Name: 皿に血液脳腫瘍-障壁を使用して生体ペイロード配信で予測 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: 学ぶ血液脳腫瘍障壁のin vitroモデル構築法。マウスおよびヒト由来の細胞を用いて、中枢神経系腫瘍への薬物標的化の予測性を向上させる再現性の高い薬物スクリーニングシステムを確立します。

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この研究は、フィンランドの癌組織、ジェーン ・ Aatos Erkko 財団と (パ V.L.J. し) ねんどろいど Juselius 財団、スイスの全米科学財団からの助成金によって支えられた (高度な Postdoc.Mobility 付与なし: P300PB_164732 sK.)、(s. k.) にオリオン研究財団、(に s. k.)、Maud Kuistila 記念財団、フィンランド アカデミー (TERVA、2017 年を付与なし: 314 498)。Biomedicum イメージング ユニット (ヘルシンキ) は、中核施設をイメージング顕微鏡を提供するために認められています。

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<li>Wang, J. D., Khafagy, el-S., Khanafer, K., Takayama, S., ElSayed, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+Endothelial+Cells%2C+Pericytes%2C+and+Astrocytes+into+a+3D+Microfluidic+in+Vitro+Model+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Organization of Endothelial Cells, Pericytes, and Astrocytes into a 3D Microfluidic in Vitro Model of the Blood-Brain Barrier.</a> Molecular Pharmaceutics. 13 (3), 895-906 (2016).</li>
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<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li>
<li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells%2C+astrocytes%2C+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li>
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<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+and+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability.</a> Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).</li>
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<li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF%2FVEGFR2+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120 (9), 1414-1425 (2017).</li>
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<li>Adriani, G., Ma, D., Pavesi, A., Goh, E. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+Blood-Brain+Barrier+in+a+3D+triple+co-culture+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+Proceedings+-+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Modeling the Blood-Brain Barrier in a 3D triple co-culture microfluidic system.</a> Conference Proceedings - IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 338-341 (2015).</li>
<li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hCMEC%2FD3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 10 (1), 16(2013).</li>
<li>Paatero, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyses+in+zebrafish+embryos+reveal+that+nanotoxicity+profiles+are+dependent+on+surface-functionalization+controlled+penetrance+of+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analyses in zebrafish embryos reveal that nanotoxicity profiles are dependent on surface-functionalization controlled penetrance of biological membranes.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8423(2017).</li>
<li>Prabhakar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+hybrid+nanocarriers+developed+by+controllable+integration+of+hyperbranched+PEI+with+mesoporous+silica+nanoparticles+for+sustained+intracellular+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive hybrid nanocarriers developed by controllable integration of hyperbranched PEI with mesoporous silica nanoparticles for sustained intracellular siRNA delivery.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 6591-6608 (2016).</li>
<li>Hyvonen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+target+for+peptide-based+imaging+and+treatment+of+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Novel target for peptide-based imaging and treatment of brain tumors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 13 (4), 996-1007 (2014).</li>
<li>Feng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary-Derived+Growth+Inhibitor+Targeting+Peptide-Modified+PEG-PLA+Nanoparticles+for+Enhanced+Targeted+Glioblastoma+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammary-Derived Growth Inhibitor Targeting Peptide-Modified PEG-PLA Nanoparticles for Enhanced Targeted Glioblastoma Therapy.</a> Bioconjugate Chemistry. 26 (8), 1850-1861 (2015).</li>
<li>Nance, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dense+poly%28ethylene+glycol%29+coating+improves+penetration+of+large+polymeric+nanoparticles+within+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A dense poly(ethylene glycol) coating improves penetration of large polymeric nanoparticles within brain tissue.</a> Science Translational Medicine. 4 (149), 149rA119(2012).</li>
<li>Berg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+nanoparticle+transport+through+in+vitro+blood-brain+barrier+models%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of nanoparticle transport through in vitro blood-brain barrier models.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1143545(2016).</li>
<li>Noumbissi, M. E., Galasso, B., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+vascular+heterogeneity%3A+implications+for+disease+pathogenesis+and+design+of+in+vitro+blood-brain+barrier+models%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Brain vascular heterogeneity: implications for disease pathogenesis and design of in vitro blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 12(2018).</li>
<li>Heymans, M., Sevin, E., Gosselet, F., Lundquist, S., Culot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+brain+tissue+binding+in+an+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+illustrates+differences+between+in+vitro+and+in+vivo+methods+for+assessing+the+rate+of+brain+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Mimicking brain tissue binding in an in vitro model of the blood-brain barrier illustrates differences between in vitro and in vivo methods for assessing the rate of brain penetration.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 127, 453-461 (2018).</li>
</ol>

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抗腫瘍の可変性の概念の台頭は、パーソナライズされたがん医学21の研究を活性化。この変動は、また中枢神経系腫瘍の特徴です。腫瘍の予測のため化学療法への応答はドラッグデリバリー、BBB の遮蔽を追加し、全体で患者のケアの22の主要な挑戦を構成します。効果的な治療法を開発するために、新しい分子の画面サイズの大きなライブラリする必要は多くの場合です。抗腫瘍効果と腫瘍の部位に到達するための新しい治療上の鉛の能力を評価するには、最良の選択肢は、患者アバターをマウス体内注入患者由来細胞の臨床研究です。実用的な (金融、時間、人間、および施設資源) や倫理的な理由 (3 r 原則実験動物を使用する場合)、このような大規模な in vivo スクリーニング プラットフォームの開発は頻繁にしない、可能なしたがって、細胞に基づく試金選択23のモデルのままです。選択の主な理由の確立し、再現性を容易にし、分離とマウス初代培養の確立のための主な源である実験動物の使用を減らすには一次電池を回避します。ここでは、提示方法は効率的に、さらに臨床調査からクリテリウムのクロス モデル BBTB 彼らの無力のナノ粒子を破棄できるのでしっかりと 3 r の遵守。証拠-の-原則として、我々 は開発と、BBTB の検証時に得られた知見をここでについて説明します。376 Da のフルオレセインの受動的拡散で測定を行う場合に例えばが生体内で生体外で調査結果を確認することができました。
本稿で説明したプロトコルでは、in vitro におけるセットアップの血液脳腫瘍の壁のようなインターフェイスを形成する内皮細胞の遊走とアストロ サイトの準備について説明します。これらの 2 つの細胞型との間の物理的な接触を確立すると、内皮細胞層は BBB (など、セル表面の式タイト結合タンパク質や比較的低透磁率) との類似点を展示します。興味深いことに、マウス BBTB 模倣体内マウス BBB 透過性測定24で特に類似 Na フロリダ透磁率の値を提供するように見えた。したがって、BBTB mimics のパフォーマンスはバリアを形成するために使用するセルの選択に直接リンクされます。BEND3 血管内皮細胞、脳で発生したアストロ サイト25遊走するときの障壁を形成で成功するために知られています。しかし、我々 は BBTB 模倣を生成するのに不死化 HIFko アストロ サイト26を使用しています。低酸素誘導因子の欠如に起因するこれらのアストロ サイトを生成しない、VEGF はここで説明 BBTB 模倣の安定化の典型的な。アストロ サイトは、neuroinflammation27レスポンスの VEGF-A のリリースを介して例えば、BBB 透過性の調節因子として同定されています。血管内皮細胞増殖因子受容体 (VEGFRs) の活性化は内皮/血管透過性体外28と29の体内の両方の重要な調節因子です。したがって、培地での VEGF のサプリメントは、VE カドヘリン30など単結合蛋白質のリン酸化を誘導する血管内皮細胞 VEGFR2 をアクティブにします。内皮細胞間の接触の損失は、浸透性の高い血管を生成します。同様に、強い幼若化プロパティと細胞培養の試金で使用される胎児の牛血清中の未知の組成の両方バリア安定化と測定の再現性に大きな問題が発生します。
ひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) は体外31; BBB を形成する使用されることしかし、彼らの異なる脳微小血管内皮細胞からよう hCMEC/D3 セル行32、遺伝子発現とバリア形成の面でのプロパティ。ただし、単独で成長した HuAR2T 細胞で得られた値が、bEND3 と比較して相対的に高い透磁率は、人間プライマリ アストロ サイトと取込みで大きく減った。細胞壁を形成する内皮細胞が必要ですが、アストロ サイトが BBTB 形成および安定化のためにプレー同様に重要な役割を持っていることは明らかです。
神経膠腫の患者由来の球は、この方程式に追加された、いくつかのマウス異種移植片、脳血管と腫瘍細胞標的薬物拡散などの機能マウス BBTB ミミックが締めくくっています。ここで説明 BBTB 模倣、例えばに成功した体内動作をミラーリングするときに異なる直径を持ついくつかのナノ粒子で仕切った。In vitro および in vivo モデル間の並列性を示すためには、細胞貫通プロパティ34上腫瘍標的化ペプチド小屋に共役前述メソポーラス ケイ酸塩粒子33を使用、surface20。乳腺由来成長阻害剤 (MDGI) への特定のバインディングを介して侵襲性の腫瘍細胞に小屋を対象としたペプチド家。神経膠腫を含む、いくつかのがんは、ペイロード20の配達を高めることができる非常に効率的な腫瘍を対象とした部位を小屋になります正常組織35と比較して MDGI を過剰発現します。ここで使用されるナノ粒子は以前 (27547955)、脳実質内に拡散させる示されているし、修飾とタキソールとき、これらのナノ貨物は前臨床モデル36の神経膠腫の成長を減らすことに成功しています。ポリエチレング リコール (PEG) ナノ粒子の表面残基の付加も正の値に、その静的な電荷を維持 (周り + 4 mV)、神経血管ユニット37との相互運用ができ、また彼らの安定性が向上循環。提示されたデータでペグの 3 kDa は NP350s が PEG の 10 kDa でコーティングした、NP110s に共役だった。しかし、増加-分子量ペグも結果になったナノ粒子の直径で、それゆえの大幅な増加、BBB を交差させる彼らの物理的な機能したがって、我々 は粒子の物理的な寸法が、BBTB の通過を防止するかどうか、かどうかこれらの観察がミラー化も体内をチェックしました。
以前に発行された観察に基づき体外 BBTB と NP350s BBTB ミミックとの血管の内腔側に保持しながらの頭蓋内腫瘍を有するマウスの BBB の両方を通じて NP110s がバリウムしたを見ました、マウス。これらの同じような結果は強く BBTB モデルが BBB を通過し、脳に到達するナノ粒子の生体内での機能を予測することをお勧めします。
BBB の携帯電話モデルの妥当性が頻繁に議論、ナノ粒子38の中央の配信のためにも。紹介、プライマリ アストログリア細胞や内皮細胞、両方が最も関連性の in vitro におけるツールとして考慮される取替えることができる不死化や市販のセルより高いスケーラビリティと再現性を確保します。構造的に実際の BBB12,14のように美しく形成された神経単位、マイクロ流体デバイスを組み込むことによって生体外での BBB mimics の次世代を開発できます。しかし、このようなモデルは現在配信配信14のフォロー アップの技術的な制限により、神経膠腫の分子の高スループット スクリーニングに適してではありません。確かに、皿に BBB の生理学的複雑さをキャプチャすることは困難だし、いくつかの受容体/、知られていた蛋白質、BBB によって表現することの可能性の欠如は、結果の解釈を妥協できます。別の引数にかかわる遺伝子発現特に内皮細胞を考慮して別に 1 つのセルの行からだけでなく、生体内および生体外での条件の間で大きな変動。ただし、単位が脳39内均一エンティティではないことに主張もことができます。生物学の科学的な研究は、動物福祉、倫理的な責任と動物たちの生活を使用してのコストは常に実験を設計する前に見なされ慈悲深い時代を達しています。したがって、動物の交換をサポートするための最近の研究の増加する数を示すモデルの制限事項と障壁を確立する細胞モデルの慎重な選択の意識-アストロ サイトに重点を置いて、保証、結果の間の一致の皿、動物モデル40。ここで説明した方法論とは、スクリーニングの潜在的な治療の BBB トランスサイトーシス目的に使用される実験動物の数を減らすことへの一歩を得る。

単位はニューロンとアストロ サイト、形成脳血管1関連する基底膜、血管内皮細胞、アストロ サイト ペリサイトの複雑な関係によって形成された BBB の構成。細かく連続、穴の血管によって形成されるこのタイトな細胞壁は、イオンと分子 (ホルモン、栄養素、薬物など) も循環セル1の動きを調節します。高分子量の分子、抗体医薬品、薬物の抱合体、nanocompounds などの BBB を特に低トランスサイトーシス大幅に制限されて、悪性を含む神経疾患の創薬における進歩神経膠腫2。確かに、経口または静脈内配信化学療法は抗腫瘍効果を誘導するために不十分な低濃度でしばしば脳実質に到達または単にクロス BBTB3腫瘍細胞に到達することができません。いくつかの前臨床および臨床研究はない BBTB 浸透の問題を扱っているが、妨害、BBTB 一時的、例えば集束超音波4、5を使用して、その場で直接それを回避しようとしました。薬6の配信。しかし、これらの技術のどれもが必然的な腫瘍の拡大に対抗する再発できた。したがって、新規 antiglioma 治療法を開発する際、BBTB を介して拡散を考慮治療薬7の配信の成功の重要な側面の一つとして必要があります。
BBTB 内細胞の相互作用の非常に複雑な性質のため実験動物の生体内での研究はの明白な選択肢として、血液から脳への分子の通路を勉強するようです。しかし、高-規模体内メソッドは、比較的複雑な確立し、したがって、合理的なコストで合理的な時間で分子の高速スクリーニングを許可しません。さらに重要なは、動物実験では、i) リファインとして定義された 3 r 倫理的なガイドラインに従う、ii) 軽減、および、代替プロトコル (例えばで体外にシリコ メソッド) によって iii) 交換, 現在のコンテキストに関連。したがって、BBTB 体外を再作成、興味深く、魅力的な可能性として表示されますが、それはまた様々 な制限によって挑戦複雑なタスクを構成します。多くは、培養細胞や細胞株犬、ブタ、マウス、および人間の起源は、(ラーマンら8とヘルムズら9によって再検討されました) として公開されているこの複雑なコンパートメントを再作成を試みます。これらのモデル三次元マイクロ流体システム10、BBB オンチップ11,12多数の古典的な共培養に基づくバリエーションの挿入システムがあります。それにもかかわらず、現在のマイクロ流体チップ システムがないか急速なスループットの高い創薬検証研究13,14か脳腫瘍への薬物送達の研究と現在互換性のない、適切な。さらに、初代培養細胞、誘導性多能性幹細胞 (iPSC)、または商業のセルラインを使用して 155 のパブリッシュされたモデルのレビューすべての共培養挿入傾向を示した interstudy 不一致の測定および/または結論8。室間再現性のこの欠乏はことができる例えば細胞培養器、ii) サブカルチャーと使用量の増加に基底膜マトリックス蛋白質とオプションのコーティング i) 正規化培養条件と相関します。血清を含むメディア、セル行15、または iii の遺伝的・形態の変更の両方の主要なドライバー) グリアと皿に内皮のコンポーネントの正しい平衡を再現性をもって再現する難しさ。不死化細胞または商業セルの使用回線のみ一次電池を使用する同様のモデルと比較してプロパティのいくつかを欠いている BBB 生体外モデルを確立するがで記述されているメソッドを示すの適切な組み合わせが展示物を細胞に非常に匹敵する性能は、参照16,17の他のモデルの研究を発表しました。最終的には、治療化合物、BBTB を通じて脳腫瘍を対象と通路を勉強する堅牢かつ再現可能なモデルの欠如は、私たちはここで説明する方法を開発する動機。
目標は、前臨床動物モデルにおけるナノ粒子の in vivo のデリバリーを予測するモデルを使用することでした、ので最初マウスアストロと接触してマウスの血管内皮細胞を含む挿入を用いた BBTB モデルを検証しました。これに加えて、我々 はまた特定のひと細胞ラインを使用するモデルを最適化されています。一度安定化、細胞壁は膠芽腫の患者由来の球または商業神経膠腫細胞株と文化に転送されます。その後、ナノ粒子および腫瘍細胞の標的のトランスサイトーシスを共焦点顕微鏡による可視化し、時間をかけてサンプルを集めることによって定量化できます。重要なは、BBTB 模倣を使用して得られた結果確実に挙動を予測できるナノ粒子の体内、BBTB 模倣事前の使用をサポートの前臨床検証。

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bEND3</td><td>ATCC</td><td>CRL-2299</td><td>培養対象:DMEM(1g/Lグルコース)に10% FBS、5 mL L-グルタミン、5 mLペニシリン/ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>HIFko不死化マウスアストロサイトを</td><td>添加 Dr. Gabriele Bergers Labで単離</td><td>https://doi.org/10.1016/S1535-6108(03)00194-6</td><td>培養:BME-1に5%FBS、5mL 1 M HEPES、5 mL 100 mMピルビン酸ナトリウム、3 g D-グルコース、5 mLペニシリン/ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>HuAR2T</td>を<td>添加 Dr. Dagmar Wirth Lab</td><td>https://doi.org/10.1089/ten.tea.2009.0184</td> で分離 <td>培養:EBM-2 with SupplementMix</td></tr><tr><td>正常ヒト初代アストロサイト</td><td>ロンザ</td><td>CC-2565</td><td>培養:ABM with SingleQuots</td></tr><tr><td>Material and reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm x17 mm ディッシュ、Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清ピペット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170361</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐形滅菌ポリプロピレン遠心分離チューブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>ABM 基礎培地、500 mL</td><td>ロンザ</td><td>CC-3187</td><td>初代ヒトアストロサイト用。ABM+:サプリメントミックスからのすべての添加物が含まれています。ABM-:rhEGFおよびFBSを除くすべての添加剤</td></tr><tr><td>Accutase 細胞剥離液</td><td>コーニング</td><td>25-058-CI</td><td></td></tr><tr><td>AGM SingleQuots サプリメントと成長因子</td><td>ロンザ</td><td>CC-4123</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>GBM +と - 中</td></tr><tr><td>型 基礎 中型 イーグル</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>21010046</td><td>BME-1</td></tr><tr><td>コーニング コスターTC処理6ウェルプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3506</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell ポリエステル膜細胞培養インサート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3452&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td> は、<td>50 mL の BME-1 と滅菌フィルターに溶解してから、培地に添加します</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td>私たちの研究室で分離された患者由来球の培養に特有のもので、他の神経膠腫細胞株</td></tr><tr><td>EBM-2 増殖培地 SupplementMix</td><td>PromoCell</td><td>c-39216</td><td>EBM+:サプリメントミックスからのすべての添加物が含まれています。EBM-:VEGF-AおよびFBS</td></tr><tr><td>Endothelial Basal Medium 2(EBM-2)</td>を除くすべての添加剤<td>PromoCell</td><td>c-22211</td><td>EBM+:サプリメントミックスからのすべての添加剤が含まれています。EBM-:VEGF-AおよびFBS</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)を除くすべての添加剤、認定、熱不活性化、EU承認、南アメリカ原産</td>地<td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインナトリウム塩</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>F6377</td><td></td></tr>グ<tr><td>ライナーCELLSTAR 96ウェルプレート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>グライナー655090</td><td>ブラックポリスチレンウェル平底(マイクロクリア底付き)</td></tr><tr><td>メンゼル-GL&auml;ser 0.9 cm 丸型ホウケイ酸カバー スリップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>10313573</td><td></td></tr><tr><td>PBS 錠</td><td>メディカゴ</td><td>09-9400-100</td><td>dH2O 1 リットルあたり 1 錠</td></tr>、<tr><td>次に Poly-D-lysine 臭化水素酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GBM+中型</td>のための<td>組換えの人間のEGF</td><td>Peprotech</td><td>GMP100-15</td></tr><tr><td>組換えの人間のFGF-basic(154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>GBM+ 中</td></tr><tr><td><強>免疫蛍光 </強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td>用 <td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>24 mm x 60 mm 顕微鏡スライドカバーガラス</td><td>ORSAtec</td><td>0224601-D</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 および 594 二次抗体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>希釈率: 1/500</td></tr><tr><td>抗クローディン-5抗体</td><td>Abcam</td><td>ab15106</td><td>希釈率:1/150</td></tr><tr><td>抗GFAP抗体クローン GF5</td><td>Abcam</td><td>ab10062</td><td>希釈率:1/150</td></tr><tr><td>抗マウスCD31&nbsp;抗体 Clone MEC 13.3</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>希釈 1/800</td></tr><tr><td>抗 SV40 T-抗原抗体</td><td>Abcam</td><td>ab16879</td><td>希釈率 1/150</td></tr><tr><td>Anti-Zonula Occludens-1</td><td>Abcam</td><td>ab96587</td><td>希釈 1/200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>TOCRIS</td><td>5748</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount 水性封入剤&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red DND-99</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Animal procedures</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cm 湾曲解剖はさみ</td><td>World Precision Instruments</td><td>14394</td><td></td></tr><tr><td>BD Microlance 25 G 針</td><td>Becton Dickinson</td><td>300600</td><td></td></tr><tr><td>細い鉗子 (12.5 cm)</td><td>World Precision Instruments</td><td>503283</td><td>for tissue dissociation</td></tr><tr><td>Intramedic Polyethylene tubing PE20</td><td>Becton Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>Ketaminol vet 50 mg/mL</td><td>Intervet</td><td>Vnr511485</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Mains Powered microdrill</td><td>World Precision Instruments</td><td>503599</td><td></td></tr><tr><td>Menzel-Gl&auml;ser 0.5 cm 丸型ホウケイ酸 カバー スリップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>11888372</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bulldog clamp</td><td>World Precision Instruments</td><td>14119</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>ムステラ</td><td>滅菌単回投与バイアル 20 x 5 mL / 40 x 5 mL - 医療機器クラス</td><td></td></tr><tr><td>ロチェスター・オシュナー鉗子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501709</td><td></td></tr><tr><td>Rompun vet 20 mg/mL</td><td>インターベット</td><td>Vnr148999キシ</td><td>ラジン</td></tr><tr><td>固定装置アダプター</td><td>ワールド精密機器</td><td>502063</td><td></td></tr><tr><td>スギスポンジポイント</td><td>ケッテンバッハ</td><td>31603</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio Zoom.V16蛍光ステレオズーム顕微鏡&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar Omega マイクロプレートリーダー</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash 4.0 デジタル sCMOS カメラ</td><td>浜松ホトニクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Universal 320 卓上遠心分離機&nbsp;</td><td>ヘティッチ</td><td>猫。No. 1401</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS LSM 880 Airyscan共焦点顕微鏡</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

皿に血液脳腫瘍-障壁を使用して生体ペイロード配信で予測

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

生まれつき高選択的、血液脳関門 (BBB) 生理学的条件下で脳の恒常性に不可欠です。ただし、脳腫瘍の中では、BBB の分子選択性も盾腫瘍細胞末梢投与化学療法の配信をブロックすることによって。新薬 (含むナノ粒子) の開発を理想的に悪性脳腫瘍を対象には、薬剤のトランスサイトーシスと抗腫瘍効果を検討する臨床動物モデルが必要です。3 r の原則に従うために (絞り込む、軽減、および置換) 実験装置で実験動物の数を減らす、抗腫瘍剤の大規模なライブラリの高速スクリーニングを行うと、我々 は再現性のある生体外で人間開発と3 層培養内皮細胞、アストロ サイト、および神経膠芽腫患者由来の球を使用して血液脳腫瘍関門 (BBTB) のマウス似ています。高いスケーラビリティと再現性、商業細胞株あるいは不死化細胞実際 BBB に似た障壁の形成を許可するように合わせた条件で使用されています。ここで挿入に特定のセル密度でアストロ サイトと接触して内皮細胞を培養によって BBTB 模倣を取得するためのプロトコルについて述べる。例えば、この BBTB 模倣は、定量化と同じアッセイ内腫瘍細胞標的の評価に加えて、内皮細胞とアストロ サイトの障害物を通過するナノ粒子の共焦点レーザー顕微鏡では使用できます。さらに、前臨床動物モデルにおけるナノ粒子の行動を予測する得られたデータが使えることを紹介します。広い視野でこの in vitro モデル BBB を通じて新しい治療上の分子の通路の決定のための他の神経変性疾患に適応することができるまたは直接の有効性を評価する脳オルガノイドを補完します。薬。

マウス BBTB 模倣の共焦点レーザー顕微鏡は、bEND3 の表現とタイト結合蛋白質精巣毛細血管 1 (ZO-1) とクローディン 5 の細胞局在を示しています。血管内皮細胞とアストロ サイトの連絡先は明確に zo-1 とクローディン-5 bEND3 モノカルチャー (図 1) と比較して血管内皮細胞間の連絡先に移転を誘発しました。蛍光抗体染色膜の脳側に gfap アストロ サイトを使用して、それは観察し、星状膠細胞と終わり足の膜 (図 1E を介して血管内皮細胞に連絡することが可能).アストロ サイト内皮細胞の接触を促進し、細胞壁の締め付けを安定させるために知られているし、BBB19の低い透磁率の値に関連付けられています。締め切り 6.74 (± 3.01) × 10-6 cm/s に × 10-6 cm/s モノカルチャーの場合 (± 3.45) 27.63 から Na Fl のマウス BBTB 模倣の透磁率の相当な減少を見ました、それに従って時低酸素誘導と共培養要因ノックアウト (HIFko) アストロ (表 1)。不死化 HuAR2T は、浸透性の高い細胞障壁 (104.92 ± 27.1 x 10-6 cm s,表 1) を形成します。マウスのモデルと同様に、測定した Na フロリダ州に 47.4 (± 14.32) × 10-6 cm/s、すなわち BBTB の有意に低い透磁率 HuAR2T 細胞が人間のプライマリ アストロ サイト (表 1) との共培養いた。
マウスと人間の両方の BBTB 模倣膠芽腫の患者由来の球の存在は単独で血管内皮細胞・ グリア共培養に比べて透磁率の値 (表 1) のわずかな増加を誘導しました。いくつかのこのような現象が観察されるが、患者の神経膠腫全球モデル。これらの患者さん由来の細胞によって分泌される VEGF の可能性があります。
生体内で BBB に体外 BBTB mimics の透磁率の値を比較するには、は、ヌードマウスに移植頭蓋窓から Na フロリダのリアルタイムの拡散をイメージしました。蛍光実体顕微鏡を使用すると、メインの軟膜血管から派生する血管毛細血管から Na フロリダ拡散はプローブ (図 2) の全身投与中に、前後を記録しました。時間をかけて循環血液と脳皮質実質微分蛍光値の測定は、'の裸のマウスのおおよその透磁率の値を計算することができました BBB Na フロリダ (5.57 ± 2.19 x 10-6 cm/s, s表 1)。
脳側から血液側に化合物の通路の可視化のためのこの BBTB 模倣の使用方法を説明するために、ø 110 nm (NP110) と ø 350 nm (NP350) ナノ粒子ターゲット神経膠芽腫患者由来球のトランスサイトーシスを比較しました。結果体外体内トランスサイトーシスと比較されたし。提示の例では、ナノ粒子は腫瘍標的化ペプチド小屋20表面コーティングをされ、蛍光色素の可視化を容易にする (FITC) を読み込まれました。標識細胞リソソームの染料を使用して行い、BBTB の血液側に FITC ナノ粒子添加を模倣し、さまざまなレベル (例えば、血液側膜、脳側で共焦点顕微鏡を取得後、DAPI 24 h counterstained膠芽腫患者球) (図 3 a)。内皮細胞、アストロ サイト、および腫瘍細胞のリソソームと,、NP110 関連の蛍光信号。さらに、NP110s が検出された間血管内皮細胞とアストロ サイト、挿入 (図 3 a) の膜の細孔を通過します。
NP110s の通路の血液と脳の両方の側から採取した試料からの蛍光を測定することによって定量化を行った。これらの透磁率の値それらのナノ粒子の決定と比較した ø 350 nm (NP350)。結果を示します (図 3 b) BBTB mimics を横断する NP110 だけができた。NP350 は、これらのナノ粒子が低透磁率値につながった BBTB 模倣の血液側に残った。
体内のモデルに比べて BBTB mimics の関連性を強調するには、裸のマウス静脈内腫瘍標的化ペプチド小屋でコーティングし、検出のための赤色蛍光色素 (TRITC) を有する共役 NP110 または NP350 のナノ粒子を注入しました。いくつかの時点で採取された組織は、8 h 後に BBB 透過性ナノ粒子が循環にとどまったものがオフに体内循環された主に nonpermeable ながら、脳実質にバリウムしたことを明らかにしました。したがって、脳を収集し、ナノ粒子毎平方ミリメートル 8 h これらの数を定量化.試験管内の発見、NP110、しかしない NP350、に従って正常に脳実質 (図 3) にバリウムしました。脳でナノ粒子の位置の高倍率画像を示した NP110 が毛細血管外脳実質内に均一に分散され、正常に注入された膠芽腫細胞 (図 3 D) に所属します。同じ腫瘍部位 (小屋) をターゲットを展示にもかかわらず NP350 は脳実質に extravasate ことができませんでしたし、脳血管 (図 3E) の in vitro.を得られた結果と同様の内腔側内でのみ検出されました
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig1.jpg"> 図 1: 血液脳腫瘍の壁 (BBTB) モデルの説明です。(A) 異なる種類の細胞の場所の略図。(B) 図 6 ウェル プレート カバーと挿入'の脳側にアストロ サイトの播種技術挿入位置の s の膜。アストロ接着できるように 6 ウェル プレート配置の (C) 図。(D) タイト結合蛋白質精巣毛細血管-1 (ZO 1、上行、赤) とクローディン-5 (下段、緑) の蛍光顕微鏡写真。蛋白質の表現は、マウスの脳微小血管内皮細胞 (bEND3) BBTB 単独での血液側にモノカルチャー (左の列) と不死化 HIFko マウスアストロ (右列) と比較されます。細胞核は、DAPI (青) と counterstained です。(E) HIFko アストロ サイト、BBTB 脳側培養グリア線維性酸性蛋白 (GFAP、赤) を示す蛍光顕微鏡像。高倍率画像がアストロ サイトのプロセスを示しています、終わりフィート (矢印) 内皮細胞膜を通しての連絡孔 (右側のパネル)。HIFko アストロ サイトの id は、シミアン ウイルス 40 大きい T の抗原 (SV40 大きい T、緑) 細胞の不死化用の免疫蛍光染色により確認しました。血管内皮細胞は、GFAP も SV40 大きい T を表現し、したがって、部分的に観察できる透明な DAPI だけ陽性細胞 (破線) として膜の反対側から。細胞核は、DAPI (青) と counterstained です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig2.jpg"> 図 2:マウス BBB 透過性の生体ライブ決定します。(A) 埋込型の尾静脈カテーテルの準備。(1) ツールと機器が次: (、)、PE20 ポリエチレン管 (b) 2 つの 25 G 針 (c) ロチェスター オクスナー鉗子、および (d) 小さいブルドッグ クランプ。(2) A 25 G 針は、いくつかのねじりによって削除されるチューブ挿入鉗子 (3) を慎重に使用します。(4) チューブの反対側は、別の 25 G 針に接続されます。カテーテル注入と位置決めに関するガイダンスをマウスの尾静脈を介してナトリウム フルオレセイン ソリューションを注入する (B)。丸で囲んだ領域は、カテーテルを保護するシアノアクリ レート系接着剤のドロップを配置する場所の領域を示します。ブルドッグ クランプはカテーテルを処理するために使用、カテーテルを確保したらを削除します。フルオレセイン ナトリウムの透磁率の値を決定する代表的なイメージングと定量メソッドを (C)。フルオレセイン ナトリウム注入 (左列) 前、脳 (上部パネル、白い四角形) および血管領域 (底パネル、赤四角形) に置かれる利益 (率 ROI) の領域内蛍光/ブランクを測定します。(右列) [ナトリウム フルオレセイン液注入時に蛍光強度は BBB 透過性の計算を許可する両方の Roi で測定されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59384/59384fig3.jpg"> 図 3: BBB in vitro BBTB モデルによる in vivo でのナノ粒子の脳内トランスサイトーシスの予測します。(A) BBTB マウスモデルの示されたさまざまなレベルで得られた代表的な共焦点画像を BBTB アッセイのグラフィック表現。110 のナノ粒子径 (NP110) で nm と FITC (緑) に共役追加されたライソゾーム プローブ (LT-99、赤) で標識された BBTB 細胞の側血液に。 (1) 内皮細胞、内皮 (2) (白破線)、(3) アストロ サイトの膜の細孔を通してナノ粒子のトランスサイトーシスとグラフィックの識別 (4) 患者膠芽球と対応する共焦点顕微鏡 (右)。ナノ粒子 (矢印) のライソゾーム封入、BBTB の内皮細胞とアストロ サイトのレイヤーを通してアクティブ トランスサイトーシスを示唆しています。指定されたナノ粒子の透過 BBTB 体外の (B) の定量化 (n = 6)。脳組織で示されたナノ粒子密度の (C) 数量セクション、裸のマウスの尾静脈投与後 8 h (n = 3)。マウス脳切片で、ø の分布 110 nm ナノ粒子 (NP110、赤) を示す (D) 共焦点顕微鏡は、抗マウス CD31 抗体 (緑) が付いています。矢印は、ナノ粒子トランスサイトーシス (左側のパネル) を強調表示します。ナノ粒子を表面に提示、小屋を対象としたペプチドにより脳の腫瘍細胞 (腫瘍, 右のパネル) のまわりで集まります。脳 (脳) で観察される重要なホーミングはないです。(E) 共焦点顕微鏡は、抗マウス CD31 抗体 (緑) の付いたマウス脳切片の 350 nm のナノ粒子 (NP350、赤)、ø の分布を示します。矢印を指して血管内腔で保持された、おそらく NP110s 細胞核と比較して、大きな直径のため、BBB を通過することができませんでした NP350s、DAPI (青) と counterstained。P &lt; 0.01。P-値は両側検定、ノンパラ メトリック マン-ホイットニーの U 検定を算出しました。誤差範囲は、標準偏差を表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59384/59384fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>マウス BBTB ミミック</td>
			<td>bEND3</td>
			<td>bEND3 + HIFko</td>
			<td>bEND3 + GB</td>
			<td>bEND3 + HIFko として + GB</td>
			<td>生体内で</td>
		</tr>
<tr>
<td>透水性 (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.63</td>
			<td>締め切り 6.74</td>
			<td>26.8</td>
			<td>10.83</td>
			<td>5.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>3.01</td>
			<td>7.99</td>
			<td>2.65</td>
			<td>2.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>人間 BBTB ミミック</td>
			<td>HuAR2T</td>
			<td>HuAR2T + ハイアス</td>
			<td>HuAR2T + GB</td>
			<td>HuAR2T + ハイアス + GB</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>透水性 (10-6 cm/s)</td>
			<td>104.92</td>
			<td>47.4</td>
			<td>89.08</td>
			<td>48.24</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SD (10-6 cm/s)</td>
			<td>27.1</td>
			<td>14.32</td>
			<td>10.21</td>
			<td>13.07</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 値の in vitro 決定 (秒速センチメートル) のフルオレセイン (Na フロリダ州) 透水性指定された共培養システムおよび in vivo海技研ヌードマウスで。代表的な実験からのデータ (n = 3 のマウス)。

中枢神経系腫瘍にターゲティングは大きな課題です。ここで我々 はマウスやヒトの細胞を用いた血液脳腫瘍関門の in vitro における模倣を生産し、中枢神経系腫瘍生体内ターゲットの予測可能性の重要性を議論するためのプロトコルについて説明します。

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

中枢神経系の腫瘍を標的とする新しい薬剤や化合物を開発するためには、血液脳関門を通過するアクセシビリティと通過が非常に重要です。化合物の細胞毒性は、治療分子で細胞をインキュベートすることによって簡単に測定することができますが、それは実際に脳内の腫瘍部位への実際の送達について何も教えてくれません。この問題に対処するために、我々は、皿の上にインビトロで血液脳腫瘍関門を再現する方法を記述する次のプロトコルを開発しました。マウスまたはヒト起源の不死化細胞の使用は、このアッセイを非常に柔軟にします。また、容易に高い再現性と化合物の数十をスクリーニングするためにスケールアップすることができます。さらに、この方法は、前臨床モデルを進める前に、化合物の通過および標的化能力の定量および可視化の両方を可能にする。したがって、我々の方法は、事前に確立された細胞株を使用して動物モデルを部分的に置き換える。患者由来の脳腫瘍細胞を含めることは患者の異質性をアッセイし、血液脳関門を確立するために不死化細胞を使用することは結果の再現性を保証する。全体として、この血液脳関門モデルは、薬物拡散または薬物車両の送達をアッセイする本当に興味深いツールを提供します。このメソッドの視覚的なデモンストレーションは、挿入の反対側にあるセルのシード処理には、同様の設定を使用して他のプロトコルではあまり説明されない操作が必要であるため、非常に重要です。例えば、挿入物が逆さまに配置されたときにアストロサイトの接着を得ることは、視覚的表現から非常に利点を得る。滅菌細胞培養フードの下で、培養したアストロサイトを5ミリリットルの無菌PBSで慎重に洗浄します。真空ポンプを使用してPBSを静かに廃棄し、2ミリリットルの細胞解離試薬を5分間加え、細胞を取り外します。次いで、10ミリリットルの無菌完全なアストロサイト細胞培養液を容器に加え、細胞解離試薬の活性を阻害する。滅菌血清学的ピペットを使用して、剥離した細胞を容器から滅菌15ミリリットルチューブに移します。室温で3分間250回gで遠心分離機。その間、挿入物を設定します。滅菌鉗子を使用して、無菌の6ウェルプレートの蓋の上に脳側を持つインサートを配置します。遠心分離が完了したら、慎重に細胞懸濁液から上澄み液を捨て、管の壁のペレットを5回まで軽くピペット化してABMプラスの1ミリリットルでアストロサイトペレットを再懸濁する。次に、細胞を数え、細胞懸濁液密度を挿入あたり400マイクロリットルのABMプラスで150,000細胞に調整した。細胞懸濁液をインサートの膜の脳側の真ん中に入れ、滅菌ピペットチップを用いて慎重に毛細血管力で広げます。インサートの脳側を上に置いて、6ウェルプレートをインサートの上に戻します。プレートとインサートを、脳側を上にして、摂氏37度のインキュベーターと5%の二酸化炭素に入れ、細胞接着を可能にします。この後、6ウェルプレートを通常の位置に戻し、インサートを血液側を上に戻します。中型を追加し、テキストプロトコルで概説されているようにインキュベーションを続行します。滅菌細胞培養フードの下で、培養した内皮細胞を5ミリリットルの無菌PBSで慎重に洗浄する。真空ポンプを使用してPBSを静かに廃棄し、2ミリリットルの細胞解離試薬を5分間加え、細胞を取り外します。次いで、10ミリリットルの無菌完全な内皮細胞培養液を容器に加え、細胞解離試薬の活性を阻害する。滅菌血清学的ピペットを使用して、剥離した細胞を容器から滅菌15ミリリットルチューブに移します。室温で3分間250回gで遠心分離機。この後、上清を捨て、チューブの壁の細胞懸濁液を5回までゆっくりとピペット化して、EBMプラスの1ミリリットルで内皮細胞ペレットを再懸濁する。細胞を数え、細胞懸濁密度を2.5ミリリットルの内皮細胞培養で200,000細胞に調整し、挿入あたり血清および血管内皮増殖因子-Aを欠いた。挿入物を含むプレートを取得します。慎重に血液側から培地を捨て、内皮細胞懸濁液の2.5ミリリットルに置き換えます。次いで、プレートをインキュベーターに戻し、内皮細胞が膜に付着できるように一晩放置する。翌日、各ウェルに事前に温めたABM-マイナスの3ミリリットルを移すことによって、6ウェルプレートを準備します。滅菌鉗子を使用して、インサートを取り扱って血液側から内皮完全培地を慎重に廃棄し、ABM-マイナスを含む新しいプレートに挿入物を入れる。その後、EBM-マイナスの 2.5 ミリリットルを追加します。インキュベーターに挿入物を残し、物理的な乱れまたは温度変化を最小限に抑えて5日間放置します。転送日に、媒体を交換してください。免疫蛍光イメージングの場合、ポリD-リジンの2ミリリットルを含む6ウェルプレートの各ウェルに最大4つの丸い無菌ホウケイ酸カバーリップを配置します。室温で30分間インキュベートします。一方、滅菌血清学的ピペットを使用して、細胞培養容器から15ミリリットルの滅菌チューブに腫瘍球を慎重に移す。腫瘍球を250回gで3分間遠心分離する。上清を捨て、球体を1ミリリットルのGBMマイナスで静かに再中断します。セルを数え、セル密度を約 10,000 の球または 100,000 細胞に調整します( GBM-マイナスのミリリットルあたり)。次に、ポリD-リジンをウェルから捨て、滅菌PBSでウェルを3回リンスします。各プレートのウェルに3ミリリットルの腫瘍スフェロイド懸濁液を播種し、BBTBを模倣してインサートを腫瘍細胞懸濁液に移す。摂氏37度で一晩、5%の二酸化炭素でインキュベートし、アッセイの血液および脳腫瘍側が平衡状態に達することを可能にする。翌日、血液側の培地を、目的の分子、薬物、またはナノ粒子で補ったEBM-マイナスに置き換えます。前に説明したように直接定量するために、時間をかけてサンプルを収集します。まず、BBTBの血液と脳側の両方から培地の100マイクロリットルを収集し、その後の蛍光測定のためにそれぞれ別の平底、黒、96ウェルプレートに移します。次に、フルオレセインナトリウムの50マイクロモル溶液をEBM-マイナスで調製し、1ウェルあたり2.5ミリリットルを調製することを確認します。この溶液を摂氏37度に予め温め、このフッ素溶液を含む培地で挿入物の血液側から培地を交換する。メディアを交換するとすぐにタイマーを開始します。5分、30分、60分、120分のインサートの血液と脳の両方の側から100マイクロリットルのメディアを慎重に収集します。各サンプルを適切な黒、96ウェルプレートの別々のウェルに移します。プレートリーダーを使用して、収集したサンプルから蛍光を定量化します。まず、プリ温め培地で適当な働き濃度にリソソーム蛍光色素を希釈する。これを細胞に加え、摂氏37度で5%の二酸化炭素を45分間インキュベートします。次に、氷冷PBSで細胞を3回リンスします。PBSを捨て、氷冷4%パラホルムアルデヒドをウェルに3ミリリットル、インサートに2.5ミリリットルを加えます。氷の上で10分間インキュベートします。この後、パラホルムアルデヒドを捨て、PBSで細胞を3回リンスします。PBSを除去し、蒸留水中の1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度でDAPI溶液を用いて細胞核に対抗する。室温で7分間インキュベートします。その後、DAPIを取り出し、蒸留水で3回膜を洗浄する。膜を丁寧に切り取り、蒸留水を取り出し、ガラス顕微鏡スライド上の取り付け媒体のドロップに置きます。膜の反対側に取り付け媒体の別のドロップを追加し、慎重にホウケイ酸カバーガラスでそれをカバーしています。本研究では、内皮細胞をアストロサイトと共培養し、インビトロセットアップで血液脳腫瘍バリア様界面を形成した。マウスBBTB模倣体の共焦点イメージングは、bEND3におけるゾヌラオクルデン−1およびクローディン-5の緊密な接合タンパク質の発現および細胞局在化を示す。内皮細胞とアストロサイトとの接触は、bEND3単一培養と比較して、これらの2つのタンパク質を内皮細胞間接触に移すことを明確に誘導する。免疫蛍光染色を用いて、膜の脳側のGFAP発現アストロサイトを可視化し、膜を通して内皮細胞に接触する天体の過程およびエンドフィートを観察・研究することが可能である。インビトロBBTBの擬似物の透過性値をインビトロ血液脳関門と比較するために、フルオレセインナトリウムのリアルタイム拡散はヌードマウスに埋め込まれた頭蓋窓を通して画像化される。蛍光ステレオ顕微鏡を用いて、主な血管から生じた血管の毛細血管からの蛍光ナトリウム拡散は、プローブの前、中、および全身注射後に記録される。患者由来神経膠芽腫球を標的とするナノ粒子の経細胞化は、このBBTB模倣体を使用して血液側から脳側への化合物の通過を視覚化する方法を示すために比較される。NP110関連蛍光シグナルは、内皮細胞、アストロサイト、および腫瘍細胞におけるリソソームと共局化する。さらに、NP110sは、内皮細胞とアストロサイトの間で検出され、挿入物の膜細孔を通過する。NP110sの通過は、血液側と脳側の両方から採取したサンプルから蛍光を測定することにより定量化され、これらの値は350ナノメートルのナノ粒子を決定したものと比較されます。見ることができるように、NP110sだけがBBTBの模倣体を横断することができ、NP350は血液側に残り、これらのナノ粒子の透過率値が低くなる。インサートを注意して取り扱い、膜に直接接触することなくインサートの脳側にアストロサイト細胞懸濁液を慎重に広げる。膜の損傷は漏れをもたらす。この方法は、末梢投与されたペイロードの脳送達の質問に答えるために適合させることができる。より大きな膜孔を持つ異なるインサートを使用することにより、細胞の外挿を研究することも可能です。この技術は、他の細胞の障壁を模倣するために異なる細胞タイプを使用して変更することができます。また、抗がん剤の検証に使用される実験動物の数を減らすことを目指して、より責任ある倫理的な研究への道を開きます。パラホルムアルデヒドは非常に有毒な化学物質であり、それに応じて処理する必要がありますので、覚えておいてください。また、鋭いメスを使用して、挿入物から膜を抽出する際には注意してください。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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ヒト血液脳関門をモデル化した三重培養細胞系

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同所性小児脳腫瘍モデルの開発には、がん細胞を正確に移植するための定位固定装置を使用するという、細心の注意を払った精度が必要です。ここで紹介する方法論は、脳腫瘍細胞の調製、頭蓋内注射の実施、および脳腫瘍の生着を評価するための術後モニタリングシステムの実装に関連するステップを概説しています。...

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皿に血液脳腫瘍-障壁を使用して生体ペイロード配信で予測

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