ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

第3世代ナノポアシーケンシングは、多種多様なサンプルから配列情報を非常に簡単に取得できる強力な斬新なシーケンシング技術です。この手法の主な利点は、シーケンスデバイスの移植性、非常に長い読み取り長さ、およびデータのリアルタイム可用性です。ナノポアシーケンシングは、遠隔地での病気の発生時に特に有用な技術です。

これは、西アフリカと中央アフリカでエボラウイルスの流行の間および後にフィールドラボで正常に使用されています.ナノスポアシーケンシングを介して、この目的のためのMinIONデバイスの使用はかなり簡単です, ライブラリの準備中とフローセルのロード中に注意する必要があります.この手順を開始するには、1マイクロリットルテンプレートで50マイクロリットル反応量の適切な反応バッファーを持つホットスタート高忠実度DNAポリメラーゼを使用してプライマーセット1でcDNAを増幅するタッチダウンPCRを設定します。

可能であれば、氷の上または4°Cの涼しいブロックに反応を設定します。テキストプロトコルに概説されているように、熱サイクラーで反応をインキュベートします。この後、50マイクロリットルのPCR産物を1.5ミリリットルの低結合反応チューブに移します。

磁性ビーズを渦を完全に再懸濁します。その後、50マイクロリットルのビーズをPCR反応に加え、よく混ぜます。15 RPMで回転しながら、室温で5分間回転ミキサーでサンプルをインキュベートします。

サンプルを簡単に回転させ、チューブを磁気ラックに置いて磁気ビーズをペレットします。上清が完全に明らかになるまで待ってから続行してください。次に、上清をビーズペレットを邪魔することなく吸引し、廃棄する。

70%エタノールのピペット200マイクロリットルを反応管に入れ、室温で30秒間インキュベートする。ビーズペレットを乱さずにエタノールを吸引し、廃棄する。この洗浄プロセスをエタノールでもう一度繰り返し、合計2回の洗浄を行います。

ペレットを室温で1分間空気乾燥します。次に、磁気ラックから反応管を取り外します。30マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水でペレットを再懸濁し、室温で2分間インキュベートします。

反応管を磁気ラックに戻し、反応ビーズが完全にペレットになるまで待ちます。この後、ペレットを乱さずに上清を取り除き、新しい1.5ミリリットル反応チューブに移します。複数のサンプルを同時に配列する場合、バーコードを追加するには、前に示したように、2 つの PCR ステップを追加し、続いて DNA クリーンアップを行うことができます。

まず、各サンプルから同量のバーコードDNAを組み合わせて、0.2ミリリットルの反応チューブ内の45マイクロリットルの体積で合計1マイクログラムのDNAを組み合わせます。dA-Tailingの場合は、エンドプレップ反応バッファーの7マイクロリットル、エンドプレップ酵素ミックスの3マイクロリットル、ヌクレアーゼフリー水5マイクロリットルを加えます。チューブを軽くフリックして混ぜます。

サーモサイクラーでは、摂氏20度で5分間、摂氏65度で5分間インキュベートします。次に、テキストプロトコルで概説した反応生成物のPCR精製を行う。必要に応じて、UV分光光度計を使用してサンプルの濃度を定量化するために1マイクロリットルを取る。

新しい1.5ミリリットルDNA低結合反応チューブに、2.5マイクロリットルの1D2アダプターと25マイクロリットルのBlunt/TAリガーゼマスターミックスを使用して、精製されたDNAの22.5マイクロリットルを組み合わせます。チューブを軽くフリックして混ぜます。混合物を短時間回転させ、室温で10分間インキュベートします。

次に、テキストプロトコルに概説した反応生成物のPCR精製を行う。45マイクロリットルのバーコードアダプターミックスと50マイクロリットルのブラント/TAリガーゼマスターミックスをDNA低結合反応チューブに組み合わせます。軽くフリックして混ぜ、室温で10分間インキュベートします。

テキストプロトコルに記載されている反応生成物を精製し、使用する準備ができるまで氷の上または摂氏4度で得られた製品を保存します。まず、使用する前にフローセルの品質チェックを実行します。この処理を行うために、シーケンス デバイスをホスト コンピュータに接続し、ソフトウェアを開きます。

シーケンスデバイスにフローセルを挿入します。次に、セレクタボックスからフローセルタイプを選択し、確認のためにクリックします。画面下部の [フロー セルのチェック] をクリックし、適切なフロー セルの種類を選択します。

[テスト開始] をクリックして、品質チェックを開始します。フローセルを使用するには、合計で最低800個の活性ナノポアが必要です。まず、プライミングポートカバーを時計回りにスライドさせて開きます。

P1000ピペットを200マイクロリットルにセットし、プライミングポートにチップを挿入します。次に、プライミングポートの先端を保ちながらピペットを230マイクロリットルに調整し、20~30マイクロリットルのバッファーを引き上げ、気泡を取り除きます。新しい1.5ミリリットルのDNA低結合反応チューブで、RBFバッファーの576マイクロリットルとヌクレアーゼフリー水624マイクロリットルを組み合わせてプライミングミックスを調製します。

慎重に準備されたプライミングミックスのピペット800マイクロリットルをプライミングポートに入れ、5分間待ちます。この後、サンプルポートカバーを持ち上げ、準備されたプライミングミックスの追加200マイクロリットルをプライミングポートに取り入れ、ピペットを取り出します。新しいクリーンな1.5ミリリットルDNA低結合反応チューブにRBFバッファーのピペット35マイクロリットル。

ピペットでLLBビーズを十分に混合し、25.5マイクロリットルのビーズをRBFバッファーに加えます。次に、ヌクレアーゼフリー水2.5マイクロリットルと12マイクロリットルのDNAライブラリーを加え、ピペットで混合します。サンプルポートを介してフローセルに遅い低下の賢明な方法でサンプル混合物の75マイクロリットルを加えます。

次に、サンプルポートカバーを交換し、プライミングポートを閉じ、シーケンシングデバイスの蓋を閉じます。ソフトウェア内で、フローセルがまだ使用可能であることを確認します。新しい実験を開き、使用するキットを選択して実行パラメーターを設定します。

ライブベース呼び出しを選択します。[実験の開始] をクリックして、シーケンス実行を開始します。十分な実験データが収集されるまで、シーケンス実行を続けます。

代表的な実験では、RNAは5種の動物から10種類の血液サンプルから抽出される。RNA濃度は、マイクロリットル当たり43ナノグラムから543ナノグラムの間で観察される。RT-PCR による増幅後、MPC1 PCR 産物のゲル分析は、サンプル BC01 および BC02 のバンドが著しく弱いさまざまな結果を示します。

これらの違いは、異なる種のMCP1遺伝子に対するプライマー結合の違いによるPCR有効性の違いを排除することができないが、サンプル品質の違いによって引き起こされる可能性が最も高い。ただし、これらの歩留まりや増幅効率の違いは、全体的なシーケンスの結果に著しく影響を与えるわけではありません。次に、取得した 10,000 のサブセットが選択され、さらに分析のためにデマルチプレクスされます。

分析した10,000読み取りのうち、5,457は、ワークフローの一部として増幅されたPCR断片の予想サイズに一致する1,750,2,000ヌクレオチドの長さを示す。読み取りの長さの分布の追加のピークは、非特異的PCR産物に起因することができる250〜500ヌクレオチドの間で観察される。読み取りのデマルチプレクシングにより、分析された 10 個のサンプルのいずれかに読み取り値の 87.6% を割り当てできます。

この方法は非常に信頼性が高いですが、フィールド条件下では、PCR増幅が最も問題のあるステップです。私たちの経験の間、ネストされたプロトコルは、多くの場合、ターゲットシーケンスを増幅するために必要でした。動物宿主遺伝子のシーケンシングに加えて、この方法は、ウイルスまたは細菌病原体を含む任意のDNAまたはRNAを配列するためにも使用することができる。

したがって、ナノポアシーケンシングは、病気の発生時や遠隔地での科学的研究だけでなく、長い読み取り長さがエキサイティングな新しい研究の可能性を開く通常の研究室でもますます使用されています。使用された試薬のどれも特に危険ではありませんが、標準的な良い実験室の慣行に従うべきです。明らかに、シーケンシング疾患剤の場合、これらの薬剤を取り扱うための必要な予防措置はすべて守られなければならない。