Name: 別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: 学ぶ 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた茎頂分裂組織のライブイメージング法。アラビドプシス、トマト、ダイズなど多様な植物種の細胞構造を高解像度で可視化し、固定や切片を不要とする効率的なプロトコルです。

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レーザー走査型共焦点顕微鏡へのアクセス、テクニカル サポート、著者はパーデュー大学 Bindley サイエンス センター イメージング施設を認めるし、著者アンディ シャバー パーデュー Bindley イメージング施設からの助けに感謝します。この活動は、インディアナ州の農業と農村開発をサポートするための資金調達 AgSEED 交差点の一部としてパデュー大学によって賄われていた。

1. メディアとイメージングの料理準備
<ol><li>MS 板: 脱イオン水に 0.5 倍培地・培 MS の中 1% 寒天を追加し、水酸化カリウム溶液を用いた 5.8 に pH を調整 (オプション: 長期的な植物成長のための 1% ショ糖を追加)。オートクレーブと注ぐプレート。</li>
	<li>料理をイメージング: 0.5 0.8 にプラスチック シャーレ (幅 6 cm、深さ 1.5 cm) を埋める 1.5% 溶融 agarose の cm。</li>
</ol>2. 植物の成長
<ol><li>
シロイヌナズナ成長<ol>
<li>MS プレート滅菌の種をまくし、2 日間プレート 4 ° C 以下を配置します。その後、MS プレートを短い日に移動 (8 h 光/暗い 16 h)、2 週間 22 ° C で。</li>
		<li>土に苗を移植し、短い日のそれらを育てる (8 h 光/暗い 16 h) 22 ° c 4 週間。</li>
		<li>植物を生長から生殖生長へと花房 SAMs のイメージングのための移行を誘導するための 22 の ° c の連続光に転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>トマトと大豆の成長<ol>
<li>湿式ろ紙 28 ° C 以下で覆われて彼らは発芽するまで種子を孵化させなさい。</li>
		<li>土に苗を移植し、長い一日のそれらを育てる (16 h 光/暗い 8 h) 生長の Sam をイメージングのため 1 週間以上 25 ° c。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 茎頂の郭清
<ol><li>花房茎頂の解剖<ol>
<li>一緒にかみそりの刃とボルトのシロイヌナズナ植物から 1-2 cm の主茎花房茎頂をカットします。主茎の根元部分を押しながらジュエリー鉗子で花柄を解剖によって主茎からできるだけ多くの古い花器を削除します。 注意: は、かみそりの刃を使用するときに、切断指を避けます。適切なシャープのコンテナーに使用されているかみそりの刃の処分します。</li>
		<li>ジュエリー鉗子や個人差のフィールドで指で茎頂の添付の幹を保持、接眼レンズからほぼ全体のサムを表示できるまで花の残りの部分の削除を続行します。主茎の接合部で明らかに花柄を削除します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>植物の茎頂の解剖<ol>
<li>トマトや大豆から栄養の Sam を表示するのには、子葉を分析、葉し、根の植物から。</li>
		<li>顕微鏡の下で植物の胚軸を押し、ジュエリー鉗子を使用して植物の Sam を覆う葉原基をさらに分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 染色
<ol><li>Sam のセルを直接視覚化するには、細胞壁を染色するのに作りたて propidium ヨウ (PI) を使用します。滅菌、脱イオン水で PI 粉溶解する、1 Mg/ml の濃度で 1 mL PI 染色液を作成し、アルミ箔で覆われている微量遠心チューブに PI ソリューションを格納します。</li>
	<li>ピペットのきれいな 50 μ L PI ソリューションと空のシャーレと全体の解剖のディップを撃つアペックス 2 分リンスの染料に滅菌、脱イオン水で 2 回ステンド グラスの茎頂。染色の過程では、均一な染色を実現する PI ソリューションに全体花序 SAM または栄養サムを浸します。</li>
</ol>5. 画像コレクション
注: このメソッドは、すべての Sam が直立した共焦点の顕微鏡を使用してイメージを作成と 20 倍レンズの水浸漬します。他プロトコル9,12,13,15に記載、また倒立顕微鏡を使用して Sam をイメージすることは不可能です。さらに、ライブ イメージングは、同じサンプル準備のステップと共焦点顕微鏡等のさまざまなブランドを使用して実現できます。本研究では画像処理の手順を例として詳しく説明します。
<ol><li>鉗子を用いたイメージングの皿の中央に穴を開けるし、中でステンド グラスの茎頂を直立スティックします。</li>
	<li>サンプルを完全に没頭する滅菌、脱イオン水でイメージングの皿を満たし。ステレオ顕微鏡から表示、ピペット、上下原基周りに閉じ込められた空気の泡を削除します。その後、SAM が真上から完全に表示されているかどうかを確認する寒天の幹の角度を調整します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡の試料ステージ上画像の皿を配置します。水浸漬レンズを下げ、水の中にディップをレンズの先端を聞かせ顕微鏡試料ステージを上げます。</li>
	<li>共焦点顕微鏡のソフトウェアを開き、接眼レンズで明視野で SAM を探します。サム サンプル右 XY コント ローラーを調整することで対物レンズの下に移動し、Z コント ローラーを慎重に調整することを通して接眼レンズからサムに焦点を当てます。</li>
	<li>共焦点顕微鏡のソフトウェアの取得機能の操作 (材料の表を参照)、開始、ライブ モードコンピューターの画面からサンプルを表示し、レーザースキャニング実験のすべてのパラメーターを設定します。<ol>
<li>パラメーターを調整するときは、か信号が飽和状態かどうかを定義するのに範囲インジケーター機能を使用します。</li>
		<li>必要に応じて、選択した共焦点ファイルからすべてのパラメーター設定をリロードする再利用関数を適用します。 注: パラメーターをイメージングを提案した: レーザー ライン (励起): 515 nm または 561 nm;排出量 570 650 nm;ピンホール: 1 風通しの良い単位 (AU);ゲイン: 600-750、スキャン モード: フレーム;フレーム サイズ: 512 × 512 または 1024 X 1024;スキャン速度: 最大; 7 時から走査方向: 双方向;平均数: 2-4;平均法: 意味;ビット深度: 16 ビットスキャンの間隔: 0.5-1 μ M。さらに、異なる植物のサンプル、特定のイメージング ニーズの性質に基づいてすべてのこれらのパラメーターを最適化します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 画像処理
<ol><li>光直交と横方向の断面を可視化画像の獲得のため同じ商用ソフトウェアを使用します。元共焦点ファイルを開く、[オルソビュー] メニューをクリックして、オルソを選択します。選択いずれかの x 位置、y 位置、z、画像の位置、画像を tiff ファイルとして保存します。<ol>
<li>共焦点画像のスタックから選択されている 2 つの点の間の物理的な距離を定義する3D 距離関数を必要に応じて選択します。</li>
		<li>また、フィジー/画像 J、直交と横方向の断面を可視化するオープン リソース イメージ処理パッケージを使用します。</li>
		<li>フィジーで元共焦点ファイルを開き、イメージ メニューをクリックして、スタックを選択し、直交ビューを選択します。</li>
		<li>中間位置でXY、YZ、およびXZ平面を選択し、Tiff 形式の画像として保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 D の透明な投影を可視化、同じソフトウェアを使用します。<ol>
<li>元共焦点ファイルを開き3 D メニューをクリックして透明3 D 投影ビューを生成」を選択します。</li>
		<li>必要に応じて3 D のメニューをクリックして、外観を選択し、透明度3 D の透明度のしきい値やランプ、最大を含む投影法の 3 つのパラメーターを調整するを選択イメージ。</li>
		<li>3 D のメニューをクリックし、外観、 3 D 画像の明るさを調整する光を選択します。</li>
		<li>投影画像をエクスポートし、Tiff ファイルとして保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 D の最大強度投影を可視化、同じソフトウェアで共焦点ファイルを開くし、 3 D のメニューをクリックします。<ol>
<li>3 D のメニューを選択し、最大を選択します。</li>
		<li>また、フィジー/画像 J を使用して、3 D の最大強度投影を視覚化します。</li>
		<li>フィジーと元の共焦点ファイルを開く、 [イメージ] メニューをクリックし、スタックを選択します。</li>
		<li>3 D プロジェクトを選択し、Tiff 形式の画像として保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 D 映像の表示をコーディング深さを可視化、同じソフトウェアを使用します。<ol>
<li>3 D のメニューをクリックし、外観を選択します。</li>
		<li>特別なし深さ符号化を選択します。</li>
		<li>また、フィジー/画像 J を使用して、ビューをコーディング深さを視覚化します。</li>
		<li>共焦点のファイルを開けて、イメージ メニューをクリックして、 Hyperstackを選択します。</li>
		<li>時間色コードを選択し、Tiff 形式の画像として保存します。 注: 深さ符号化 z スタックすることができますを介して実現するプラグイン フィジーのZ コードのスタック。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 D を可視化すると示されている (映画 1 映画 2)、回転ビューは、同じソフトウェアを使用 (材料の表を参照してください)。<ol>
<li>共焦点ファイルを開き、 3 D メニューをクリックして、系列を選択します。</li>
		<li>シリーズのレンダリングをを選択し、 x、 y を好転開始と終了、切り、位置リストを含む 4 つのオプションのいずれかを選択します。</li>
		<li>レンダリング シリーズを AVI ファイルとして保存します。</li>
		<li>また、フィジー/画像 J を使用して、3 D 回転ビューを視覚化します。</li>
		<li>フィジーと元の共焦点ファイルを開く、 [イメージ] メニューをクリックし、スタックを選択します。</li>
		<li>3 D プロジェクトを選択し、AVI 形式の動画として保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+cell+division+patterns+in+developing+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of cell division patterns in developing plants.</a> Cell. 88 (3), 299-308 (1997).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+arabinosyltransferases+controls+shoot+meristem+size+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato.</a> Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).</li>
<li>Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variation+in+maize+kernel+row+number+is+controlled+by+the+FASCIATED+EAR2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus.</a> Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).</li>
<li>Je, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+maize+organ+primordia+via+FASCIATED+EAR3+regulates+stem+cell+proliferation+and+yield+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits.</a> Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).</li>
<li>Ping, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dt2+is+a+gain-of-function+MADS-domain+factor+gene+that+specifies+semideterminacy+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean.</a> Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).</li>
<li>Vaughan, J. G., Jones, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+angiosperm+inflorescence+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the angiosperm inflorescence apex.</a> Nature. 171, 751(1953).</li>
<li>Sijacic, P., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+from+live-imaging+in+shoot+meristem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel insights from live-imaging in shoot meristem development.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).</li>
<li>Tax, F. E., Durbak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristems+in+the+movies%3A+live+imaging+as+a+tool+for+decoding+intercellular+signaling+in+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems.</a> Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).</li>
<li>Grandjean, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+cell+division%2C+cell+growth%2C+and+differentiation+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).</li>
<li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).</li>
<li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+to+study+cell+division+orientation+in+the+Arabidopsis+shoot+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).</li>
<li>Prunet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+Imaging+of+developing+Arabidopsis+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).</li>
<li>Prunet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).</li>
<li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131, 4225-4237 (2004).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Shoot+Meristems+on+an+Inverted+Confocal+Microscope+Using+an+Objective+Lens+Inverter+Attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAIRY+MERISTEM+with+WUSCHEL+confines+CLAVATA3+expression+to+the+outer+apical+meristem+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers.</a> Science. 361 (6401), 502-506 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stem+cell+maintenance+by+transcriptional+cross-regulation+of+related+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases.</a> Development. 142 (6), 1043(2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEAFY+Controls+Auxin+Response+Pathways+in+Floral+Primordium+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation.</a> Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで、モデル植物の栄養生長と生殖段階で分裂組織規制の研究に新しい道を開くマイナーな変更と異なる植物から茎頂の研究に適用できる単純なイメージング法を説明し、作物。SEM と組織学的染色法と対照をなしてこのプロトコルはサーフェス ビューと労働集約的なサンプルの固定および/または組織の断面の手順を必要とせず、Sam の内部細胞構造を明らかに助けることができます。このプロトコルは潜在的サム16 の主要遺伝子そして蛋白質の発現パターンの 3 D ビューを取得することができます良い携帯電話の解像度を提供する SAMs に基づく蛍光レポーターのイメージング手法を確立する互換性のあるも ,17,18,19。さらに、ここで説明されている手順を処理関連のイメージは大幅進化発生生物学の研究と農業技術研究を進め、3 D での異なる種からサムスを比較分析の研究者を助けることができるになります。
<p...

植物の分裂組織は未分化の幹細胞のプールが含まれています、植物器官の成長と開発1を継続的に支えます。蛹の開発中に植物のほぼすべての地上組織は、シュート頂端分裂組織 (SAM) から派生します。作物は、活動と SAM とその派生の花分裂のサイズは撮影アーキテクチャ、フルーツの生産および子実収量など多くの農業形質にしっかりと関連付けられます。たとえば、トマト、拡大のサムは、撮影と花房の分岐の増加そしてこうして、余分な花とフルーツの臓器2生成結果。トウモロコシ、SAM のサイズの増加は、高い種子数と収量3,4に します。大豆、分裂組織不確定性は撮影アーキテクチャと密接に関連しています、5をもたらします。
どちらが大きく分裂組織研究を提供し、高度な組織切片染色走査電子顕微鏡 (SEM)6など、いくつかの異なる方法によって特徴付けられる形態と Sam の解剖学断面図または Sam の三次元 (3 D) サーフェイス ビュー。ただし、どちらの方法も時間がかかり、データ集録サンプル準備からいくつかの実験手順を含む、これらのメソッドは、主に固定サンプルに依存します。レーザー走査型共焦点顕微鏡法の最近の進歩は、これらの制限を克服しているし、細胞構造と植物組織や臓器の7,のための8の発達過程を調査するための強力なツールを提供してくれる。物理的な組織ではなく光学セクショニング、共焦点顕微鏡により一連の z スタック画像やサンプル画像解析ソフトウェアの後続の 3次元再構成のコレクション。
ここでは、両方の内部を調査するための効率的な手順について述べるし、異なる生活 SAMs の表面構造解析植物種の共焦点レーザー顕微鏡、可能性のあるすべての実験的達成するために研究者を可能にするを使用してプロセス内で最短で 20 分。ライブの共焦点イメージングシロイヌナズナ花房 Sam9,10、11,12,13,14のための他の公開メソッドとは異なる 15とシロイヌナズナの花12,13、ここでこのプロトコルがモデル動物だけでなく植物のシュートの花房分裂だけでなく勉強のため高効率であることを示すトマトや大豆など、さまざまな作物から頂。このメソッドは、トランスジェニック蛍光マーカーに依存しないし、可能性のある多くの異なる種や品種から撮影分裂の研究に適用できます。さらに、簡易画像処理表示および 3 D ビューで異なる Sam を分析するための手順を紹介します。一緒に取られて、この単純な方法は構造とモデル生物や作物から分裂の発達過程の理解を深める研究を促進します。

<table><tbody><tr><td>寒天フィト</td><td>ドットサイエンティフィック株式会社</td><td>DSA20300-1000</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>・ドット・サイエンティフィック(株)</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4955</td><td>デュモン #5SF 超微細鉗子 イノックス 先端サイズ .025 X .005mm、解剖シュート用。</td></tr><tr><td>LSM 880 正立共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>村重 &Skoog MSミディアム</td><td>ドットサイエンティフィック社</td><td>DSM10200-50</td><td></td></tr><tr><td>プラン APO 20x/1.1 水浸漬レンズ</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチックペトリ皿 100 mm X 15 mm</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229694</td><td>MSプレートの製造として使用</td></tr><tr><td>プラスチックペトリ皿60 mm X 15</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>229665</td><td>イメージング皿として使用</td></tr><tr><td>伝播ミックス</td><td>スングロ園芸</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Acros Organics</td><td>440300250</td><td>1 mg/mL 溶液を水に溶かし、細胞壁を染色</td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>PERSONNA</td><td>62-0179</td><td>植物からシュート頂点を切断するため</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>組織</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Zen black</td><td>Zeiss</td><td></td><td>画像取得ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

別の植物種から茎頂の共焦点のライブ イメージング

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

保存された茎細胞の貯蔵所としてシュート頂端分裂組織 (SAM) 関数は、蛹の開発中にほぼすべての地上組織を生成します。活動と Sam の形態撮影アーキテクチャ、サイズおよび生殖器官と最も重要なことは, 子実収量の数などの重要な農業形質を決定します。ここでは、レーザー共焦点顕微鏡による表面の形態との異なる種から生きている Sam の内部細胞構造を分析するための詳しいプロトコルを提供します。内で高解像度三次元 (3 D) 画像の取得にサンプル準備から全体の手順を行うことができます最短で 20 分。このプロトコルが花房 Sam モデル種も異なる作物から植物の分裂組織との開発を検討するシンプルかつ強力なツールを提供するだけではなく勉強のため高効率であることを示す別の植物種に分裂。

シロイヌナズナから花序メリステムから植物の分裂で共焦点のライブ イメージング実験を行ったとプロトコルの効率を評価し、種から、分裂の形態を探るトマトと大豆の両方。本研究で、シロイヌナズナ生態ランツベルクエレクター、トマト品種マイクロトム ダイズ品種ウィリアムズ 82 は例として使用されています。
シロイヌナズナサムの真ん中を通る直交断面から見ると、それは明らかに PI は (図 1 a) 複数の細胞層でのほぼすべてのセルの水平方向の壁を染色することができます。 花房サムのコーパスを 2 つの横のセクションから示すように、XY 平面からの細胞はまた明確にイメージ (図 1 b)。3 D 投影ビューで花序メリステム ドーム状構造を形成し、発展途上の花原基細胞も染色し、イ...

このプロトコルは、live イメージをおよび共焦点レーザー顕微鏡を使用して別の植物種から茎頂を分析する方法を示します。

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

ピカルメリステムコントロール植物の成長と再生を撃つ。この方法は、モデル種だけでなく、異なる作物においても、射成頭突起メリステムの形態と内部構造を調査するのに役立ちます。この手法は非常に効率的な手順です。シュートアピカルメリステムは、労働集約的なサンプル固定および組織断面のステップなしで、高い細胞分解能で直接視覚化することができます。まず、テキストプロトコルで詳述されているように、シロイヌナズナ、トマト、大豆の植物を栽培します。ボルトで締まったシロイヌナズナの植物から花序を撃つ頂点をカットします。主茎の基底部分を保持し、メインステムからできるだけ多くの古い花の臓器を除去するために鉗子を使用します。撮影の頭柱メリステムが接眼点から見えるまで、ステレオ顕微鏡のフィールドで残りの花を取り除き続けます。トマトまたは大豆のいずれかから栄養芽の樹状メリステムを見るには、植物からコチルドン、葉、根を解剖します。植物の低酸素をステレオ顕微鏡で保持し、鉗子を使用して、栄養シュートのアピカルメリステムを覆う葉と葉の原始子をさらに解剖します。ピペット50マイクロリットルのプロピジウムヨウ化液を清潔で空のペトリ皿に入れます。解剖したシュートの頂点全体を染料に2分間浸します。染色プロセス中に、花序の芽生全体を浸漬する有端メリステムまたは栄養シュートのピオシド溶液にピオシド溶液を浸し、均一な染色を達成する。染色されたシュートの頂点を滅菌、脱イオン水で2回リンスします。今、鉗子を使用して準備された画像皿の中心に穴を開け、汚れたシュートの頂点を媒体に直立に貼り付けます。イメージング皿に無菌の脱イオン水を充填し、サンプルを完全に浸漬します。検体顕微鏡を通してサンプルを見る。メリステムの周りに閉じ込められた気泡を取り除くために上下のピペット。次に、寒天の茎の角度を調整して、真上から完全に見えるようにします。次に、共焦点顕微鏡のサンプルステージにイメージング皿を置きます。水浸漬レンズを下げ、顕微鏡サンプルステージを上げてレンズの先端を水中に浸します。共焦点顕微鏡ソフトウェアを開き、接眼レンズを使用して、明るい分野でのシュートのアペリカルメリステムを見つけて集中させます。共焦点顕微鏡ソフトウェアで取得機能を操作します。ライブモードを起動して、コンピュータ画面からサンプルを表示し、レーザースキャン実験のすべてのパラメータを設定します。パラメータを調整する場合は、レンジインジケータ関数を使用して、信号が飽和しているかどうかを定義します。撮像に使用したのと同じソフトウェアを、3次元の透明投影図を可視化するために使用できます。元のコンフォーカル ファイルを開き、[3D]メニューをクリックし、[透明]を選択して 3D 投影ビューを生成します。必要に応じて、[透過性]を選択して、3D 画像の透明度に対して[しきい値]、[ランプ]、[最大値]など、投影の 3 つのパラメータを調整します。次に、[ライト]を選択して、3D 画像の明るさを調整します。投影されたイメージをエクスポートし、TIFF ファイルとして保存します。3D 画像の深度コーディングビューを視覚化するには、同じソフトウェアを使用します。もう一度、[3D]メニューをクリックし、[外観]を選択します。[特殊] を選択し、[深度コーディング] を選択します。投影されたイメージをエクスポートし、TIFF ファイルとして保存します。この画像は、シロイヌナズナの中間部を通って、複数の細胞層のほぼすべての細胞にヨウ化プロピジウムで水平壁が染色されていることを示しています。花序の脳を通る1つの横断断面のビューは、XY平面からの細胞も明確に画像化されていることを示している。3D投影ビューは、花序メリステムがドーム状の構造を形成し、現像花のプリモリアに囲まれていることを明らかにします。このトマトシュートの中間部からピオヒレメリステムの中間までのこの画像は、深い内部領域からのヨウ化プロピジウム信号がわずかに低いが、複数の細胞層でヨウ化プロピジウムで水平壁が染色されていることを示している。1つの横断セクションから栄養芽球の精液柱の深い層を通る画像は、XY平面からの細胞と栄養メリステムと葉プリモリアの間に形成された境界を明らかにする。3D投影ビューは、トマトからの栄養性メリステムの形状と組織の包括的なビューを提供することができます。ここに示されているのは、大豆シュートの真ん中を通る直交図と、同じシュートのアペリカルメリステムの3D投影です。ドーム状の栄養性メリステムとその派生した新しい葉のプリモディアも観察可能です。ヨウ化プロピジウムは損傷または死んだ細胞を容易に染色することができ、画像の品質に大きな影響を与えるため、ピオメリステムサンプルを撮影する間に物理的な損傷を避ける必要があります。

confocal-live-imaging-shoot-apical-meristems-from-different-plant

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、気孔の分化を文書化、開発の数日間にわたって表皮の共焦点イメージングのための植物の子葉を固定化するためにチャンバースライドやメディアを使用してプロトコルを記述します。フルオロフォアタグ付きタンパク質は、細胞分裂や細胞型分化の過程でそれらの可能な役割の理解を深め、表現と細胞内局在によって動的に追跡することができます。...

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

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共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

ここに提示されているのは、高開口数の対物レンズと浸漬媒体としてのパーフルオロデカリンを使用して、最長3日間の根および胚軸発達の高解像度共焦点経時撮影イメージングのための簡単な技術である。...

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

拡張期間にわたってシロイヌナズナ葉の蛍光ライブ...

シロイヌナズナの取付汎用性の高い方法は、生体のタイムラプス イメージングの葉します。

ここでは、我々 は生成を記述して形質転換シロイヌナズナのセットのアプリケーション線 3...

誘導、細胞型における発現シロイヌナズナLhGR を介したトランス-活性化

ここでは、細胞内の細胞骨格を撮影する上皮状の微小管細胞骨格を生細胞イメージングするためのプロトコルを説明し、物理的な力の変化に対する応答を監視する。...

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作

本論文は、生きたコケ組織の3次元細胞壁動態を画像化するための詳細なプロトコルを提示し、長期間にわたる発生中の野生型における ggb...

コケ物理層におけるカルコフルーアを用いた細胞壁動態の3次元タイムラプスイメージング

トウモロコシの葉の原基は深く覆われて転がされているため、研究が困難です。ここでは、蛍光および共焦点イメージングのために、トウモロコシの葉の原基の横断切片と展開されたマウント全体を準備するための方法を紹介します。...

蛍光および共焦点イメージングのためのトウモロコシ葉原基の横断切片および展開されたマウント全体を調製するための改善された方法

減数分裂前期の染色体移動は、胞子形成の基本であるあまり理解されていない現象です。このプロトコルは、 シロイヌナズナ の男性減数分裂前期におけるセントロメアの動きを取得、分析、および定量化する方法を説明しています。...

シロイヌナズナにおける男性減数分裂前期中のセントロメア運動のライブイメージング特性評価

このプロセスは、シ ロイナ ナの蛍光標識核およびクロマチンマーカーラインと共焦点顕微鏡を用いて、シロイ ナナ...

シロイナ根における発生および環境ストレスにおける核形状とクロマチン動態の定量的ライブセルイメージング

学ぶ 共焦点レーザー走査顕微鏡を用いた茎頂分裂組織のライブイメージング法。アラビドプシス、トマト、ダイズなど多様な植物種の細胞構造を高解像度で可視化し、固定や切片を不要とする効率的なプロトコルです。

別の植物種から茎頂の共焦点のライブイメージング

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