Name: 高傾斜の構築ガイド拡張ビュー フィールドの単一分子イメージング用タイル顕微鏡を掃引 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶHIST顕微鏡の構築法。単一対物レンズを用い、従来比40倍の広視野と低バックグラウンドで単分子イメージングを実現。商業顕微鏡システムとの親和性も高く、研究者にとって有用なツールとなる。

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この作品は、防衛高等研究計画庁 (DARPA) (HR00111720066) と国立科学財団 (NSF) (1805200) によって支持されました。寛大 sCMOS カメラを貸し出し、アンドール技術マイケル ・ セルジュに感謝します

1. 顕微鏡、レーザーおよび配置ツールをセットアップします。
<ol><li>顕微鏡を構築する前に光学系、生: オプトメカトロニクス-電子材料の表に記載されているなど、必要なすべてのコンポーネントを準備します。</li>
	<li>2 つの部分の主に構成されて顕微鏡本体の準備: RMS スレッド ポートとピエゾ ステージ客観的ホルダー マウント アルミ ブロック (図 1A)。 注: カスタムメイド顕微鏡本体は、利便性と計測12の柔軟性に使用されます。すべての市販の顕微鏡のボディは、HIST 顕微鏡に使用できます。</li>
	<li>複数のレーザー ラインを組み合わせると、シングル モード光ファイバーにそれらを結合<ol>
<li>インストール 405, 561, 638 nm のレーザー光に表、図 1Bに示すように、偏光ビームスプリッターとロングパス ・ ダイクロイック ミラーを介して梁を組み合わせます。すべてのレーザ光線がアライメント ツールにピンホールを通過するかどうかを確認します。パワーの調整のための半波長板を挿入します。 注: 眼の保護のための安全ゴーグルを着用、ビーム ブロックを使って不要なレーザー光を吸収します。</li>
		<li>繊維のカップリング レンズをインストール (f = 4.5 mm) とファイバー アダプター z 軸翻訳でケージ システム。</li>
		<li>マルチモード光ファイバー (MMF、Ø 62.5 μ m) をファイバー アダプターに接続します。各レーザーのカップリング効率が 95% 以上になるまでは、ステアリングのミラーと z 翻訳の各ペアを調整します。出力ビームは、スペックル パターンと近いガウス形プロファイルを持っています。</li>
		<li>マルチモード光ファイバーを奪う、シングル モード光ファイバー (SMF) を接続します。MMF と同様に微調整から 3 つのレーザーの結合効率を最大化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>励起と検出パス内の梁の配置に使用される平行光源を組み立てます。このデバイスは一時的光源から成る (561 nm) SMF、色消しレンズ、ファイバー アダプターに接続されている (f = 60 mm)、アイリスと Ø1「ケージ システム (図 1C) スペーサーをチューブ。ファイバー アダプターとコリメーションようにせん断の干渉計を用いたレンズの間の距離を調整します。</li>
	<li>梁の配置ツール (図 1D) を準備します。これ 2"迅速かつ正確な光軸調整を可能にする光学テーブルの表面からの高さでピンホールとアルミニウムの記事のペアです。</li>
	<li>2 Ø1 から成っている二重ピンホール システムを組み立てる"両端に地面のガラスの配置ディスクと 2 つの Ø1"レンズ チューブ (1 番下は、すり割り付き) の図 1に示すように。</li>
</ol>2. 検出パスを設定
<ol><li>目的を取り出し、平行光源をインストールします。テーブルの上のネジ穴、顕微鏡から出力ビームは約高さ光学テーブルに平行で整列して客観的ホルダーの下にミラー (M1) のノブを調整します。光の各コンポーネントの詳細な位置図 2を参照してください。</li>
	<li>マルチバンド ダイクロイック ミラー (DM) を挿入し、90 度ビームを反映します。虹彩の最大サイズを使用して、ビームがクリッピングせずダイクロイック ミラーの中心を通過するかどうかを確認します。</li>
	<li>ダイクロイック ミラーを通過漏れのビームを使用して、検出パスの配置を進めます。梁に sCMOS カメラを配置し、ビームが (M2 および M3) 2 つのミラーを使用してカメラ チップの中心を打つことを確認します。</li>
	<li>チューブ レンズを挿入 (TL; f = 300 mm) カメラから離れて約 300 mm。</li>
	<li>平行光源を削除し、天井のパターンが明らかにカメラによって解決されるまでチューブ レンズとカメラの間の相対距離を調整します。</li>
	<li>マルチカラー蛍光イメージングのためチューブ レンズの前に複数のバンドパス フィルター (BF) を挿入します。</li>
</ol>3 励起パスの設定
<ol><li>目的のホルダーに平行光源を再インストールします。顕微鏡から 90 度折りミラー ビーム出力をリダイレクトする (M4) を配置します。梁は梁の配置ツールのピンホールを通過するまで繰り返しダイクロイック ミラーとフォールド ミラーのノブを調整します。</li>
	<li>平行光源をデタッチして、ビームを指して顕微鏡本体、テーブルの上にそれをインストールします。梁配置ツールとピンホールを二重システムを使用して梁を配置します。</li>
	<li>レンズ L4 を挿入 (f = 400 mm;Ø = 2") 光パス客観的ホルダーから約 400 mm に。対物レンズをインストールし、天井に完璧なエアリー ディスク パターンが形成されるまで光軸に沿って L4 の位置を調整します。 注意: レンズを挿入すると、レンズを通るビーム位置保管すべき変更。レンズ L4 は、60 mm SM2 スレッド ケージ プレートからアタッチ/デタッチを簡単にすることができます SM2 スレッドを持っています。</li>
	<li>目的を緩めて開いてアイリスと平行光源を再インストールします。ビジネス カードを使って顕微鏡からのビーム出力をトレースします。梁のサイズが最小の場所で L4 共役像面 (cIP) であるから約 400 mm M5 ミラーをマウントします。</li>
	<li>ミラー M6 をインストールし、90 度ビームを反映します。梁の配置ツールで繰り返し M5 と M6 を調整します。</li>
	<li>レンズ L3 を挿入 (f = 150 mm) M5 から約 150 mm。シェアリング干渉計を使用して、出力ビームのコリメーションを確保します。</li>
	<li>L4 とビームを下ってトレース L3 の焦点の位置を見つけるため一時的に奪います。この時点で単軸ガルバノ ミラーを置く、共役後焦点面 (コンゴ) であります。ガルバノ ミラーに 0 ボルトを供給し、90 度ビームを反映するようにガルバノ ミラーのホルダーを回転させます。</li>
	<li>フォールド ミラー M7 を配置します。L2 を正しく配置 (f = 100 mm) ステップ 3.6 と同様。</li>
	<li>オブジェクト所有者から平行光源を削除します。コリメーション レンズ L1 をインストール (f = 100 mm)、光ファイバー アダプターとアイリス。シングル モード光ファイバーをアダプターに接続し、イメージング システムを介してビームを送信します。</li>
	<li>L4 を挿入し、天井に完璧なエアリー ディスク パターンが表示されるまで、システムを微調整します。</li>
</ol>4. 円筒レンズを設定
<ol><li>シリンドリカル レンズを挿入 (CL1、f = 400 mm) L1 後軸ビームが円筒のレンズに焦点を当てているかどうかを確認。</li>
	<li>もう一つの円筒型レンズを挿入 (CL2、f = 50 mm) ビーム パスします。せん断の干渉計を使用すると、出力ビームを平行しています。 注: 2 つの円筒形のレンズ間の距離は 450 mm です。出力ビームは 8 の圧縮率と天井に細長い楕円形のエアリー ディスク パターンが形成されます。</li>
</ol>5. タイル画像のテスト
<ol><li>3D ゲルのサンプルを準備します。ミックス 20 nm クリムゾン ビーズ 12 %acrylamide:bisacrylamide (29:1)、0.2% (v/v) TEMED と 0.75 x TAE バッファー内過硫酸アンモニウム 0.2% (w/v) から成るハイドロゲル ソリューション。フロー室11を別の場所で説明されているように 50 μ L の混合液を注入します。10 分後に 3 D ゲル サンプルは、イメージングのために準備ができています。</li>
	<li>サンプル ホルダーにサンプルを置きます。638 nm レーザーをオンにし、パワーを調整 < 1 サンプル励起用 mW。</li>
	<li>カメラ制御ソフトウェアを実行します。カメラ取り込み設定パネルでトリガー モードで内部を選択し、ビデオを取る無料モードを実行するをクリックします。</li>
	<li>少しカメラの中央にイメージが配置 0 ボルトをガルバノ ミラーに適用する場合、カメラの位置を調整します。</li>
	<li>高傾斜照明を達成するために M5 ミラーの横のノブを回します。 注: 照明角度の増加に伴い、ハイドロゲル イメージなる梁が薄くなるとエピのイメージよりも明確。ただし、画像はほぼ同じ位置を保持します。</li>
	<li>タイル画像を記録します。効果的な照明幅11を計算します。たとえば、図 3は 12 μ m の効果的な照明の幅を示しています。</li>
</ol>6. HIST イメージング
<ol><li>ターミナル ブロックに接続されているデータ集録ボードを準備します。電線を通る P0.0 のユーザー 1 BNC コネクタを接続します。SCMOS カメラの外部トリガリング用デジタル出力としてユーザー 1 を使用します。アナログ接続 AO0 をガルバノ ミラー ドライバーに出力します。</li>
	<li>カスタムメイド プログラム (図 4A) を使用して P0.0 から TTL パルス列を生成し、周期時間を設定 = 400 ms と t_ON = 2 さんデジタル ・ オシロ スコープでユーザー 1 BNC 端子から生成されたパルスを確認し、カメラに BNC ケーブルを接続外部トリガー ポート。 注: このペーパーで使用される制御ソフトウェアはリクエストを承ります。別のカメラのフレーム レートでイメージングするときは、期間の時間が調整すべき。</li>
	<li>カスタムメイドのプログラムを介してガルバノ ミラーを掃除を開始します。V分-500 mV と V最大500 調整における FOV のイメージングのための mV。この操作は、[3 D ゲル サンプルまだ示す高いバック グラウンド Epi 照明のように注意してください。</li>
	<li>カメラの取り込み設定を変更します。<ol>
<li>[外部トリガー モード上下(シーケンシャル) LightScan プラス」ドロップ ダウン メニューで図 4Bに示すようします。 注: この設定でカメラがない画像を取るトリガー信号が有効でないです。</li>
		<li>ウィンドウの高さとラインの露光時間制御のスキャン速度コントロールをクリックし、 180 行と28 ms、それぞれに値を設定します。 メモ: タイルの幅 (Weff) が 180 行 (12 μ m) と、1行 (T はint) の積分時間は 28 ms ライン (TD) 間の遅延時間が決まります TDと Tint/Weffを = = 2,048 x をイメージング 0.156 さん2,048 ピクセルは、集録時間の合計は TD + Tint x 2,048 = 346 ms、~2.9 fps に対応します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>若干 Vmax Vminより鮮明な画像を取得するを調整します。</li>
	<li>3 D スタック上に、スタックとステップ サイズの番号を指定することでオーダーメイドのプログラムを使用して画像を 3D スタックを取得します。</li>
</ol>

<ol><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361, 880-887 (2018).</li>
<li>Lerner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+dynamic+structural+biology%3A+Two+decades+of+single-molecule+Forster+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Forster resonance energy transfer.</a> Science. 359, (2018).</li>
<li>Raj, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Approaches+to+Stochastic+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Approaches to Stochastic Gene Expression.</a> Annual Review of Biophysics. 38, 255-270 (2009).</li>
<li>Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+and+optical+sectioning+in+the+confocal+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+microscopy%22%5BJournal%5D)">Resolution and optical sectioning in the confocal microscope.</a> Journal of microscopy. 244, 113-121 (2011).</li>
<li>Sase, I., Miyata, H., Corrie, J. E., Craik, J. S., Kinosita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+imaging+of+single+fluorophores+on+moving+actin+with+an+epifluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real time imaging of single fluorophores on moving actin with an epifluorescence microscope.</a> Biophysical Journal. 69, 323-328 (1995).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Sectioning+Deep+Inside+Live+Embryos+by+Selective+Plane+Illumination+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li>
<li>Cella Zanacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+3D+super-resolution+imaging+in+thick+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples.</a> Nature Methods. 8, 1047(2011).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-+and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high- and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nature Methods. 12, 641(2015).</li>
<li>Gustavsson, A. K., Petrov, P. N., Lee, M. Y., Shechtman, Y., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+single-molecule+super-resolution+microscopy+with+a+tilted+light+sheet%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">3D single-molecule super-resolution microscopy with a tilted light sheet.</a> Nature Communications. 9, 123(2018).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5, 159-161 (2008).</li>
<li>Tang, J., Han, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+field-of-view+single-molecule+imaging+by+highly+inclined+swept+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Extended field-of-view single-molecule imaging by highly inclined swept illumination.</a> Optica. 5, 1063-1069 (2018).</li>
<li>Han, K. Y., Kim, S. K., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastable+Dark+States+Enable+Ground+State+Depletion+Microscopy+of+Nitrogen+Vacancy+Centers+in+Diamond+with+Diffraction-Unlimited+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Metastable Dark States Enable Ground State Depletion Microscopy of Nitrogen Vacancy Centers in Diamond with Diffraction-Unlimited Resolution.</a> Nano Letters. 10, 3199-3203 (2010).</li>
<li>Sinkó, J., Szabó, G., Erdélyi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ray+tracing+analysis+of+inclined+illumination+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ray tracing analysis of inclined illumination techniques.</a> Optics Express. 22, 18940-18948 (2014).</li>
</ol>

ユニバーシティ オブ セントラル フロリダは本稿で説明する作業をカバーする特許出願を提出しました。

このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。最初の 1 つ手順 3.3、入射ビームがレンズの中心を通るし、天井に完璧なエアリー ディスク パターンが形成されることの確保で L4 の適切な配置であります。L4 の位置は、すべて、他の光学部品、M5、L3、GM L2 などの配置を決定します。2 番目の重要なステップは、同期するプロセスです。アウト フォーカスの背景を拒否するには、効果的な検出幅がタイルの幅と等しい有効画素数はビーム掃引と同期する必要があります。したがって、タイルはり (ステップ 5.6) の効果的な照明の幅を測定する必要があるし、カメラを設定パラメーターはそれに応じてステップされて 6.4。
非常に大きな視野とイメージング、提案手法は、反対側と比較して 1 つの側面で増加の背景を示しています。これは撮像位置が異なる照明の角度を若干変更する起因します。同期的に、位置とスキャン角度11を調整する前に示されているように、この問題を軽減する M5 の代わりに 2 番目のガルバノ ミラーを実装します。既製の色消しダブレットの代わりにスキャン テレセンも役立つでしょう。しかし、イメージングの領域のための < 8,080 μ m2、単一ガルバノ ミラー掃除で十分でした。HIST 顕微鏡イメージングの深さの制限があります、しかし、それは 12 μ m タイルはりと NA 1.45 油浸対物レンズ11まで 〜 15 μ m をイメージングするとき良い SBR を取得することができます。
このプロトコルではタイルはりに 8 の梁の圧縮比を使用しました。薄い照明は、単一分子組織イメージング11の強力な可能性もある高い SBR を達成するために HIST 顕微鏡で使用できます。ただし、この場合、現在の梁の圧縮比はエピ11と比較しての 3 D イメージングで還元退色を示した増加励起強度によってフォトブリーチング効果を考慮する必要があります。直交配置された目的をもつ光シート顕微鏡に比べて、HIST 顕微鏡はシンプルに実装して従来のサンプル準備と互換性があります。強化 SBR と大きな FOV HIST 顕微鏡の相互作用と複数のセルに単一生体分子のダイナミクスを研究するため適しており、さらに使用することができます超解像イメージングと分子の追跡で。

単一分子蛍光イメージングは、微細構造、ダイナミクスと生体分子1,2,3の量を明らかにする多くの生物学的研究で重要な役割を果たしています。しかし、それは細胞や組織中の単一分子の研究にチャレンジしております。共焦点顕微鏡は、高断面機能4、高励起強度または低速のイメージング スピードによって重度のフォトブリーチングによる単一分子イメージングに適したはありません。広視野顕微鏡は弱い照明を使用しますが、劣悪な信号からバック グラウンド比 (SBR)5に苦しみます。光シート顕微鏡は、他の一方で、良い区分および低フォトブリーチング6を示すことができます。ただし、利用可能な開口数 (NA) は大きく直交配置目標7の要件によって制限されます。また、特別な照明とサンプル室8,9が必要です。
これらの理由から、3 D 分子イメージング10高い傾斜と薄板にされた光学シート (ヒロ) 顕微鏡に広く使用されています。傾斜梁には、2 つのメディア (ガラスや水、たとえば) のインターフェイスが検出されると、ビームがスネルの法則に従って屈折します。重要なは、屈折梁を薄く、取得し、その厚さは dz として記載されて R/tan(θ)、R は傾斜ビームの直径、θ は透過線の屈折角度を =。この単純な実装良い断面機能で起因します。それにもかかわらず、この関係は、小さな R および/または大規模な θ 薄い照明 (すなわち、高い断面能力) が必要であることを示します。たとえば、R = 20 μ m と θ = 72 度、dz が取得できます = 6.5 μ m。細胞の奥深くにイメージし、全内部反射を避けるのための屈折角を大きくための実際的な制限があるので、照明径とビームの厚さとの強い結合があります。このため、ヒロのイメージングは、比較的小規模の視野 (FOV) 多細胞イメージングへの応用を大幅に制限するを示しています。
最近では、我々 は、FOV が非常に簡単な方法11にビームの厚さから切り離される高度傾斜スイープ タイル (HIST) 顕微鏡によるこの問題を克服しています。まず、一方向に細長いビームがシリンドリカル レンズのペアを介して生成されます。タイルと呼ばれる、このビームを生成したアルジェリア薄い照明 ~ 4 μ m に FOV は 130 x 12 μ m2。その後、回転ガルバノ ミラーを使用してサンプル タイルを掃引します。一方、蛍光イメージは可変共焦点スリット検出となるローリング シャッター モードで動作して効率的にフォーカス アウト バック グラウンドをフィルター処理する科学的な相補型金属酸化膜半導体 (sCMOS) カメラに記録されます。この方法では、HIST 顕微鏡は、視野の大きい (~ 130 130 μ m2x) とヒロ画像より薄い照明 1 分子イメージングを使用できます。これ新しい撮像遺伝子発現や疾患の重要な可能性を秘めている細胞の一つのプローブまたはマウス脳組織におけるいくつかのプローブと RNA 転写産物を検出する技術を適用しました。他のアプローチとは異なり HIST 追加照明なし高開口数単一目的またはリモート検出目標のみを採用し、倒立顕微鏡に対応しています。これらの利点と大きな視野と高コントラストになる HIST 顕微鏡生物学と医学における重要なツール。HIST 顕微鏡およびテストおよび以下のパフォーマンスを調整する方法の実装に関する詳細な指示を紹介します。

<table><tbody><tr><td>1インチ アクロマティックダブレット</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-060-A-ML</td><td>コリメータ&nbsp;</td></tr><tr><td>1インチ アクロマティックダブレット</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L1,L2</td></tr><tr><td>1インチ アクロマティックダブレット</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-300-A-ML</td><td>TL</td></tr><tr><td>1インチ 広帯域誘電体ミラー</td><td>Thorlabs</td><td>BB1-E02-10</td><td>M1~M7</td></tr><tr><td>1インチ シリンドリカルレンズ</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1363RM-A</td><td>CL1</td></tr><tr><td>1インチ シリンドリカルレンズ</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM-A</td><td>CL2</td></tr><tr><td>1インチ スクエア キネマティック マウント</td><td>エドモンド オプティクス</td><td>58-857</td><td>ダイクロイック ミラー マウント用</td></tr><tr><td>1" スレッド ケージ プレート</td><td>Thorlabs</td><td>CP02</td><td>他のレンズを保持するため</td></tr><tr><td>2" アクロマティック ダブレット</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-150-A-ML</td><td>L3</td></tr><tr><td>2" アクロマティック ダブレット</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-400-A-ML</td><td>L4</td></tr><tr><td>2" スレッドケージプレート</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>L4</td></tr><tr><td>2インチ保持用 ネジ付きケージプレート</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01T</td><td>L3</td></tr><tr><td>2% Bis Solution</td><td>Bio Rad</td><td>64085292</td><td>ヒドロゲル成分</td></tr>保持用 <tr><td>20 nm 蛍光ビーズ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>F8782</td><td>イメージング検査用</td></tr><tr><td>30 mm ケージ直角キネマティックミラーマウント</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>目的とカメラマウント</td></tr><tr><td>30mm ケージシステム Iris</td><td>Thorlabs</td><td>CP20S</td><td></td></tr><tr><td>3軸 NanoMax Stage</td><td>Thorlabs</td><td>MAX311D</td><td></td></tr><tr><td>40% アクリルアミド溶液</td><td>Bio Rad</td><td>64148001</td><td>ハイドロゲル成分</td></tr><tr><td>405 nm レーザー</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-MLD</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE バッファー</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0743</td><td>ハイドロゲル成分</td></tr><tr><td>561 nmレーザー</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-DPL</td><td></td></tr><tr><td>638 nm レーザー</td><td>Cobolt</td><td>Cobolt 06-MLD</td><td></td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>シグマ</td><td>A3678-25G</td><td>ハイドロゲル</td></tr><tr><td>コンポーネント ビーム アライメント ツール</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BNC 端子台</td><td>Natural Instruments</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>ケージ プレート M9 x 0.5 内部ねじ</td><td>Thorlabs</td><td>CP1TM09</td><td>非球面レンズ保持用</td></tr><tr><td>ケージシステムロッド</td><td>Thorlabs</td><td>SRシリーズ</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養&smFISH</td><td></td><td></td><td>参考 [11]</td></tr><tr><td>両面テープ&nbsp;</td><td>スコッチ</td><td>515182</td><td>フローチャンバー</td></tr><tr><td>エポキシ&nbsp;</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td>フローチャンバー</td></tr><tr><td>ガルボミラー</td><td>Thorlabs</td><td>GVS211</td><td>GM</td></tr><tr><td>ガルボ システム リニア電源</td><td>Thorlabs</td><td>GPS011</td><td></td></tr><tr><td>半波長板</td><td>Thorlabs</td><td>WPH10M-405/561/633</td><td>パワー調整</td></tr><tr><td>ロングパス ダイクロイック ミラー</td><td>Chroma</td><td>T550lpxr</td><td>レーザーを組み合わせるため</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12549-3</td><td>フローチャンバー</td></tr><tr><td>Mikroskopische Deckglaser</td><td>Hecht Assistent</td><td>990/5024</td><td>フローチャンバー</td></tr><tr><td>マウント すりガラス アライメントディスク</td><td>Thorlabs</td><td>DG10-1500-H1-MD</td><td>ダブルピンホールシステム用</td></tr><tr><td>マウントされたロチェスター非球面レンズ</td><td>Thorlabs</td><td>A230TM-A</td><td></td></tr><tr><td>マルチバンド ダイクロイック ミラー</td><td>Semrock</td><td>Di03-R405/488/561/635-t3</td><td>DM; 厚さ 3 mm</td></tr><tr><td>マルチバンド フィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-446/523/600/677-25</td><td>BF</td></tr><tr><td>マルチモード ファイバー</td><td>Thorlabs</td><td>M31L02</td><td>MMF</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-テトラメチル エチレンジアミン</td><td>Σ</td><td>T7024-25ML</td><td>ハイドロゲル コンポーネント</td></tr><tr><td>NI-DAQ ボード</td><td>Natural Instruments</td><td>PCI-6733</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash;1インチ キネマティックミラーマウント</td><td>Thorlabs</td><td>KM100</td><td>ミラー保持用</td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>PLANAPO N 60X</td><td>60X 1.45NA オイル</td></tr><tr><td>ペデスタルベース クランプ フォーク</td><td>ニューポート</td><td>9916</td><td></td></tr><tr><td>ペデスタルピラーポスト</td><td>Thorlabs</td><td>RS1P8E</td><td></td></tr><tr><td>ピエゾコントローラー</td><td>Thorlabs</td><td>BPC303</td><td></td></tr><tr><td>偏光ビームスプリッター</td><td>Thorlabs</td><td>PBS251</td><td>レーザーを組み合わせるため</td></tr><tr><td>RMS-SM1アダプター</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A3TS</td><td>対物レンズ用</td></tr><tr><td>ロッドホルダー</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>回転ケージマウント&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>RSP1/CRM1/CRM1P</td><td>HWP & シリンドリカルレンズ取り付け用</td></tr><tr><td>sCMOS カメラ</td><td>Andor</td><td>Zyla-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>せん断干渉計</td><td>Thorlabs</td><td>SI100</td><td>ビームコリメーション試験</td></tr><tr><td>シングルモードファイバー</td><td>Thorlabs</td><td>P5-405BPM-FC-2</td><td>SMF</td></tr><tr><td>SM1 レンズチューブ</td><td>Thorlabs</td><td>SM1S25</td><td>ダブルピンホールシステム用</td></tr><tr><td>SM1 スロット付きレンズチューブ</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L30C</td><td>ダブルピンホールシステム用</td></tr><tr><td>ステージマウント</td><td>カスタムメイド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ネジ式ファイバーアダプター</td><td>Thorlabs</td><td>SM1FC</td><td></td></tr><tr><td>Z軸平行移動マウント</td><td>Thorlabs</td><td>SM1Z</td><td>ファイバーカップリング</td></tr></tbody></table>

高傾斜の構築ガイド拡張ビュー フィールドの単一分子イメージング用タイル顕微鏡を掃引

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

単一分子イメージングは大きく進歩した生物学的研究の分子機構の理解。ただし、厚さの細胞や組織に大きなビュー フィールド、コントラストの高い画像を入手するは困難だった。この問題を克服して高い傾斜スイープ タイル (HIST) 顕微鏡を紹介します。シリンドリカル レンズのペアは高速ガルバノ ミラーを介して大規模なイメージング領域にスキャンされた細長い励起光を生成する実装されました。4fの構成は、光学部品を配置する使用されました。科学的な相補型金属酸化膜半導体カメラは蛍光信号を検出し、ビームの掃引を同期ダイナミック共焦点スリット入りアウト フォーカスの背景をブロックします。すべての基本コンポーネントと HIST 顕微鏡を構築のステップバイ ステップの命令を提案します。

例として Atto647N の付いた単一座礁させた DNA を 638 の励起波長をイメージしました 3 D ハイドロゲルの nm。DNA は、ゲルの重合過程 acrydite 部位を介してハイドロゲル ネットワークに固定されました。画像は、図 5に示すように表面上 5 μ m で撮影されました。HIST のイメージは、単一分子スポットほとんど HIST イメージ 1.9 ± 0.7 はエピでやっと検出できること計算した信号対バック グラウンド強度比からエピ画像に比べてはるかに少ない背景を示した。
4 分子 RNA の蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (smFISH) を行った魚プローブします。図 5bは、A549 細胞イメージング バッファーの AlexaFluor 647 の付いたEEF2 (真核生物翻訳伸長因子 2) の smFISH 画像を表示 (サンプル準備11について私たちの前の仕事を参照してください)。最大強度投影は、5 μ m の厚みに対応する 20 z スタックで実行されました。HIST のイメージだけでなく多くの改善された SBR、エピの画像と比較してもより均一な照射を示した。エピ用露光時間は 400 ms 統合イメージング HIST のラインあたりの時間は 32 ms、どちらの力を持っていた、同じ照明 7.5 の mW が目的の前に測定しました。エピの HIST イメージング速度は 2.5 fps だった
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig1.jpg"> 図 1.顕微鏡本体、レーザーおよび配置ツール。(A) 目的、試料ホルダー。(B) レーザー システムの写真。LP、ロングパス ・ ダイクロイック ミラー;Λ/2 半波長板;PBS、偏光ビームスプリッターです。(C) Collimated 光源。(D) 2 つの挿入可能なピンホールにビーム配置ツール。(E) 二重ピンホール システム。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig2.jpg"> 図 2.高傾斜スイープ タイル (HIST) 顕微鏡の詳細セットアップします。写真 (A) の回路図 (B) HIST 顕微鏡システムと。BF、マルチ帯域通過フィルターCL1 2、円筒レンズ;DM は、ダイクロイック ミラー;GM は、ガルバノ ミラー;BF、帯域通過フィルターM1-7、ミラー;L1-4、レンズ。SMF のシングル モード光ファイバーです。TL チューブ レンズです。cIP、共役像面;コンゴ、共役戻ってフォーカル プレーンです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig3.jpg"> 図 3.8 の圧縮比と照明をタイルします。(A) 3 D ゲル 20 nm のビーズの蛍光イメージ。スケール バー、20 μ m. (B) 標準偏差 10 のデータ点によって滑らかに A の y 方向に沿って投影。赤の矢印の 12 μ m の効果的な照明幅<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2.jpg"> 図 4.フロント パネルのコントロールおよびイメージング ソフトウェア。(A) A カスタム LabView プログラムは同期的に、ガルバノ ミラー、sCMOS カメラの開始の獲得、ピエゾ ステージの動きのスキャンを制御します。(B) カメラ取り込み設定コントロール パネル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59360/59360fig5.jpg"> 図 5。(A) 画像の Atto647N ラベル DNA エピ、HIST の照明と 3 D ゲル。(B) smFISH 画像EEF2 4 を使用しての魚は、エピ、HIST 顕微鏡、A549 細胞プローブします。DAPI 染色が青色で表示されます。スケール バー、20 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59360/59360fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

詳細な指示は、タイル (HIST) 顕微鏡と 1 分子イメージングの用法を掃引高傾斜を構築する方法について説明します。

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

この方法では、従来の方法に比べ40倍の画像領域を持つ単一分子を可視化し、バックグラウンドシグナルを大幅に低減しています。他の手法とは異なり、我々のアプローチは、単一対物レンズを使用し、特別なサンプルチャンバーを必要とせず、それは、商用顕微鏡システムと容易に互換性があります。必要なコンポーネントを収集した後、システムの構築を開始します。ここでは、いくつかの要素がすでにベンチ上の位置にあります。アルミニウムブロックに取付けられるのは、ピエゾステージとサンプルホルダーを備えた顕微鏡本体です。またベンチには、ビームを組み合わせる3つのレーザーと光学要素があります。結合されたビームは可能な限り効率的に単一モードの繊維に結合される。最終予備工程として、コリメートされた光源をケージシステムに組み立てます。これは、シングルモードファイバ、ファイバアダプタ、アクロマティックレンズ、アイリスに接続された一時的なコヒーレント光源を備えています。検出パスで作業を開始します。まず、コリメートされた光源を顕微鏡本体の目的ポートに配置します。出力ビームがほぼ水平になり、ベンチの穴に合うように、目的の下のミラーを調整します。ビームパスに二色鏡を挿入し、ビームを90度反射します。ミラーを追加して、送信されたビームの sCMOS カメラへのパスを調整できるようにします。ミラーを使用して、ビームがチップの中心に当たるようにします。次に、カメラからの焦点距離に関する300ミリリットルの焦点距離チューブレンズを挿入します。顕微鏡本体からコリメートされた光源を取り除きます。次に、焦点面を設定するためにチューブレンズの位置を調整します。カメラが天井のパターンを明確に解決したら、調整を停止します。検出パスは、この回路図に示されています。なお、多色蛍光イメージング用のチューブレンズの前にマルチバンドパスフィルタを追加する。顕微鏡本体に戻ります。そこで、コリメートされた光源を目的のホルダーに再び取り付けます。二色鏡の後、反射ビームの経路に折り畳み鏡を置き、90度リダイレクトします。コリメートされた光源を顕微鏡本体から取り出し、近くに置きます。次に、400ミリの焦点距離レンズを鏡から焦点距離程度に挿入します。顕微鏡で体は対物レンズを取り付けます。次に、光軸に沿ってミラーの位置を調整します。目的の上の天井を観察し、完璧なAiryディスクパターンがそこに形成されたときに停止します。今、目的を削除し、開いた虹彩でコリメートされた光源を再インストールします。ビーム経路に沿って、ビームがミラーから約400ミリメートル離れたところで最小である場所を決定します。ポイントが特定されたら、そこに鏡を取り付け、共役した画像平面を取り付けます。この時点でのセットアップの状態は、この図に表示されます。追加したミラーには M5 というラベルが付いています。ビームを90度反射するために別のミラーを挿入し、その向こうに150ミリメートルの焦点距離レンズを取り付けます。レンズは、共役した画像平面から 150 ミリメートルでなければなりません。次に、励起ビームパスの最初のレンズを一時的に取り除きます。この構成では、第2レンズの焦点位置を見つける。この焦点に単一軸ガルボミラーを共役バックフォーカルプレーンとして配置します。ガルボミラーにゼロボルトを供給し、梁を90度反射するようにホルダーを回転させます。次に、ビームパスに沿って、ビームを 90 度に反射する折りたたみミラーを配置します。レンズをコンジュゲートバックフォーカルプレーンからのビームパスに沿って100ミリメートル配置します。もう一度、顕微鏡マウントからコリメートされた光源を取り除きます。虹彩と一緒にファイバーアダプタとシングルモードファイバで別の100ミリメートルコリメーションレンズを追加します。次に、虹彩、繊維、レンズを使用して、撮像システムを介してコリメートされたビームを送ります。次に、ビームパスの最後のコリメーションレンズの直前に焦点距離400ミリメートルの円筒レンズを挿入します。ビームを集中させるために使用します。50ミリメートル円筒レンズを450ミリメートルの最初の方に挿入します。これは、検出パスと励起パスの両方を持つ最終設定の概略図です。3つのレーザーの出力はシングルモード繊維によってパスに結合される。試験用 3D ヒドロゲルサンプルを準備します。これは、ヒドロゲルと混合された20ナノメートルの真紅ビーズで構成されています。セットアップ時に、ヒドロゲルサンプルをサンプルホルダーに入れる。サンプル励起用のレーザーは638ナノメートルのレーザーをオンにし、その電力を1ミリワット以下に調整します。内部トリガーモードでカメラコントロールソフトウェアを設定し、ビデオをキャプチャします。この時点でガルボモータはゼロボルトが適用されています。カメラをカメラの中央に置きます。次に、コンジュゲートイメージプレーンであるミラーを調整します。高傾斜照明を実現するために、ミラーの水平ノブを回転させます。20ナノメートルビーズを用いた3Dヒドロゲルのサンプル蛍光画像のようにタイル画像を記録します。スケールバーは20マイクロメートルです。ガルボミラーをスイープするハードウェアとソフトウェアを設定した後に進みます。これは、セットアップ用のガルボミラースイープソフトウェアです。Vminをマイナス500ミリボルトに設定して、完全な視野イメージングを手配します。その後、Vmaxを500ミリボルトに設定します。次に、カメラ取得ソフトウェアに切り替えます。トリガーモードで外部を選択します。[LightScan PLUS] ドロップダウン メニューで[次へ]を選択し、[スキャン速度コントロール]をクリックします。特定の制御パラメータを設定できるようになりました。[ウィンドウの高さ] に 180 行を入力します。[露出] に 28 ミリ秒と入力します。完了したら、ミラーコントロールソフトウェアに戻ります。ミラーコントロールソフトウェアで3DスタックONのスイッチをオンにします。スタックの数とステップ サイズを指定します。[ビデオを撮る]をクリックして、画像の録画を開始します。これは、一本鎖標識DNAのエピイメージングの一例である。対照的に、高度に傾斜したスイープタイル技術は、この画像を生成しました。HIST 画像は、Epi 画像と比較して背景が少ないです。DNAは3Dヒドロゲルにあり、励起波長は638ナノメートルです。ここに標識真核生物翻訳伸長因子2のエピ画像がある。HIST イメージは、信号と背景の比率を改善しました。また、より均一な照明を持っています。両方とも7.5ミリワットの同じ照明力を有する。イメージング速度はどちらも毎秒2.5フレームでした。常に高い傾斜角度を維持し、カメラの読み出しとスイープミラーを同期することが重要です。これにより、画像取得時に高い信号対バックグラウンド比が保証されます。HIST顕微鏡は、より深いイメージング深度での超解像イメージングや、厚い組織スライスでの高スループット遺伝子発現プロファイリングなど、いくつかのアプリケーションに利益をもたらすことを期待しています。

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Bioengineering

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