されているように、フラスコをインキュベーターに戻し、1.5~2倍の時間に相当します。回収期間の終わりに、遠心分離のために個々の15ミリリットルのポリプロピレンチューブに培養を移し、75ミリモル塩化カリウムの5ミリリットルでペレットを再懸濁する。反転によって3回やさしく混ぜ、7分間摂氏4度でサンプルをインキュベートします。

インキュベーションの終わりに、各サンプルに4%ホルマリンの2ミリリットルを加え、3つの反転と穏やかに混ぜます。遠心分離によって細胞を収集する前に、10分間摂氏4度にサンプルを返します。ペレットを新鮮な4%ホルマリンの100マイクロリットルで20分間再懸濁します。

インキュベーションの終了時に、固定細胞をチューブ当たり5ミリリットルの洗浄バッファーで遠心分離して洗浄バッファーを1管あたり100マイクロリットルで再懸濁します。次に、ヘモサイトメーターでカウントするための個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにサンプルを移す。1ミリリットル当たり1.0 x 10当たり100マイクログラムあたり100マイクログラムの5マイクロリットルを1ミリリットル当たり6個の細胞に加え、10マイクロリットル当たり100マイクログラムのRNaseを1管当たり100マイクロリットル当たり100マイクログラム加えます。

摂氏37度で30分、二酸化炭素を5%でインキュベーションした後、サンプルをマイクロ遠心分離機で遠心分離し、各チューブから30マイクロリットルの上清を除くすべての上澄み物を取り除きます。次に、慎重に再懸濁し、気泡形成を誘発しないように注意してください。再懸濁時に泡が現れた場合は、チューブを軽くフリックして取り除きます。

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーでサンプルを実行するには、まず405ナノメートルレーザーをオンにして、レーザーパワーを10ミリワットに設定します。側面散乱レーザーを含む他のすべてのレーザーを無効にし、明視野をチャンネル1と9に設定します。拡大スライダが 60 倍に設定され、高感度モードが選択され、チャンネル 1、7、および 9 だけがイメージ ギャラリーに表示されていることを確認します。

散布図をクリックし、X 軸上のすべての母集団と面積 M01 を選択します。Y 軸の縦横比 M01 を選択し、正方形の領域をクリックして、単一セルの周囲に領域を描画します。この領域にセルを 1 つ指定し、プロットを右クリックして領域を選択します。

単一セル領域をハイライト表示し、X 座標を 100 と 900 に、Y 座標を 0.75 と 1 に変更します。取得パラメータを設定し、ファイル名と保存先フォルダを指定します。次に、イベント数を 20,000 に変更し、DNA 陽性母集団を選択して、最初のサンプルを実行します。

IDEAS でデータ ファイルを開くには、[分析の開始] をクリックしてファイルを開くウィザードを起動し、目的の生のイメージ ファイルを参照して選択します。次に、[次へ] をクリックし、イメージ ギャラリーで 2nucleated セルを参照します。マスクを作成するには、目的の画像をクリックして選択し、解析タブを開きます。

[マスク]、[新規作成]、[関数] をクリックして、[レベルセット] を選択します。マスクで、M07 と中間レベルのマスクを選択し、輪郭の詳細のスケールを 3 に設定します。次に、[OK] を 2 回クリックします。

二核セルフィーチャをスポットカウントするには、[解析]タブを開き、[フィーチャ]および[新規]を選択します。[フィーチャ タイプ] で、[スポット数] を選択します。[マスク]で、最終的な二核マスクを選択し、結合性を 4 に設定し、名前をスポットカウント BNC に変更し、[OK] をクリックしてフィーチャ値を計算します。

スポットカウントの二核細胞ヒストグラムの場合は、ヒストグラムをクリックし、親集団として非アポプトピックを選択します。X 軸フィーチャーの場合は、「スポットカウント BNC」を選択し、「OK と直線領域」をクリックしてから、Bim Two にリージョンを描画し、このリージョンに 2N と名前を付けます。ミクロ核マスクを作成するには、イメージ ギャラリーからミクロ核を含む二核細胞を選択し、[解析] タブでマスクを開きます。

スポット識別マスク 1 を作成するには、[新規および機能]をクリックし、[スポット]を選択します。[明るい]ラジオボタンが選択されていることを確認し、[マスクの下でM07]を選択します。スポットをセルの背景比率に設定し、最小半径を 2 に設定し、[最大半径]を 6 に設定します。

[OK] をクリックして左側のリストにマスクを追加し、[新規作成] をクリックして別のマスクを作成します。スポット M07 チャンネル 7 ブライト 2 つの 6 つの 2 つのマスクをクリックし、下向き矢印をクリックしてマスク定義に追加し、And および Not 演算子をクリックします。下向き矢印をクリックして、拡張された範囲マスクをマスク定義に追加します。

多核化された母集団マスクを作成するには、解析、マスク、新規、および関数をクリックします。[機能] で 、[範囲] を選択します。[マスク]で、[流域ディレートセットM07 Channel07]、[ミドル、3、2]を選択し、表示する画像をチャンネル07に設定します。

面積の最小値と最大値をそれぞれ 135 と 5000 に設定し、それぞれ最小および最大アスペクト比の値を 0.4 と 1 に設定します。[OK] をクリックし、[名前] フィールドで POLY マスクを読み取るようにテキストを変更し、[OK] をクリックして [閉じる] をクリックします。カスタム ビューを作成するには、[イメージ ギャラリー プロパティ] ボタンをクリックし、[合成] タブを開いて、[新規作成] をクリックします。

[名前] に、チャンネル 01 からチャンネル 07 を入力します。[イメージの追加] をクリックし、[イメージ] で [チャンネル 01] を選択し、パーセントを 100 に設定します。[イメージの追加] をもう一度クリックし、[イメージ] の下の [チャンネル 07] を選択し、パーセントを 100 に設定します。

[表示] タブをクリックして [新規] をクリックし、[名前] で「BNC」および「MN」マスクを入力します。次に、[列の追加] をクリックし、[イメージの種類] で [チャンネル 01] を選択し、[マスク] の [なし] を選択します。[列を追加] をクリックし、[イメージタイプ] で [チャンネル 07] を選択し、[マスク] で [なし] を選択します。

[列を追加]をクリックし、[合成]ラジオ ボタンをクリックしてから、[問題]をクリックしてカスタムビューを完成させます。[表示]プルダウン メニューをクリックし、[BNC および MN マスク]ビューをクリックします。[マスクの非表示を表示]ボタンをクリックします。

主要なイベントを列挙するには、[レポート] タブを開き、[統計レポートの定義] をクリックし、新しいウィンドウで [列の追加] をクリックします。二核セル数の統計量を追加するには、[統計] で [カウント] を選択し、[選択した母集団] で [BNC の母集団] を選択し、[統計の追加] をクリックして統計をリストに追加し、テンプレートを保存します。すべての統計がリストに追加されたら、[閉じる] をクリックし、[OK] をクリックして、データ分析テンプレートを保存します。

実験ファイルをバッチ処理するには、[ツール] メニューの [バッチ データ ファイル] をクリックし、新しいウィンドウで [バッチの追加] をクリックします。[ファイルの追加] をクリックして、バッチに追加する実験ファイルを選択し、[テンプレートまたはデータ分析ファイルを選択] オプションの下にある [フォルダを開く] ボタンをクリックします。保存されたばかりのテンプレートを参照して開きます。

[OK] をクリックして現在のウィンドウを閉じます。次に、[バッチの送信] をクリックして、すべてのファイルのバッチ処理を開始します。ここでは、二核細胞を同定するための4つの選択されたパネルが示されている。

これらの二変量プロットとヒストグラムは、二核細胞の選択と、同様の円形、領域、強度を持つ2つの核を有し、互いから十分に分離された細胞の同定を可能にする。これらのブライトフィールドおよびHoechst画像は、二核細胞およびミクロ核マスクと同様に、二核細胞およびミクロ核の同定および列挙を促進する。スポットカウント機能の適用は、多核化マスクを使用して、単核、三核、四重核細胞を同定する。

その後、三核細胞と四頭核細胞の数を合計して、細胞毒性の計算に必要な多核細胞の最終的な数を得ることができます。ここで、代表的な遺伝毒性および細胞毒性値は、内因性コルヒチン、鎖体ミトマイシンC、および陰性対照、マンニトール、プロトコルの有効性を実証するために示されている。DNA染色の適切な濃度で細胞を標識することは、高品質の画像キャプチャを確実にするために重要であり、すべての重要なイベントを容易に特定してスコア付けすることができます。

これらの技術は、放射線バイオドシメトリーのミクロ核アッセイにも適用可能であり、放射線にさらされた可能性のある個人の線量推定を可能にする。