Name: PDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査は、上皮間膜遷移に対する成長因子-βの線量依存的効果を明らかにする (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 学ぶPDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査法。TGF-βによる上皮間葉転移時の細胞収縮性変化を定量化し、がん転移の力学的メカニズム解明に有用な手法を確立する。

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著者らは、トム・コジャー、マイケル・ランドリー、クリストファー・J・バレットにビーズ合成の支援に感謝しています。A.J.E.は、自然科学・工学研究評議会がRGPIN/05843-2014およびEQPEQ/472339-2015、カナダ保健研究所助成金第143327号、カナダ癌学会助成金第703930号、カナダイノベーション財団を承認プロジェクト #32749。R.クリシュナンは、国立衛生研究所の助成金を認めます。R21HL123522およびR01HL136209。H.Y.はフォンド・ド・レチェルシュ・サンテ・ケベック、フォンド・ド・レチェルシュ・ネイチャー・エ・テクノロジーズ・ケベックによってサポートされました。著者は、ビデオと原稿の支援のためにヨハナン・イディキュラに感謝し、ビデオの準備を支援するためにZixin He.

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<li>Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+monodisperse+PMMA+microspheres+in+nonpolar+solvents+by+dispersion+polymerization+with+a+macromonomeric+stabilizer%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+%26+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer.</a> Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).</li>
</ol>

AJEとRKは、この記事に記載されている材料を製造するライブセルテクノロジーに関心を持っています。

この方法の成功のためには、約100μmの一定の厚さの均一にコーティングされたサンプルを持つことが重要です。モジュラスは、目的の生物学的システムの物理的な意義を調べるために慎重に選択する必要があります。最上層を製造する場合、フィデューシャル蛍光粒子の濃度は、変位と牽引応力の正確な分析のために最適化する必要があります。単一細胞を分析するには、コンフルエント単層を測定するよりも密度の高い受託層が必要です。さらに、基板の表面は、基板表面に細胞が適切に取り付けられることを保証するために、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどの接着分子の安定した均一なコーティングを有する必要があります。マルチウェルディバイダーを取り付ける場合は、特に注意が必要です。PDMS接着剤が培養面に塗りつぶされないようにスライドせずに配置し、外側のエッジをガラスの寸法に慎重に合わせて、国境の井戸に漏れないようにする必要があります。
井戸が漏れないようにするには、十分な量のPDMS接着剤を井戸の仕切り器に塗布して所定の位置に保持する必要があります。しかし、過剰な量の使用は、細胞培養表面をカバーします。
<p ...

アクトミオシン収縮は、運動性および増殖から幹細胞分化に細胞行動に影響を与える活性細胞力学の不可欠な要素である。組織では、収縮性は胚形成における極性分離から気道収縮および心臓活動に活動を駆動する。批判的に、緊張を生成するために、細胞は最初に細胞外環境に付着しなければなりません。そうすることで、この収縮性は周囲に牽引力を生み出す。トラクションフォース顕微鏡(TFM)は、異なる条件下で多様な細胞からこれらの力を定量化する方法として、多数の形態で出現した。
TFMの分野は、革新と応用の例外的な幅を見てきました, そして、結果は、力学と物理的な力を組み込んだ生物学の新しい視点のための道を開きました.シリコーン基板1のしわから始まり、研究者は細胞牽引力を測定するために様々な技術を適用してきました。これらのアプローチは継続的に改善され、現在は数ミクロン2の順序で解像度のレベルに達しています。しかし、1つの主な問題が浮上しており、これは利用可能なシリコーンを用いて適切に低いモジュリの基板を作成する難しさである。この問題を回避するために、ポリアクリルアミドは、1-20 kPa3の順序で基板を作成する容易さのために代替として採用されました。我々は最近、TFM4に非常に準拠したシリコーンを実装し、ポリアクリルアミドと同じ範囲のモジュリを製造することができますが、不活性で堅牢なシリコーンの利点を持ちます。
TFMのアプローチは貴重なメカノ生物学的発見を可能にしましたが、持続的な欠点は、その複雑さであり、多くの場合、工学や物理科学の分野の研究者にその使用を制限します。これは、収縮性を定量化するために必要な詳細なキャリブレーションと挑戦的な計算に大部分が起因します。もう一つの重要な課題は、TFM法が主に低スループットであり、したがって、同時に多くの異なる条件や集団を研究するのに適していないことです 5.これは、より広範な生物学的および薬理学的応用への専門的な生物物理学からのTFMの移転を妨げているボトルネックを提示している。
我々は最近、研究者が異なる化合物の影響を探求し、またより少ない試薬を使用しながら、収縮性メトリックのより速い定量のために彼らのTFM測定値を並列化することを可能にするマルチウェルフォーマットTFMプレートを開発しました4.この方法論は、細胞活動に対する化合物の影響の評価から、分化または疾患の収縮変化の定量化にまで、多様なメカノバイオロジー研究において広範な有用性を有する。
TFMから大きな利益を得る生物医学的研究の1つの領域は、物理的な手がかりが癌細胞の悪性発現型にどのように影響するかの研究です。転移は、癌関連死の90%を担う、癌細胞が元の腫瘍部位を離れ、二次部位を植民地化することを特徴とする。細胞が組織を通って移動し、血管系の中を出入りするためには、細胞外マトリックスに沿って自分の道を引っ張ったり、他の間を移動したりする実質的な力を生み出しながら、これらの物理的な障壁を圧迫するために形状を根本的に変更する必要があります。細胞。これらの力は、焦点接着相互作用2、3を介して基板に伝達され、TFMを用いて定量することができる。癌は非常に多様であるが、既知の突然変異およびタンパク質の変化の拡大するレパートリーと共に、いくつかの一般的な物理的変化が観察されている。乳癌、前立腺癌、肺癌を含む様々な癌において、転移細胞は非転移細胞6、7、8の牽引力の2〜3倍を発揮することが示されている。これらの結果は、転移性進行と細胞が働く牽引力との間に強い相関関係がある可能性があることを示唆している。しかし、収縮性の詳細な時間依存の変化を調べるのは困難です。
上皮間葉転移(EMT)は、細胞が付着性および接合接合性媒介細胞接着を減少させ、より渡り、侵襲的になるプロセスである。創傷治癒や発達過程を含む生理機能に加えて、EMTは転移時に利用されるプロセスであり、このプロセスを研究するのに有用なモデルシステムです。TGF-βを用いて、マウス乳液上皮細胞(NMuMG)9にEMTを誘導し、この形質転換中の物理的変化を直接定量し、EMTおよび細胞収縮性に対するTGF-βの時間および用量依存的効果を特徴付けることができる。この記事では、誘発EMT中の収縮性の変化を測定することによって、このアプローチの有用性を実証する。

<table><tbody><tr><td>Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GEL-8100</td><td>Nusil Technology</td><td>GEL-8100</td><td>高純度誘電体、軟質シリコーンゲルキット</td></tr><tr><td>ダウ・コーニング・シルガード 184 シリコーン封止剤 クリア 0.5 kg キット</td><td>エルスワース 接着剤</td><td>184 SIL エラストキット 0.5KG</td><td>硬化剤</td></tr><tr><td>カスタムカットガラス&nbsp;</td><td>Hausser Scientific Company</td><td></td><td>109.6mm&plusmn; x 72.8mm&plusmn; x 1mm</td></tr><tr><td>thickness Target 2TM Nylon Syringe Filter</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F2513-4</td><td></td></tr><tr><td>96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder</td><td>Corning</td><td>2572</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレン ユニバーサル マイクロプレート リッド コーナーノッチ付き&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>3099</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>グリーンフィールドグローバル</td><td>P016EA95</td><td>0.95</td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>190764</td><td>ACS試薬、&ge;99.5%</td></tr><tr><td>Surface Coating</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH架橋剤</td><td>プロテオケム</td><td>c1111-100mg</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチンウシ血漿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-1MG</td><td>溶液、滅菌ろ過、BioReagent、細胞培養</td></tr><tr><td>PBSに適しています、1X</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>pH 7.4、カルシウムとマグネシウムなし</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM、1X</td><td>Wisent</td><td>319-005-CL</td><td>4.5g/L グルコース、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッド</td></tr><tr><td>FBS (ウシ胎児血清)</td> <td>Wisent</td><td>080-150</td><td>プレミアム品質、&nbsp;エンドトキシン <1、ヘモグロビン<25</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent</td><td>330-050-EL</td><td>1M、遊離酸</td></tr><tr><td>ヒトインスリン組換えWisent</td><td></td><td>511-016-CM</td><td>USPグレードの</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL</td><td>100 X、細胞培養用無菌ろ過済み</td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液</td><td>Wisent</td><td>609-065-EL</td><td>200mM溶液、細胞培養</td></tr><tr><td>用滅菌ろ過アンホテリシンB</td><td>ウィセント</td><td>450-105-QL</td><td>250&mu;g/ml、細胞培養用滅菌ろ過</td></tr><tr><td>組換えヒトTGF-&β;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>HEK293 派生</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>537020</td><td>氷河、&ge;99.85%</td></tr><tr><td>シクエン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275&nbsp;</td><td>ACS試薬、&ge;99.5%</td></tr><tr><td>NMuMG</td><td>ATCC</td><td>CRL-1636</td><td>マウス乳腺細胞株</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>フィッシャーSchientific</td><td>AC190385000</td><td>99%、超純粋、ACROS有機物</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>221473</td><td>ACS試薬、&ge;85%、ペレット</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>ラボグレード</td></tr><tr><td>ビーズ合成</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,1&prime;-ジオクタデシル-3,3,3&prime;,3&prime;-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩(DiI)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>468495-100MG</td><td>97%</td></tr><tr><td>メタクリル酸メチル</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>M55909-500ML</td><td>には&leが含まれています。30&nbsp;阻害剤としてのppm MEHQ、99%</td></tr><tr><td>阻害剤除去剤</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>306312-1EA</td><td>ハイドロキノンおよびモノメチルエーテルヒドロキノンメタ</td></tr><tr><td>クリロキシルプロピル末端ポリジメチルシロキサン</td>を除去するためのプレパックカラム<td>&nbsp;</td><td>DMS-R31 (25,000g/mol)</td><td>ポリジメチルシロキサン安定剤 25,000g/mol 1,000 cSt</td></tr><tr><td>2,2&prime;-アゾビス(2-メチルプロピオニトリル) (AIBN)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>441090-25G</td><td>98%</td></tr><tr><td>ヘキサン&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>296090-2L</td><td>無水、95%</td></tr><tr><td>ヘキサン、異性体</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>227064-1L</td><td>無水、&ge;99%</td></tr><tr><td>ワットマン&nbsp;定性濾紙、グレード1</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>WHA1001055</td><td>円、直径55&nbsp;mm、</td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laurell WS-650Mz-23NPPB</td><td>Laurell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVP ハンドヘルド UV ランプ モデル UVGL-58</td><td>VWR</td><td>21474-622</td><td></td></tr><tr><td>レオメータ</td><td>アントンパール</td><td>MCR 302 WESP</td><td></td></tr></tbody></table>

pdmsを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査は、上皮間膜遷移に対する成長因子-βの線量依存的効果を明らかにする

High Throughput Traction Force Microscopy Using PDMS Reveals Dose-Dependent Effects of Transforming Growth Factor-&#946; on the Epithelial-to-Mesenchymal Transition

細胞の収縮性は、生物学の多様な側面において不可欠であり、運動性と分裂から組織収縮および機械的安定性に至るまで、多細胞動物生活の中核的な要素を表すプロセスを駆動する。付着細胞では、アクトミオシン収縮は、細胞がその基板に作用する牽引力で見られる。細胞収縮の調節不定は無数の病理に現れ、生物物理学をメトリックとして用いた多様な診断アプローチにおいて、収縮性が有望な標的となる。さらに、新しい治療戦略は、細胞収縮の明らかな誤動作を修正することに基づいていることができます。しかし、これらのアプリケーションは、これらの力の直接定量化を必要とします。
シリコーンエラストマーベースのトラクション力顕微鏡(TFM)を並列マルチウェルフォーマットで開発しました。シリコーンゴム、特にポリジメチルシロキサン(PDMS)を使用することで、一般的に使用されるヒドロゲルポリアクリルアミド(PAA)ではなく、特殊な貯蔵条件を必要としない無期限の棚寿命を持つ堅牢で不活性な基板を作ることができます。GPa範囲に係数を持つピラーPDMSベースのアプローチとは異なり、ここで使用されるPDMSは、約0.4 kPaから100 kPaに至るまで、非常に準拠しています。これらの大きなモノリシック基板を生化学的に独立したウェルに空間的に分割することにより、TFMのハイスループットプラットフォームを作成し、既存のマルチウェルシステムと互換性のある牽引力スクリーニングのためのマルチウェルプラットフォームを作成します。
この原稿では、このマルチウェル牽引力システムを使用して、上皮から間質遷移(EMT)を調べます。NMuMG細胞にEMTを誘導し、TGF-βにさらすことで、EMT中の生物物理学的変化を定量化します。TGF-β暴露の濃度と持続時間の関数として収縮性を測定する。我々の知見は、疾患生物物理学の文脈における並列化されたTFMの有用性を示す。

TGF-βを添加する前に、細胞のコンフルエント単層は、形状のような石畳を有し、しっかりと詰め込まれる。TGF-β治療では、細胞は形態でより細長くなり、細胞領域を拡大し、より間葉性表現型を獲得する。ソフトPDMSエラストマーで製造されたマルチウェル装置を用いて、合計17種類の条件で細胞の物性を検討した。細胞を4つの異なるTGF-β濃度(0.5、1、2、および4 ng/mL)と4つの異なるインキュベーション時間(12、24、48、96時間)で処理し、これらの結果を図5に要約した。TGF-βで処理した細胞は、TGF-βを用いずに培養した細胞よりも大きな牽引応力およびひずみエネルギーを適用した。96時間TGF-βでインキュベートした細胞は、最大の牽引応力および歪みエネルギーを示した。細胞は、TGF-βのより高い濃度で処理した場合、より大きなストレスとひずみエネルギーを適用しました。トラクションとひずみエネルギーの違いは、より長いインキュベーション時間でより明確でした。
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シリコーンゴム(PDMS)で製造された高スループットトラクション力アッセイを提示する。この新しいアッセイは、様々な生物学的および生物医学的プロセスおよび疾患における細胞収縮性の物理的変化を研究するのに適している。上皮間葉転移中の収縮性のTGF-β依存性の増加を測定することにより、この方法の有用性を実証する。

PDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査は、上皮間膜遷移に対する成長因子-βの線量依存的効果を明らかにする

Cellular contractility is essential in diverse aspects of biology, driving processes that range from motility and division, to tissue contraction and ...

私の研究室では、細胞がどのように作用し、機械的な力の影響を受けるかを調べるメカノバイオロジーに興味があります。メカノバイオロジーを定量化する1つの方法は、細胞収縮性を測定する方法です。付着細胞において、収縮性は細胞基質に及ぼす牽引力に現れる。我々は、一般に牽引力顕微鏡またはTFMと呼ばれる方法論を用いてこれらの力を定量化する。TFMはさまざまな方法で実装されていますが、一般的な側面は、このような単一の料理で通常行われるかなりシリアルで遅いラボテクニックです。これは、一度に1つの人口または条件を評価することを制限します。細胞培養を通してしばらく前に改善されましたが、マルチウェル料理を作り出し、私たちは同じスループットと時間と試薬の同じ効率でTFMにできることは素晴らしいことだと思いませんか?そして、これが私たちの解決策でした。そこで、96ウェルトラクションフォースディッシュを作成しました。そして、それは従来の96ウェル組織培養皿に非常によく似ていますが、この料理では96の異なる細胞培養条件を調べるだけでなく、細胞の収縮性を定量化することができます。これは、単一の皿のアプローチよりもはるかに高いスループットソリューションを提示し、多様な細胞の状態と収縮応答を調べることができます。がん転移の間、がん細胞は原発部位から二次部位に移動し、体内に病気を広げます。癌細胞の転移性行動は、癌関連死の90%を占める。上皮癌細胞がより渡りおよび侵襲的表現型を獲得するための提案されたメカニズムの1つは、上皮間葉転移である、EMTである。EMTの間に、彼らはより多くの回遊性と侵襲的になり、彼らの物理的な行動を変える。これらの物理的挙動の変化をよりよく理解するために、ソフトシリコン基板を利用して、TGFによるEMT誘導によるマウス乳腺細胞の収縮性の変化を測定する研究では、TGF細胞の物理的挙動に対する濃度とインキュベーション時間の異なる影響を調べた。ポリジメチルシロキサンは、ヤング率が約0.6キロパスカルの最も低い非常に準拠したゴムです。この材料の剛性はまた、我々は、Rheometerを使用して、PDMSの機械的特性を測定するSYLGARDを含む架橋剤の異なる濃度を使用して調整184.Toすることができます。PDMSの部品AとB部を混合した後、1対1重量比で硬化剤を指定重量パーセントで添加し、準備したバッチをレオメータプレートにロードする。スピンドル領域を完全にカバーするためにサンプルを十分にロードしてください。スピンドルが、端に空きスペースが残っていないまま、サンプルに完全に触れないようにすることが重要です。余分なサンプルは慎重にトリミングし、プレートから拭く必要があります。0.5%ニューシャの振動剪断線で時間と周波数スイープを行うことによって、各サンプルの粘弾性の最終的な貯蔵弾性率と時間依存性を測定する]このグラフは、0.5%の適用された振動剪断線株と1000の温度を有するポリジメチルシロキサンのレオロジー挙動を測定するために行った時間セク試験の一例である

high-throughput-traction-force-microscopy-using-pdms-reveals-dose

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

定量的形質転換成長因子（TGF）-β誘導性3次元コラーゲンゲル内侵入を測定するアッセイが記載されている。このアッセイでは、乳がんの開発のさまざまな段階を表現する細胞株のMCF10Aシリーズ、を活用しています。このメソッドは、他の細胞株で使用できるように採用することが可能と侵略の他の潜在的な活性化剤または阻害剤を調査するために使用される可能性があります。...

TGF -β誘発性浸潤を測定する回転楕円体アッセイ

簡単な方法は、種々の細胞型における間葉移行（EMT）上皮の誘導のために記載されている。免疫細胞化学によるEMT状態にある細胞の分析のための方法が含まれる。...

間葉転換を誘導し、上皮の分析

選択的スプライシング制御は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおける必須の細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)に寄与することが示されています。ここでは、EMT中の選択的スプライシングの検出に誘導性EMTモデルを利用する方法について説明します。...

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

ここでは、上皮間葉転換を経験した間葉系細胞の収縮機能を評価するためのゲル収縮アッセイの開発と応用について説明します。...

開発<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイは、間葉細胞受けた上皮間葉移行の収縮機能を評価します

細胞分化は、マトリックス組成物と基板材料の特性の両方を含む微小環境因子の宿主によって調節されます。ここでは細胞分化および微小環境のコンテキストの関数としての生体力学的な細胞 - 基質相互作用の両方を評価するための牽引力顕微鏡と組み合わせて、細胞マイクロアレイを利用した技術が記載されています。...

細胞の分化やトラクション軍の相関的分析のためのハイスループット細胞マイクロアレイプラットフォーム

ここでは、マイクロRNA-200ファミリーメンバーとgrainyhead様2（GRHL2）の合成異所性発現に基づく肉腫細胞における間葉上皮移行（MET）を誘導する細胞培養方法を提示します。この方法は、癌の悪性度や治療上の表現型可塑性の生物学的影響をよりよく理解するために適しています。...

肉腫細胞における間葉上皮移行の誘導

体外誘導 EndMT に関与する細胞のシグナル伝達経路を調査するために有用である内皮間葉転換 (EndMT) のためのプロトコルを説明します。この実験モデルでは、EndMT は MS 1 血管内皮細胞における TGF-β...

成長因子 β シグナルを変換することによって誘導される血管内皮間葉移行の分子解析

ここでは、ギャップ接合コネクシン43を破壊する力学ベースのプロトコルを提示し、トラクションと細胞間応力の観察を通じて内皮バイオメカニクスに及ぼすその後の影響を測定する。...

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

このシグナル経路に関与するタンパク質および遺伝子発現を研究することにより、TGF-βシグナル伝達およびTGF...

乳がんおよび正常細胞におけるTGF-βシグナル伝達とTGF β誘発性上皮間葉間質転移の研究

細胞形態変化を観察し、免疫蛍光染色を用いたEndMT関連マーカー変化の発現を調べることにより、内皮細胞におけるTGF-β2誘導EndMTを調べる方法について述べる。CRISPR/Cas9遺伝子編集は、TGF-β2誘導EndMTにおけるその役割を調査するためにカタツムリをコードする遺伝子を枯渇させるために記述され、使用された。...

TGF β媒介性間葉転移(EndMT)およびCRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたEndMTエフェクターの機能評価

成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

学ぶPDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査法。TGF-βによる上皮間葉転移時の細胞収縮性変化を定量化し、がん転移の力学的メカニズム解明に有用な手法を確立する。

PDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査は、上皮間膜遷移に対する成長因子-βの線量依存的効果を明らかにする

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