PDMSを用いた高スループットトラクション力顕微鏡検査は、上皮間膜遷移に対する成長因子-βの線量依存的効果を明らかにする
June 1st, 2019
シリコーンゴム(PDMS)で製造された高スループットトラクション力アッセイを提示する。この新しいアッセイは、様々な生物学的および生物医学的プロセスおよび疾患における細胞収縮性の物理的変化を研究するのに適している。上皮間葉転移中の収縮性のTGF-β依存性の増加を測定することにより、この方法の有用性を実証する。
私の研究室では、細胞がどのように作用し、機械的な力の影響を受けるかを調べるメカノバイオロジーに興味があります。メカノバイオロジーを定量化する1つの方法は、細胞収縮性を測定する方法です。付着細胞において、収縮性は細胞基質に及ぼす牽引力に現れる。我々は、一般に牽引力顕微鏡またはTFMと呼ばれる方法論を用いてこれらの力を定量化する。TFMはさまざまな方法で実装されていますが、一般的な側面は、このような単一の料理で通常行われるかなりシリアルで遅いラボテクニックです。これは、一度に1つの人口または条件を評価することを制限します。細胞培養を通してしばらく前に改善されましたが、マルチウェル料理を作り出し、私たちは同じスループットと時間と試薬の同じ効率でTFMにできることは素晴らしいことだと思いませんか?そして、これが私たちの解決策でした。そこで、96ウェルトラクションフォースディッシュを作成しました。そして、それは従来の96ウェル組織培養皿に非常によく似ていますが、この料理では96の異なる細胞培養条件を調べるだけでなく、細胞の収縮性を定量化することができます。これは、単一の皿のアプローチよりもはるかに高いスループットソリューションを提示し、多様な細胞の状態と収縮応答を調べることができます。がん転移の間、がん細胞は原発部位から二次部位に移動し、体内に病気を広げます。癌細胞の転移性行動は、癌関連死の90%を占める。上皮癌細胞がより渡りおよび侵襲的表現型を獲得するための提案されたメカニズムの1つは、上皮間葉転移である、EMTである。EMTの間に、彼らはより多くの回遊性と侵襲的になり、彼らの物理的な行動を変える。これらの物理的挙動の変化をよりよく理解するために、ソフトシリコン基板を利用して、TGFによるEMT誘導によるマウス乳腺細胞の収縮性の変化を測定する研究では、TGF細胞の物理的挙動に対する濃度とインキュベーション時間の異なる影響を調べた。ポリジメチルシロキサンは、ヤング率が約0.6キロパスカルの最も低い非常に準拠したゴムです。この材料の剛性はまた、我々は、Rheometerを使用して、PDMSの機械的特性を測定するSYLGARDを含む架橋剤の異なる濃度を使用して調整184.Toすることができます。PDMSの部品AとB部を混合した後、1対1重量比で硬化剤を指定重量パーセントで添加し、準備したバッチをレオメータプレートにロードする。スピンドル領域を完全にカバーするためにサンプルを十分にロードしてください。スピンドルが、端に空きスペースが残っていないまま、サンプルに完全に触れないようにすることが重要です。余分なサンプルは慎重にトリミングし、プレートから拭く必要があります。0.5%ニューシャの振動剪断線で時間と周波数スイープを行うことによって、各サンプルの粘弾性の最終的な貯蔵弾性率と時間依存性を測定する]このグラフは、0.5%の適用された振動剪断線株と1000の温度を有するポリジメチルシロキサンのレオロジー挙動を測定するために行った時間セク試験の一例である
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概要
この研究では、シリコンゴム（PDMS）で作られた高スループットの引張力アッセイを提示し、さまざまな生物学的プロセス中の細胞の収縮性における物理的変化を調査するように設計されています。この方法の有用性は、上皮間質移行中のTGF-β依存性の収縮性の増加の測定によって実証されています。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- 生体力学
- バイオメディカルエンジニアリング
背景
- 細胞の収縮性はさまざまな生物学的プロセスにおいて重要です。
- 収縮性の変化を理解することで、疾患への洞察が得られます。
- 従来の方法はスループットと感度に欠ける可能性があります。
- PDMSはアッセイを作成するための多用途な材料です。
研究の目的
- 細胞の収縮性を測定するための高スループットアッセイを開発すること。
- 上皮間質移行中の収縮性に対するTGF-βの影響を評価すること。
- さまざまな条件下での細胞挙動を研究するための信頼性の高い方法を提供すること。
使用された方法
- PDMSを使用した引張力アッセイの製作。
- TGF-βへの反応における細胞の収縮性の測定。
- 複数のサンプルを評価するための高スループット分析。
- 上皮間質移行ダイナミクスの評価。
主要な結果
- 細胞の収縮性の変化の測定に成功しました。
- TGF-β依存性の収縮性の増加を実証しました。
- PDMSベースのアッセイの有用性を検証しました。
- 細胞移行プロセスのメカニズムへの洞察を提供しました。
結論
- PDMS引張力アッセイは細胞の収縮性を研究するのに効果的です。
- 上皮間質移行中の収縮性の増加が確認されました。
- この方法はさまざまな生物学的およびバイオメディカル研究に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This high-throughput traction force microscopy platform enables quantitative assessment of cellular contractility in a scalable format, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By linking TGF-β-induced epithelial-to-mesenchymal transition to measurable biophysical changes, the method provides predictive value for target validation in fibrosis and metastasis research. The PDMS-based system offers reproducibility and compatibility with existing multi-well workflows, enhancing enterprise reuse across discovery biology and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TGF-β as a modulator of cellular contractility during EMT, supporting target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides dose-dependent and time-resolved contractility data to prioritize mechanistic targets in fibrosis and cancer pathways.
- Predictive Value: Quantifies biophysical phenotypes linked to EMT, aiding in preclinical target selection and pathway de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, substrate-independent contractility measurements for assay standardization in mechanobiology screening.
- Operational Value: Compatible with 96-well formats, enabling parallel screening of compound libraries or cytokine doses.
- Assay Readiness: Uses stable, inert PDMS substrates with tunable modulus (0.4–100 kPa) and indefinite shelf life, reducing batch variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links TGF-β dose and duration to contractile output, supporting biomarker-aligned preclinical models of EMT.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of contractility changes as a functional readout in disease-relevant systems prior to in vivo validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating molecular intervention with biophysical phenotype modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing biophysical readouts that inform early-phase decision-making.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of TGF-β signaling effects on cellular mechanics and contractility.
- Screening: Enables high-throughput, reproducible quantification of traction forces across multi-well formats for dose-response analysis.
- Analytics: Generates contractility metrics (force magnitude, distribution) that allow comparison of TGF-β concentrations and exposure times.
- Translational Research: Connects in vitro EMT induction to measurable biomechanical changes, supporting preclinical model relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable traction force platform applicable across cell types and mechanobiology targets in oncology and fibrosis.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized PDMS substrates and multi-well compatibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling parallel condition testing and reducing reagent consumption per data point.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative contractility shifts during pathogenic transitions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, TFM image analysis, and PDMS substrate preparation.
- Depends on rheometry for substrate characterization and fluorescence microscopy for traction force quantification.
- Necessitates standardization of seeding density, substrate functionalization, and imaging conditions across wells.
- Adaptation to different cell types may require optimization of substrate stiffness and adhesion ligands.
- Practical limitations include substrate thickness uniformity and potential autofluorescence of PDMS at certain wavelengths.
