Name: CRISPR/Cas12a サッカロマイセスセレビシエの多重ゲノム編集と酵母ピクセルアートの創造 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぼう、Saccharomyces cerevisiaeの多重ゲノム編集法。単一crRNAアレイを用いたクローニングフリー手法で、カロテノイド産生酵母株を効率的に作製し、合成生物学への応用可能性を示します。

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このプロジェクトは、補助金契約第686070号(DD-DeCaf)および764591(SynCrop)に基づき、欧州連合のHorizon 2020研究革新プログラムから資金を受け取り、プロジェクト番号737.016.005の研究プログラムから生命の構成要素を構築しました。オランダ科学研究機構(NWO)。T.E.G.は、王立協会(UF160357助成金)とBBSRC/EPSRC合成生物学研究センター(助成BB/L01386X/1)の支援を受けました。私たちは、酵母ピクセルアートを作成するための酵母スポッティング実験への貢献にZi Diとジェフリー・ファン・ワイクに感謝します。

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<li>Lian, J., HamediRad, M., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+metabolic+engineering+of+Saccharomyces+cerevisiae.+using+the+CRISPR%2FCas+System%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. using the CRISPR/Cas System.</a> Biotechnology Journal. 13 (9), 1700601(2018).</li>
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<li>Swarts, D. C., Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9+versus+Cas12a%2FCpf1%3A+Structure%E2%80%93function+comparisons+and+implications+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure–function comparisons and implications for genome editing.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 9 (5), 1481(2018).</li>
<li>Strohkendl, I., Saifuddin, F. A., Rybarski, J. R., Finkelstein, I. J., Russell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Basis+for+DNA+Target+Specificity+of+CRISPR-Cas12a%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.</a> Molecular Cell. 71 (5), 816-824 (2018).</li>
<li>Verwaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+production+of+beta-carotene+in+Saccharomyces+cerevisiae.+by+successive+transformation+with+carotenogenic+genes+from+Xanthophyllomyces+dendrorhous%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">High-level production of beta-carotene in Saccharomyces cerevisiae. by successive transformation with carotenogenic genes from Xanthophyllomyces dendrorhous.</a> Applied and Environmental Microbiology. 73 (13), 4342-4350 (2007).</li>
<li>Verwaal, R., Buiting-Wiessenhaan, N., Dalhuijsen, S., Roubos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCpf1+enables+fast+and+simple+genome+editing+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cpf1 enables fast and simple genome editing of Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 35 (2), 201-211 (2018).</li>
<li>Jakociunas, T., Jensen, M. K., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+advances+engineering+of+microbial+cell+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 advances engineering of microbial cell factories.</a> Metabolic Engineering. 34, 44-59 (2016).</li>
<li>Engler, C., Romy, K., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PloS One. 3 (11), 3647(2008).</li>
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<li>Tak, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+multiplex+gene+regulation+using+CRISPR-Cpf1-based+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors.</a> Nature Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+editing+by+CRISPR-Cpf1+using+a+single+crRNA+array%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array.</a> Nature biotechnology. 35 (1), 31-34 (2017).</li>
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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+gene+regulation+by+CRISPR-ddCpf1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1.</a> Cell Discovery. 3, 17018(2017).</li>
<li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc%2FSS+carrier+DNA%2FPEG+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2 (1), 1-4 (2007).</li>
<li>Perez, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GuideScan+software+for+improved+single+and+paired+CRISPR+guide+RNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">GuideScan software for improved single and paired CRISPR guide RNA design.</a> Nature Biotechnology. 35 (4), 347-349 (2017).</li>
<li>Cox, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Biology+Open+Language+Visual+%28SBOL+Visual%29+Version+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Synthetic Biology Open Language Visual (SBOL Visual) Version 2.0.</a> Journal of Integrative Bioinformatics. 15 (1), 1613-4516 (2018).</li>
</ol>

著者らは、利益相反があると宣言する。著者は、提示された方法に関連するIPを提出しました。

提供されたプロトコルは、単一のcrRNAアレイおよびドナーDNAと組み合わせてラクノスピラセア属細菌ND2006からCas12aを用いたS.セレビシエの多重ゲノム編集について説明する。単一crRNAアレイおよびドナーDNAの設計について詳細に説明する。確立されたCRISPR/Cas9システムとは対照的に、CRISPR/Cas12aは単一のcrRNAアレイ13、33から発現される複数のcrRNAを処理する独特な付加的な機能を備えている。この機能により、複数のターゲットの同時編集が簡単に設定でき、1 回の変換で実現できます。この単一のcrRNAアレイアプローチは、Zetscheらによって以前に実証されました。AsCas12aを使用して哺乳動物細胞内で最大4つの遺伝子を同時に編集した34人、およびSwiatらによって.FnCas12aを用いて酵母ゲノムに4つのDNA断片を導入した35人。我々の知る限りでは、Cas12aシステムを用いた同時ゲノム修飾の数は報告されておらず、Cas12aの単一アレイあたりのターゲットの最大限界はまだ決定されていない。Cas12aと組み合わせて単一crRNAアレイを利用するさらなる研究は、生物33、36、37の広い範囲における多重転写調節を含む。
提示されたプロトコルにはいくつかの重要な手順があります。Cas12aゲノム編集実験に関与するすべてのDNA配列を慎重に設計します。CrRNAの新しいスペーサー配列の一部の機能を決定し、例えばVerwaalらによって説明されるシングルプレックスゲノム編集実験によって。単一のcrRNAアレイに組み合わせる前に19。酵母の良好な変換効率を達成するためにCas12a編集実験で使用される変換バッファソリューションの準備のための推奨事項に従ってください。
この手法には、いくつかのオプションの変更があります。各ドナーDNAの1μgを使用することが推奨され、形質転換における線形化pRN1120または単一crRNAアレイ発現カセットは、より低いDNA量の使用が満足のいく形質転換効率をもたらすことも期待される。テスト変換を実行して、より低い DNA 量を使用できるかどうかを判断します。S.cerevisiaeの変換は、このプロトコルで説明されているものとは異なる方法を使用して行われ、例えばGietzらによって記述されたプロトコルである。(2007年)38.ガイドRNAレシピエントプラスミドpRN1120は、異なるCas12a変異体の単一crRNAおよび単一crRNA配列の発現に適している(例えば、アシダミノコッカス菌から)。BV3L6またはフランセッラノビシダU112)だけでなく、Cas919と組み合わせてsgRNAの発現のために.ドナーDNAは、ゲノムDNA中の記載のINT1、INT2およびINT3部位にドナーDNAを標的とするカロテノイド遺伝子発現カセットおよび横振り領域に限定される必要はない。目的の任意のDNAは、多重的な方法で、このプロトコルに記載された設計原理によって宿主のゲノムDNAに導入することができ、または代わりにドナーDNAを使用して宿主ゲノムからDNAを削除することができる。単一crRNA配列のモジュラー構造はスペーサーおよび直接反復配列の容易な調節を促進する。スペーサー配列の変更は、ゲノムターゲットサイトを識別するためのツールの1つ、例えばGuideScanソフトウェア1.039によって設計することができる意図された統合遺伝子座の変更を可能にする。コネクタ配列を含む大きな横面配列を使用する代わりに、PCRで使用されるプライマーにこれらの50bp横分領域配列を組み込むことによって、フレーティング領域の50-bpをドナーDNA配列に含めることができる。この場合、多重ゲノム編集実験を成功させるには、9つのドナーDNA断片の代わりに合計3つだけが必要です。
要約すると、このプロトコルは、単一のcrRNAアレイアプローチと組み合わせてCas12aを使用してS.セレビシエで多重ゲノム編集を実行するためのステップバイステップの指示を提供します。このプロトコルは、9つのドナーDNA断片と3つのgRNAをコードする単一crRNA配列を用いた多重ゲノム編集によって実証された。ここでは報告された3つの歪み設計について、50%から94%の間で高い全体的な編集周波数を示しています。結論として、Cas12aのユニークな特徴は、単一のcrRNAアレイを細胞内の個々のCRRNAに処理する機能であり、Cas12aは多重ゲノム編集を可能にし、複数の標的となる転写調節モジュールを開発するための優れたツールです。一度に式カセット。最終的に、3つの株は、黄色とオレンジの間の色合いで異なるレベルと色でカロテノイドを生産するために得られました。これらの株と野生型株で、我々は音響液体ハンドラーが酵母ピクセルアートを作るために簡単に使用することができる方法を示しました - これは彼女の有名な写真51 23でDNA構造の発見に貢献したロザリンド・フランクリンに敬意を表して5123<。/c1>。

CRISPR/Cas酵素は間違いなく分子生物学に革命を起こしており、これまで実現不可能だった速度でゲノムを工学的に使用するツールとして広く採用されています。CRISPR/Cas9ゲノム編集システムによるサッカロマイセスセレビシエゲノムの最初の改変は、DiCarloらによって報告された。2、成功した遺伝子ノックアウトを実証し、外部導入されたオリゴヌクレオチドを用いて点突然変異を行う。さらに酵母CRISPRツールボックスの開発が含まれています:触媒的に不活性な死んだCas9(dCas9)と転写エフェクタードメインの融合による転写調節3、両方のアプリケーション同時活性化、抑圧および欠失による代謝経路工学のゲノム編集および調節機能4, S. セレビシエゲノム5からの大きな断片の欠失, および多発染色体融合6.
CRISPR/Casゲノム編集システムは、細菌や考古学の適応免疫系に起源を見出し、これらのシステムはゲノム編集のために分子生物学者によって適応されています。その機能は、外来DNAまたはRNAの認識を担うRNAをコードするクラスター化された定期的な間隔異動性短いパリンドロミックリピート(CRISPR)DNA領域と、RNA誘導をコードするCRISPR関連遺伝子(Cas)に基づいています。エンドヌクレアーゼ1,7,8,9.CRISPR/Casシステムの最近のゲノム解析に基づいて、CRISPR/Casシステムを2つのクラス、5種類と16のサブタイプ10に分割することが提案された。2つのクラスは、ターゲット切断に関与するエフェクター複合体の組織に基づいて区別されます。通常、複数サブユニット組織を持つ CRISPR/Cas システムはクラス 1 として分類されますが、単一サブユニット エフェクタ 複合体はクラス 210,11に属します。本稿では、クラス2型V Cas12a(以前はCpf110、12と呼ばれていた)について、クラス2型II Cas9に代わる方法を検討する。Cas9は、よく特徴付けられており、研究で広く使用されていますが、Cas12aは追加機能12を提供しています。まず、Cas12aは、追加のトランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を必要とせずに、42〜44ヌクレオチドのCRISPR RNA(crRNA)との複合体を形成する。従って、CRISPR/Cas12aシステムとのゲノム編集に短いガイドRNAを利用できる。.CRISPR/Cas9と比較して。第二に、Cas12aのユニークなエンドナクレアーゼおよび内因性内因性リース活性は、その前crRNA13の成熟を可能にする。このRNase活性は、単一のCRISPR crRNAアレイ上の複数のcrRNAの符号化を可能にしますが、Cas9は、いわゆるシングルガイドRNA(sgRNA)または追加のエンドヌクレアーゼ(例えば追加のエンドヌクレアーゼの発現を別々に発現する必要があります)例えば、Csy4)は、各sgRNA14、15を取り囲むCsy4の認識モチーフと組み合わせて。第三に、Cas12aターゲットサイト認識は、ターゲットからの5'端の5'端にプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を必要とし、そのPAMからの+18/+23位置の後に切断され、粘着性のある端を持つDNAが切断されますが、Cas9は3'端から3'端に位置するPAMを必要とします。DNA12の鈍い端の切り傷を作成する -3 位置の後にターゲットと切断.第四に、PAMのコンセンサスヌクレオチド配列は、Cas12a(((T)TTV)とCas9(NGG)の間で異なり、これはCas12aをTリッチプロモーターおよびターミネータ配列16を標的とする有望な候補としている。最後に、最近の研究では、ネイティブのCas917よりもCas12aのターゲット特異性が大きいことが報告されました。
S.セレビシエのゲノム編集にCRISPR/Cas12aシステムを用いるためのプロトコルを提示し、複数のDNA発現カセットを独立ゲノム遺伝子座に同時に導入することに重点を置く(多重ゲノム編集)。単一の crRNA アレイ。プロトコルの主要な手順を図 1に示します。概念実証として、CRISPR/Cas12aシステムは、図2に概略的に示すようにβ-カロテン18の産生を可能にするS.セレビシエのゲノムに3つの発現カセットを導入するために適用された。β-カロチエンの産生は、S.セレビシエの表現型に影響を与える:すなわち、カロテノイド生合成に必要な3つの不発遺伝子の導入に成功すると、白色S.セレビシア細胞は黄色またはオレンジ色に変わり、各遺伝子のプロモーターの発現強度に応じて。この経路の簡単な視覚的読み出しのために、それはゲノム編集のための高度なCRISPRベースのシステムおよび方法を開発するために導入された19、20.本研究では、カロテノイド遺伝子crtE、crtYBおよびcrtIをコードする発現カセットは、異種プロモーターおよび相同ターミネータを用いたゴールデンゲートクローニング(GGC)アプローチ21を用いて構築された。 遺伝子の発現を駆動するために使用されます。式カセットは、コネクタと呼ばれるユニークな50塩基対(bp)配列で囲まれ、同じ50bp配列を持つ統合フランクDNA配列(フランク領域)を持つ生体内アセンブリを可能にし、その後の統合側位領域によって決定される位置で酵母のゲノムDNAに。異なるプロモーター強度を用いることによって、カロテノイド産生の異なるレベルを持つ株が得られ、細胞の色の変化をもたらした。「酵母アートプロジェクト」22に触発されたこれらの株は、ロザリンド・フランクリンの4色の高解像度「酵母写真」を作成するために、音響液体ハンドラを備えたスポッティングセットアップで使用されました。フランクリン(1920-1958)は、写真51 23、24、25によるDNA構造の発見に彼女の貢献でよく知られている英国の化学者とX線結晶学者でした。

<table><tbody><tr><td>プロトコルに特異的な化学物質</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック10787018</td><td></td><td>電気泳動</td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td>大腸菌形質転換体の選択</td></tr><tr><td>BsaI-HF (20 U/&micro;l)</td><td>New England BioLabs</td><td>R353L</td><td>Golden Gate Cloning</td></tr><tr><td>Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)</td><td>QIAGEN</td><td>854016</td> S<td>. cerevisiae CutSmart</td></tr><tr><td>Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B7204S</td> の<td>線形化 pRN1120</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid ナトリウム塩 from salmon testes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1626</td><td> S. cerevisiae (carrier DNA)</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td>pRN1120 の線形化</td></tr><tr>分析<td>用絶対エタノール</td><td>Merck</td><td>100983</td> S<td>. cerevisiae</td></tr> エ<tr><td>チレンジアミン-四酢酸</td>からのゲノムDNAの単離 <td>Sigma Aldrich</td><td>ED</td><td>の変換 S. cerevisiae</td></tr><tr><td>G418 二硫酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720</td><td>S. cerevisiae 形質転換体の選択</td></tr><tr><td>Histodenz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158&nbsp;</td><td>酵母ピクセルアート</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>メルク</td><td>100993</td><td>S. cerevisiae からのゲノム DNA の単離</td></tr><tr><td>酢酸リチウム二水和物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L688</td><td>><3 S. cerevisiae</td></tr><tr><td>Nancy-520 DNA ゲル染色</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1494</td><td>電気泳動</td></tr><tr><td>NEB10 有能な大腸菌細胞</td><td>New England BioLabs</td><td>C3019H</td><td>大腸菌の形質転換:dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6</td></tr><tr><td>Nourseothricin</td><td>イエナバイオサイエンス</td><td>AB102</td><td>S.cerevisiae形質転換体の選択</td></tr><tr><td>Phusionバッファー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0530L</td><td>PCRs</td></tr><tr><td>Phusion ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0530L</td><td>PCRs</td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール4000</td><td>メルク</td><td>7490</td><td>S の変換。cerevisiae</td></tr><tr><td>タンパク質沈殿液 (10 M NH4AC) (キット Puregene Yeast/Bact. キット B)</td> <td>QIAGEN</td><td>854016</td> S<td>. cerevisiae からのゲノム DNA の単離</td></tr><tr><td>パープルローディング色素</td><td>New England BioLabs</td><td>B7024S</td><td>電気泳動</td></tr><tr><td>QIAprep スピン Miniprep キット</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>プラスミド</td></tr><tr><td>RNase コクテール酵素ミックス</td>の精製 <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM2286</td><td>S. cerevisiae</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ緩衝液</td>からのゲノム DNA の単離 <td>Invitrogen</td><td>46300-018</td><td>Golden Gate Cloning</td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ (1 U/&micro;l)</td><td>Invitrogen</td><td>1705218</td><td>Golden Gate Cloning</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Electrophoresis</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>PCR産物および直鎖状化pRN1120の精製</td></tr><tr><td>Xhol</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td>pRN1120</td></tr><tr><td>Zymolyase 50 mg/ml (5 units/&micro;L)</td><td>Zymo Research</td><td>E1006</td><td>S. cerevisiae(酵母溶解酵素)からのゲノムDNAの単離</td></tr><tr><td>Zymolyase保存バッファー</td><td>Zymo Research</td><td>E1004-B</td><td>S. cerevisiaeからのゲノムDNAの単離(酵母溶解酵素の調製に必要)</td></tr><tr><td>一般使用の化学物質</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 *ペプトン酵母抽出物(PY)寒天</td><td></td><td></td><td>プレート大腸菌の増殖</td></tr><tr><td>2*PY培地</td><td></td><td></td> 大<td>腸菌の培養</td></tr><tr><td>脱塩水</td><td></td><td></td><td> S. cerevisiae</td></tr><tr><td>ELFOバッファー</td><td></td><td></td>の変換 <td>電気泳動</td></tr><tr><td>MQ</td><td></td><td></td><td>多段階</td></tr><tr><td>生理食塩溶液</td><td></td><td></td><td> S. cerevisiae TEの変換</td></tr><tr><td>DNAの緩衝液</td><td></td><td></td><td>貯蔵、S.cerevisiaeの形質転換</td></tr><tr><td>酵母エキス-ペプトン-デキストロース(YEPD;2%グルコース) 培地</td><td></td><td></td><td>S.cerevisiae</td></tr><tr><td>のYEPD(2%グルコース)寒天培</td><td></td><td></td>地の<td>培養 S.cerevisiae</td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorfチューブの</td><td></td><td></td><td></td></tr>プレート成長<tr><td>ファルコンチューブ(50 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレート96ウェルシャー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>レ</td><td></td><td></td><td></td></tr>ピ<tr><td>ペットチップ0.5-10 &micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ10-200 &micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ100-1000&micro;L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シェイクフラスコ (500 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>機器</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機(ファルコンチューブ)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エコー525音響リキッドハンドラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>元素</td><td></td><td></td><td></td></tr>栄養<tr><td>分光光度計</td><td></td><td></td><td></td></tr>用セットテーブル<tr><td>遠心分離機(エッペンドルフ管)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>プラスミド</ストロング>/</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCSN067</td><td>Addgene</td><td>ID 101748</td><td>https://www.addgene.org/</td></tr> <tr><td>pRN1120</td><td>Addgene</td><td>ID 101750</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.addgene.org/Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D</td><td>ユーロスカーフコレクション</td><td></td><td>http://www.euroscarf.de</td></tr></tbody></table>

crispr/cas12a サッカロマイセスセレビシエの多重ゲノム編集と酵母ピクセルアートの創造

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピート/CRISPR関連タンパク質9(CRISPR/Cas9)システムの高効率、使いやすさ、汎用性は、サッカロマイセスセレビシエの高度な遺伝子改変を促進しました。産業バイオテクノロジーにおける生物と馬力。CRISPR関連タンパク質12a(Cas12a)は、Cas9と区別できる特徴を有するRNA誘導エンドヌクレアーゼを本研究に適用し、ゲノム編集目的の分子ツールボックスをさらに拡張する。CRISPR/Cas12aシステムの利点は、単一の転写単位(単一のCRISPR RNA(crRNA)配列)から発現される複数のガイドRNAを用いた多重ゲノム編集で使用できることです。我々は、単一のcrRNA配列構築物から発現される複数のcrRNAを用いたCRISPR/Cas12aシステムを用いて、S.セレビシエゲノムの独立遺伝子に複数の異種遺伝子を多重統合するためのプロトコルを提示する。提案された方法は、S.cerevisiaeがDNA断片の生体内組み換えで行う能力を利用して、単一のcrRNAアレイを形質転換剤の選択に使用できるプラスミドに組み立てるだけでなく、ドナーDNAの組み立てを行う。意図した位置でゲノムに統合する配列。Cas12aは構成的に事前に発現され、単一crRNAアレイの発現時に意図された位置でS.セレビシエゲノムの切断を促進する。このプロトコルには、単一のcrRNAアレイとドナーDNA発現カセットの設計と構築が含まれており、ユニークな50bp DNAコネクタ配列と個別の統合フランクDNA配列を利用した統合アプローチを活用し、簡素化します。標準化とモジュール化を通じた実験設計を行い、幅広い用途に対応します。最後に、異なる色のカロテノイドを使用して、構築された酵母株を生成する音響液体ハンドラを用いて酵母ピクセルアートを作成するための簡単な技術を示す。

CRISPR/Cas12aシステムは単一のcrRNA配列と結合して複数の遺伝子座のS.セレビシエのゲノムの有効な多重編集を同時に可能にする。これは、その後、酵母ピクセル技術を作成するために使用される酵母株を生産するカロテノイドを構築することによって実証されます。

CRISPR/Cas12a サッカロマイセスセレビシエの多重ゲノム編集と酵母ピクセルアートの創造

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...

このプロトコルは、単一の変換ステップで異なる遺伝子座に複数の発現カセットを導入することにより、サッカロミセス・セレビシエのマルチプレックスゲノム編集のための新しい方法を示す。単一のcrRNAアレイを発現するためのこのクローニングフリープラスミドアセンブリアプローチは、迅速で効率的で柔軟なゲノム編集プロトコルにつながります。野生型酵母細胞を設計し、遊離ゲノム座に遊離異種遺伝子を導入してカロテノイドを産生します。単一のcrRNAアレイは、RNAポリメラーゼ遊離プロモーターから発現される遊離個体crRNAで構成される。Cas12aは、crRNAアレイを生体内で個々のcrRNAに処理する。crRNAはCas12aが二本鎖破断を導入するゲノムDNAの標的遺伝子座にCas12aを導く。下向きのDNA断片は、インビボ組み換えのために再結合し、ゲノムDNAに統合します。プロトコルのデモンストレーションは、博士課程の学生であるクラウディア・シウルコットです。ジェフリー・ファン・ウェイク、アソシエイト・サイエンティスト。そして、私たちの研究室のシニアアソシエイトサイエンティスト、ブレンダ・フォンク。合成DNAのマルチプレックスゲノム編集実験用の単一crRNAアレイを取得した後、PCR増幅ミックスを調製し、増幅のためにアレイをサーモサイクラーにロードします。PCR産物を電気泳動で分析するには、0.8%アガロースゲルを5V/cmで40分間実行します。100個の10000塩基対の範囲のDNA断片をDNAラダーにロードし、製造業者の指示に従ってPCR精製キットを使用してPCR製品を精製します。酵母変換の場合、20 mLの酵母エキスペプトンデキストロースまたはYEPD培地を含む100mLフラスコで野生型酵母を前培養することから始めます。一晩インキュベーションの場合、摂氏30度、および毎分250回転で翌朝、一晩培養前酵母の計算量で20mLの新鮮なYEPD培地を接種する。600ナノメートルで測定した光学密度が1.0になるまで、振度インキュベーターに培養液を入れる。遠心分離によって酵母細胞を収穫する。酵母細胞ペレットを20mLの室温脱塩水で洗浄し、続いてさらに遠心分離を行います。100マイクロリットルの酢酸トリス-EDTA溶液中のペレットを再懸濁し、酵母をマイクロ遠心分離チューブに移します。一本鎖キャリアDNA5マイクロリットルとプラスミドpCSN067の1マイクログラムを酵母細胞懸濁液と混合します。その後、サンプルとポリエチレングリコールLiAc-TE溶液の600マイクロリットルを混合します。酵母細胞とプラスミドを30分摂氏30度、テーブルトップヒートブロックで450prmインキュベートします。インキュベーションの終了時に、70 mLのジメチルスルホキシドを変質溶液と混合する。42°Cの水浴で15分間加熱衝撃を与えます。混合物を15mLの丸い底管に移す。摂氏30度と250rpmで一晩インキュベーションのためにチューブにYEPDの10 mLを追加します。翌朝、遠心分離によって形質転換された細胞を収集し、上清の最後の200マイクロリットルを除くすべてを吸引する。変容した酵母細胞ペレットを残りの上清に再懸濁させる。変換ミックスのプレート150マイクロリットル、およびYEPDの変換ミックスの残りの50マイクロリットルの20倍の希釈の150マイクロリットル、YEPD寒天板上、G418の1リットル当たり0.2グラムを補った。摂氏30度で48〜72時間後、G418の0.2 g /Lを補った新しいYEPD寒天プレートに再ストリーキングするための単一の変容剤を選びます。2番目の変換では、ちょうど示したように、1.0の600ナノメートルで光学密度に培養を成長させます。そして、マイクロ遠心チューブに細胞の20マイクロリットルを追加します。遠心分離後、細胞ペレットを100マイクロリットルのLiAc-TE溶液で再懸濁し、ssDNAを添加する。別のチューブでは、単一crRNAアレイの1マイクログラム、crRNAアレイ用の直線化されたレシピエントプラスミドの1マイクログラム、各ドナーDNAの1マイクログラム、および各隣接領域の1マイクログラムを組み合わせます。次に、DNA混合物を有能な酵母細胞のチューブに移し、最初の変換のために実証された2番目の変換を完了する。翌朝、遠心分離によって細胞を収集し、上清の小さなアリコートでペレットを再懸濁する。次に、変換ミックスのプレート150マイクロリットル、 YEPD培地中の変換ミックスの20倍の希釈の150マイクロリットル、0.2 g/L G418を補ったYEPD寒天プレート、0.2 g/Lノルセトリシン48〜72時間後、摂氏30度で、新しいYPDプレートで再ストリークするための単色の変質剤を選ぶ。ゲノム編集効率を決定するには、変換プレート上の色と白のコロニーの数を数え、着色されたコロニーの数をコロニーの総数で割ります。酵母画素技術を創り出すために、S.cerevisiae株を生産する3つの異なる色のカロテノイドを有するYEPD培地の100mLを含有する個々の500mLシェイクフラスコ、および野生型CENを接種する。PK113-7D株。250 rpmで振ると摂氏30度で一晩培養します。各一晩培養物の0.5mLを、チューブあたり0.5mLの無菌非イオン密度勾配培地を含む個々のチューブに移し、ボルテックスで溶液を簡単に混合します。細胞懸濁液を個々の修飾された貯蔵所2を3つの井戸に移す。音響液体ハンドラ装置の流体校正設定6RES_AQ_GPSA2を持つcsvファイルを使用して、適切な修飾された貯水池ソースプレートからYEPD寒天体の50 mLを含む6144ウェル宛先マイクロプレートに各S.cerevisiae株の25ナノリットルを発見します。すべての井戸が発見されたら、マイクロプレートを30デグレス摂氏で48時間インキュベートします。株の色を強めるには、寒天プレートを摂氏4度で少なくとも72時間保存します。ロザリンド・フランクリンの写真がプレートに現れました。実証されるように、プロモーター、オープンリーディングフレーム、ターミネータ、および2つの連続した50bpコネクタ配列をゴールデンゲートクローニング反応を介して発現カセットに組み立て、PCRによって検証することができる。PCRによる単一crRNAアレイの増幅後、単一crRNAアレイのレパレプラスミドは、電気泳動により確認されるようにリニア化される。多重ゲノム編集の効率は、変換後の着色コロニーの割合と、意図されたゲノムDNAの位置におけるドナーDNAの統合を確認するPCR分析の結果によって計算することができます。例えば、ロザリンド・フランクリンの白黒写真から始まり、4つのカラー画像とスポッティングリストが作成され、実証されているように、音響液体ハンドラを介して寒天マイクロプレート上の4つの異なる酵母株を見つけるために使用され、科学者の高解像度酵母絵画をもたらしました。この変換には、新しく調製した溶液と高品質のDNA断片を使用してください。この方法は、ゲノムDNAへの定義された欠失および点突然変異の多重導入にも適用することができる。また、CRISPRレギュレーション実験も行うことができる。このメソッドを変更して、配列内に解放 crRNA を超える数を導入して、同時に行うことができる変更の数を増やすことができます。

crisprcas12a-multiplex-genome-editing-saccharomyces-cerevisiae

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CRISPR/Cas12a サッカロマイセスセレビシエの多重ゲノム編集と酵母ピクセルアートの創造

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