Name: 生体共焦点顕微鏡を用いてリンパ節構造と細胞局在化を可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶ 生体共焦点顕微鏡を用いたリンパ節のエクスビボイメージング法。マウスモデルで蛍光標識抗体を用いてT細胞とB細胞の空間的分布を可視化し、免疫応答の研究に有用な手法です。

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この作品はNIH(R01 AI43458~H.L.W.)によってサポートされました。

このプロトコルは、ハーバード大学医学部とブリガム・アンド・ウィメンズ病院の動物常任委員会(プロトコル2016N000230)によって承認されました。
1. 実験に使用したマウス
<ol><li>抗体ミックスを投与するためにB6の背景に8週齢の雄および雌マウスを使用する。</li>
	<li>CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WTマウスを使用して、抗体ミックスを投与せずにレポーターマウスにもex vivo全体LNイメージングを適用できるかどうかを判断し、抗原提示を含む単核細胞の存在を調べることができます。細胞および咽頭細胞、およびLNにおけるその分布。 注:CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WTレポーターマウスは、それぞれCX3CR1およびCCR2プロモーターの制御下に挿入された緑色蛍光タンパク質(GFP)および赤色蛍光タンパク質(RFP)を有する。レポーターマウスは、抗体ミックスの注射の有無にかかわらず使用することができる。レポーターマウスにおける抗体ミックス注射については、リファレンス4を参照してください。抗体が注入されない場合は、手術に進みます。</li>
</ol>2. 抗体ミックス製剤および注射
注: 手順 1.1 で説明するマウスに対して、次の手順を実行します。
<ol><li>ブリリアントバイオレット(BV)421アンチCD4(GK1.5; 0.2 mg/mL、ブリリアントブルー(BB)515アンチCD19(1D3;0.2mg/mL)の1:10、フィコエリスリン(PE)抗F4/80(T45-2342;0.2mg/mL)の1:10をPBSに注入する適切な最終容積(内側に注入する)イメージ鼠径部)または足パッド(画像ポピュライト)リンパに。 注:アイソタイプとして使用: BV421マウスIgG2b, kアイソタイプコントロール (R35-38; 0.2 mg/mL);PE ラット IgG2a, κ アイソタイプコントロール (R35-95; 0.2 mg/mL);BB515ラットIgG2a、κ等型制御(R35-95;0.2 mg/mL)。染色抗体を変更する場合は、正しいアイソタイプを使用してください。</li>
	<li>鼠径部LNを画像化するには、抗体ミックスの100μLを皮下に内腿に注入する(図1A)。あるいは、50μLの抗体ミックスを足パッドに注入し、画像ポプライトLN(図2A)を画像化する。繊細な1 mLインスリン注射器(インスリンU-100)を0.30mm×13mm(30ゲージ×1/2インチ)の針で使用してください。 注:鼠径LN染色の注射は皮下であり、筋肉内(i.m.)ではないことを確認してください。</li>
	<li>抗体ミックス注射の前に動物を麻酔しないでください。</li>
	<li>臓器を取り除くために、最低3時間(鼠径dLN)と12h(ポピュライトdLN)ポスト注射を待ちます。</li>
	<li>LN細胞標識が鮮やかな紫色や鮮やかな青色などの大型ポリマー蛍光色素を用いて完全に観察されない場合は、フッ素イソチオシアネート(FITC)、PEおよびアロフィコシアニン(APC)を含む小さな蛍光色素を代替として使用する。</li>
</ol>3. 鼠径排水リンパ節を除去する手術手順
<ol><li>CO2窒息を用いてマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。</li>
	<li>粘着テープでアクリル期にマウスを固定し、切開後の毛皮の沈着を防ぐために綿棒でミネラルオイルを腹部の皮膚に塗布する(図1B)。毛皮の除去は必要ありません。</li>
	<li>陰部手術曲げられたはさみ(11.5cm)と、陰部から腹部の微小外科曲げられた鉗子(12.5 cm)を用いて中線切開を行う(図1C)。</li>
	<li>皮膚から腹部の筋肉を解離する(図1D)。</li>
	<li>垂直切開線の上部と下部に水平皮膚切開を行い、目的の側面に皮膚フラップを作成し(抗体ミックス注射の側面に従って)、皮膚をフラップしてリンパ節を可視化する(図1E)。</li>
	<li>アクリルプレートにスキンフラップをテープで留めます(図1F)。</li>
	<li>マイクロ手術曲げられた鉗子を使用して鼠径排水リンパ節を取り除く(図1F)。リンパ節は、皮膚の下の球体、通常は球状の半透明として現れる。</li>
</ol>4. 吸引性排水リンパ節を除去する手術手順
<ol><li>CO2窒息を用いてマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行う。</li>
	<li>粘着テープでアクリルステージ上の傾向のある位置でマウスを固定し、ふくらはぎと膝に綿棒でミネラルオイルを塗布する(図2A-D)。</li>
	<li>かかとから膝までのふくらはぎに中線切開を行う(図2E,F)。</li>
	<li>皮膚からふくらはぎの筋肉を解離する(図2F,G)。</li>
	<li>ポプライトフォッサ(図2G)を露出します。ポプライトリンパ節は、ポプライトフォッサに半透明球として現れる。</li>
	<li>マイクロサージャリー湾曲鉗子(図2G)を使用して、ポピュライトリンパ節を取り外します。</li>
	<li>または、上の位置にマウスをひっくり返し、かかとから膝へのふくらはぎの中線切開を行い、その後ふくらはぎの解離を行うことにより、二頭筋大腿骨と半腱の間のポプライトフォッサに近づきます。皮膚からの筋肉。 注:ポプライトフォッサは、膝関節の後ろに位置する浅いうつ病です。注意深く開いて、ポピュライトリンパ節を見てください。</li>
</ol>5. リンパ節の準備
<ol><li>ガラス底(35mm x 10mm)で器官全体を培養皿に入れ、マイクロサージャリー曲げられた鉗子を使用して器官を取り囲む脂肪を取り除きます(図1G-Iおよび図2H)。</li>
	<li>皿の真ん中に器官を一元化する(図1Jおよび図2H)。</li>
	<li>繊細なタスクワイパーの断片で器官を覆い、室温生理食生食液0.9%またはリン酸バッファー溶液(図1K-Mおよび図2H)で浸しておきます。 注:除去後にリンパ節を洗浄したり、フード内のリンパ節抽出を実行する必要はありません。</li>
</ol>6. 元生体共焦点顕微鏡(イメージング)
<ol><li>ペトリ皿を反転共焦点顕微鏡スロット(図1Nおよび図2H)に配置します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡下の画像LAN(図1Oおよび図2H)。</li>
	<li>まず、目的を4倍または10倍の目的で共焦点顕微鏡の従来の光を用いて正しい焦点を得る。その後、光機能からレーザーモードに変更します。 注:共焦点顕微鏡に4倍の目的が含まれていない場合、焦点は10倍の目的を使用して完全に得ることができる。</li>
	<li>アイソタイプ染色、非染色または非蛍光サンプル(表1)を使用してレーザーパワー、オフセット、ゲインを調整し、画像に示すような蛍光標識抗体からの自己蛍光および非特異的染色を除去します。原稿(BV-421アンチCD4、BB515アンチCD19およびPEアンチF4/80)。</li>
	<li>それぞれ、リンパ節の対象領域にマイクロメトリックとチャリオットを使用して、Z とXYの位置を調整します。 </li>
	<li>LN構造と細胞分布に焦点を当てた4倍、10倍、20倍の目標の下で画像を取得します。1024 x 1024 ピクセルの定義を使用します。 注:動物ごとに目的ごとに異なるフィールドで最低5枚の画像を取得します。</li>
	<li>画像ソフトウェアを使用して画像を分析し、チャンネルを分離し、対象のスケールと色を追加し、3D ビューを再構築します。</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
<li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li>
<li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin%2C+Location%2C+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li>
<li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151(2018).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ciencias%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).</li>
<li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li>
<li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li>
<li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li>
<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

イメージングと分子生物学や高次元免疫表現型を含む他の技術との組み合わせは、免疫細胞をネイティブの文脈で調べる能力を高めています。実際、他のアプローチでは組織の消化と細胞の単離が必要になる場合がありますが、組織の完全性を失う可能性がありますが、生体内またはex vivoイメージングを使用すると、地理的な方法で異なる細胞サブタイプを調査する上で大きな利点が得られます3,16.細胞が異なる蛍煙を発現するために特異的に標的とされる遺伝子組み換えマウス株の利用可能性が急速に増加しているのは驚くべきことではない。重要なことに、レポーターマウスと抗体ミックスの注射の組み合わせは、同じ器官4内の異なる細胞集団を染色する強力なツールである。さらに、CRISPR/Cas9のような遺伝子編集ツールの普及により、異なるグループがマウス株をカスタマイズすることができ、事実上あらゆる細胞型が彼らの正真正の位置17で画像化できるようになりました。このアプロ...

リンパ節(LN)は、自然免疫応答と適応免疫応答を橋渡しする重要な機能を持つ全身に広く存在する卵形の器官である。LNは、それらに対する免疫応答をマウントするために異物粒子および癌細胞を同定するためにリンパを濾過する1.抗原提示細胞(APC)、T細胞およびB細胞は、抗原特異的抗体(体液性免疫)および細胞傷害性リンパ球(細胞性免疫)を生成するために一緒に働き、外来粒子および癌細胞2を排除する。したがって、リンパ系に存在する免疫細胞のダイナミクスを理解することは、ワクチン開発とがん免疫療法に重要な意味を持つであろう。
新しい共焦点顕微鏡と超解像顕微鏡を含む強力な顕微鏡の出現は、異なる免疫細胞集団が彼らのネイティブ環境でどのように振る舞うかを理解する上で並外れた進歩を可能にしました3。特定の標的4、5の制御下で蛍光タンパク質を発現する遺伝子組み換えマウスとのプローブの組み合わせを用いて、複数の同時細胞サブタイプを画像化することが可能となった。実際、質量サイトメトリーやマルチパラメトリックフロー解析などの高次元技術は、健康と疾患における異なる免疫細胞の区画化と機能性に関する知識を拡大するために重要であり、7.しかし、これらの技術のためのサンプルを調用するために、組織は消化を必要とし、細胞は細胞懸濁液で分析される自然なmilieuから分離される。これらの制限を超え、生物学のより良い翻訳を可能にするために、ここで提案されるプロトコルの目標は、改善された速度、組織の利点を持つストック共焦点顕微鏡を使用して、画像ex vivo全リンパ節に簡単な方法論を適用することです。構造保存、および従来の免疫蛍光染色と比較した細胞生存率。このアプローチを用いて、病原体4に対する宿主早期防御に関与するTリンパ球のサブタイプであるγδ T細胞に対するマウス欠損が、野生型マウスと比較して卵胞およびT細胞ゾーンを損なっていることを示すことができた。これらの知見により、βT細胞がリンパ球器官の恒常性と体液性免疫応答4の恒常性において重要な役割を果たすことを実証した研究を行うことが可能となった。さらに、このプロトコルは、プローブと抗体がリンパ節に到達するための生理学的経路を提供し、皮下に投与され、組織リンパ循環を通じて消散するので、その場標識で使用された以前の報告に基づいて構築するリンパ系関連構造8、9、胚中心ダイナミクス10、11、12、および血流に容易にアクセス可能な標的を可視化する抗体を用いて13 、14、15.

<table><tbody><tr><td>BV421 抗CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1.5; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 抗CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BB515 ラット IgG2a, &kappa;アイソタイプコントロール</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BV421 マウス IgG2b, K アイソタイプコントロール</td><td>BD Horizon</td><td>562603</td><td>R35-38 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Cellview 培養ディッシュ</td><td>Greiner-Bio</td><td>627861</td><td>35x10 mm ガラス底イン</td></tr><tr><td>スリンシリンジ</td><td>BD Plastipak-Insulin</td><td></td> <td>U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtechサイエンスブランド</td><td>7557</td><td>サイズ 21 x 20 cm / 100枚/箱</td></tr><tr><td>マイクロサージェリー湾曲鉗子</td><td>WEP手術器具</td><td>カスタムメイド</td><td>12.5cm</td></tr><tr><td>マイクロサージェリー湾曲ハサミ</td><td>WEP手術器具</td><td>カスタムメイド</td><td>11.5cm</td></tr><tr><td>針</td><td>BD PrecisionGlide-30</td><td></td><td>ゲージ &times; &frac12; インチ</td></tr><tr><td>ニコン エクリプス Te + A1R 共焦点ヘッド</td><td>ニコン</td><td>-</td><td>メインの4つのレーザーライン(405、488、543、647nm)PE</td></tr><tr><td>抗F4/80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342を搭載、0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>PEラットIgG2a、およびカッパ;アイソタイプコントロール</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95; 0.2 mg mL-1</sup</td></tr><tr><td>>Zeiss LSM 710 共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>メイン 4 レーザーライン (405、488、543、647 nm)</td></tr></tbody></table>

生体共焦点顕微鏡を用いてリンパ節構造と細胞局在化を可視化

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

リンパ節(LN)は体内に広がる器官であり、自然免疫応答が適応免疫とつながる。実際、LNはリンパ管の経路に戦略的に介入され、LN内のすべての常駐免疫細胞と組織抗原との親密な接触を可能にする。したがって、ex vivo全体LNイメージングを用いて細胞組成、分布、位置および相互作用を理解することは、身体が局所的および全身性免疫応答をどのように調整するかに関する知識を追加する。このプロトコルは、従来の共焦点顕微鏡およびストック試薬を用いて非常に再現性が高く、実行しやすい方法論を可能にする蛍光標識抗体の生体内投与に続くex vivoイメージング戦略を示す。抗体の皮下注射を通じて、従来の免疫蛍光顕微鏡技術によって損傷を受ける可能性のある組織構造に影響を与えることなく、RNを排出する異なる細胞集団に標識することができる。

この原稿は、これらの器官の特定の細胞集団を染色するために蛍光標識抗体を注入した後、その構造を損傷することなく鼠径およびポピライトリンパ節を除去する技術を示しています(図1および図2)).
BV421抗CD4およびBB515抗CD19および共焦点イメージング解析を用いたLN細胞の免疫標識の強力な組み合わせは、鼠径およびポピュライトLNにおけるT細胞(CD4+)およびB細胞(CD19+)の局在を定義した。両器官において、B細胞卵胞はT細胞集団(図3、図4およびビデオ1)に囲まれ、LN構造1の特徴である。リンパ洞を覆う食細胞が注入された蛍光抗体を捕捉し、細胞マーカーの非特異的標識をもたらす可能性を排除するために、PE抗F4/80は抗体ミックスに含まれていた。<strong...

このプロトコルは、臓器構造に変化を起さずにリンパ節を排出する異なる細胞集団を画像化する技術を説明する。

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

この再現性と容易なプロトコルを実行するには、元生体リンパ節イメージング戦略を使用して、生体内投与された蛍光標識抗体の局所的な二次リンパ器官への排出を追跡します。この手法をデモンストレーションすることで、プロトコルの実行を成功に導く手順を特定の視覚化できます。これは、誰でも実行できる非常にシンプルで簡単なテクニックです。唯一の難しい側面は、いくつかのトレーニングを必要とするマウスの処理です。この技術は、従来の蛍光染色法に比べて組織の運動の維持および細胞生存率の向上という利点を有する。この手順の訓練は、研究室の技術者である立松ブレナです。目的の抗体を希釈し、適切なフルオロフォアにコンジュゲートし、リンパ節イメージング用のPBSの100マイクロリットル、または、ポピタルリンパ節イメージング用のPBSの50マイクロリットルを用いた。リンパ節イメージングの場合、抗体カクテル100マイクロリットルを1ミリリットルのインスリン注射器にロードし、30ゲージを半インチ針で装備し、皮下に実験マウスの内側の大腿部に抗体を注入する。ポプライトリンパ節イメージングの場合、実験動物の1つの足パッドに皮下50マイクロリットルの抗体カクテルを注入する。その後、その家箱に動物を返します。リンパ節の収穫を排出するイングイナルの場合は、注射から少なくとも3時間待った後、粘着テープでアクリルステージ上のマウスを固定化し、腹部の皮膚にミネラルオイルを塗布する。標準的なマイクロサージャリーハサミとマイクロサージャリー湾曲筋を使用して、陰部からキシフォイドプロセスまでの腹部の中耳切開を行い、腹部の筋肉を皮膚から解離する。垂直切開線の上下に水平皮膚切開を行い、注射の側面に皮膚フラップを作成し、皮膚を引き込んでリンパ節を可視化する。皮膚フラップをアクリル板に固定し、鉗子を使用して半透明の、通常は眼球状の球状の水切りリンパ節を取り除きます。ポプリタルドレインリンパ節収穫については、注射後少なくとも12時間後に、マウスをアクリルステージ上の起こりやすい位置に固定化する。動物の注入側の子牛と膝にミネラルオイルを塗ります。次に、かかとから膝までふくらはぎに中線切開を行い、皮膚からふくらはぎの筋肉を解離します。ポッテライトフォッサを公開します。このポプライトリンパ節は、フォッサ内の半透明の球体として現れる。次に、マイクロサージャリー湾曲した鉗子でリンパ節を取り外す。イメージング用のリンパ節を準備するには、臓器全体をガラス底の35 x 10ミリメートルの培養皿に入れ、鉗子を使用して組織を取り巻く脂肪を取り除きます。皿の真ん中に臓器を中央に置き、生理食い物に浸した繊細なタスクワイパーで組織を覆います。ex vivoイメージングの場合、皿を反転型共焦点顕微鏡スロットに配置し、共焦点顕微鏡の従来の光と4-10X目的を使用して正しい焦点を得る。光機能からレーザーモードに変更し、同位体染色、非染色、または非蛍光サンプルを使用して、レーザーパワー、オフセット、ゲインを調整して、蛍光と不特定の染色を除去します。リンパ節構造と細胞分布に焦点を当てた4、10および20X目標の下で画像を取得し、1024 x 1024ピクセル定義を使用する。次に、適切なイメージング解析ソフトウェアプログラムを使用してチャネルを分離し、目的のスケールと色を追加し、3D ビューを再構築します。抗CD4および抗CD19抗体と共焦点イメージング分析とリンパ節細胞の免疫標識の強力な組み合わせにより、リンパ節内のT細胞およびB細胞の局在化が可能になる。この亜大リンパ節では、イングイナル組織のように、B細胞卵胞は、T細胞集団に囲まれ、リンパ節構造の特徴である。これらの画像で観察されるように、食細胞は、注入された抗体を内在化せず、BおよびT細胞染色が特異的であることを示す。また、標識の再構成はT細胞染色とB細胞染色が重複しないことを示し、染色の特異性をさらに確認する。単細胞細胞は、皮下の副頸部を含む、リンパ節全体で観察される。CX3XR1を発現する単核細胞の大部分では、CCR2およびCXCR31CCR2二重陽性細胞が続いた。同じ細胞分布と細胞の型のパターンが、その大極リンパ節で観察される。両方のリンパ節はまた、リンパ球によって占有されている単核細胞受容体発現のない暗い領域を示す。さらに、単核球はリンパ節の内側領域内に乏しく、組織の外側領域に濃縮したままであり、これらの細胞が主にリンパ節下皮症を占めていることを示している。抗体混合物は、リンパ系の皮下組織に正確に注入して、抗体をリンパ節に適切に排出する必要があります。この方法は、蛍光標識薬の生体分布、および蛍光標識ナノ粒子の細胞標的化研究に適用することができる。

visualizing-lymph-node-structure-cellular-localization-using-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

二光子イメージングには、基礎条件の下でリンパ節内および免疫応答1の間にリンパ球運動と細胞間相互作用を明らかにした。ここで、我々はT細胞、リンパ節の分離、およびCD4 +植リンパ節におけるT細胞のイメージング運動の養子移入を示しています。...

解剖とマウスの末梢リンパ節の2 - フォトンイメージング

このプロトコルは、リンパ節のスライスに導入された画像蛍光T細胞への方法を説明します。技術は、従来の広視野蛍光または共焦点顕微鏡でのT細胞遊走のリアルタイム分析を可能にします。...

広視野と共焦点顕微鏡によるマウスリンパ節スライスにおけるT細胞のex vivoでのイメージング

2光子顕微鏡の最近の進歩により、リアルタイムを有効にしている...

マウス膝窩リンパ節の生体内イメージング

近赤外蛍光（NIRF）を使用して、最近開発されたイメージング技術は、リンパ系の癌転移、免疫応答、創傷修復、および他のリンパ関連疾患に果たす役割の解明に役立つことがあります。...

マウスのリンパ脈管構造の非侵襲的光イメージング

このビデオは、マウスの後肢から膝窩ドレナージリンパ節を採取する解剖技術を示しています。リンパ節は、自然免疫と適応免疫の橋渡しに重要な役割を果たしており、組織構造と細胞生存率が維持された無傷のリンパ節を採取することで、局所免疫応答と全身免疫応答の研究に役立ちます。...

ex vivoイメージングのためのマウス膝窩ドレナージリンパ節を採取するための解剖法

成体マウスのリンパ節における120μmの深さまでの造影による高解像度の生体内イメージングは​​、空間的に多重焦点二光子顕微鏡の励磁パターンを調節することによって達成される。 100μmの深さでは、このように散乱や回折限界を回避し、（横）487 nmおよび551 nmの（軸方向）の解像度を測定した。...

胚中心の高解像度生体内ストライプ照明顕微鏡

細胞外マトリックスは、創傷治癒、炎症や腫瘍形成の間に、実質的なリモデリングを受ける。我々は、線維性のダイナミクスならびにエピ蛍光または二光子顕微鏡を用いて、高い空間分解能と時間分解能を有する網目状のマトリックス成分を可視化する新規な生体免疫蛍光顕微鏡法を提示する。...

落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

このプロトコルでは、イメージの居住者腫瘍浸潤 CD8 T 細胞ひと肺腫瘍スライス内結合蛍光抗体で標識する方法について説明します。この手法は、共焦点顕微鏡を用いた CD8 T...

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

組織クリアリングと光シート蛍光顕微鏡(LSFM)を組み合わせて、脳脊髄液(CSF)および脊髄硬膜外液を収集するリンパ管およびリンパ節(LN)の3次元および細胞分解能画像を得るプロトコルが提示される。...

iDISCO+およびライトシート蛍光顕微鏡による椎体リンパ管系および排水の3次元画像化

ここでは、複数の神経疾患に重要な役割を果たすマウス髄膜リンパ管(MLV)を評価するプロトコルを提示します。このプロトコルの目的は、トレーサー排出の機能的評価と背面MLVネットワークの詳細な形態的特徴付けの両方を可能にする統合的手法を提供することです。...

髄膜リンパ質評価のための統合プロトコル:大胸椎注射、リンパ節画像診断、髄膜郭清、全マウント染色

学ぶ 生体共焦点顕微鏡を用いたリンパ節のエクスビボイメージング法。マウスモデルで蛍光標識抗体を用いてT細胞とB細胞の空間的分布を可視化し、免疫応答の研究に有用な手法です。

生体共焦点顕微鏡を用いてリンパ節構造と細胞局在化を可視化

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